Name: 다발성 골수종의 골수 얼룩의 계내 형광 혼성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 학습하세요 다발성 골수종 진단을 위한 골수 얼룩 FISH 기법으로, 항CD138 자기 비드 분류와 형광 현미경 관찰을 통해 클론 골수 세포를 정확히 식별하고 유전학적 위험도를 평가하는 방법입니다.

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이 프로젝트는 WNLO 2018WNLOKF023의 혁신 기금에 의해 지원되었습니다.

이 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었으며 우한 대학의 중난 병원 윤리위원회 (제 2019065 호)의 승인을 받았습니다. 표본은 중국 우한대학교 중난병원의 혈액학과에 있는 MM 환자로부터 채취하였다.
1. BM 도말의 제조
<ol><li>BM 용액의 첫 번째 0.2 mL를 깨끗한 일회용 유리 슬라이드 위에 놓습니다.</li>
	<li>BM을 신속하게 제거하여 날카로운 꼬리로 BM 얼룩을 균일 한 두께로 퍼뜨립니다. 그런 다음 자연적으로 건조시킵니다.</li>
	<li>BM 필름을 실온에서 약 10초 동안 Wright-Giemsa 용액 1mL로 덮으십시오.</li>
	<li>1 mL의 인산염 완충액을 슬라이드에 첨가한다. 참고: 염료 용액이 건조하거나 슬라이드에서 흘러나오지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>염료 용액을 부드럽게 혼합하고 실온에서 15 분 동안 유지하십시오.</li>
	<li>슬라이드를 깨끗한 물로 헹구고 실온에서 공기 중에서 건조시킵니다.</li>
	<li>순방향 광 현미경을 사용하여 악성 PC를 탐지합니다. PC는 잘 분산되어 있어야합니다.</li>
</ol>2. BM 얼룩의 물고기 전처리
<ol><li>하이브리드화 된 영역을 10 분 동안 고정 용액으로 덮어 PC를 변색하고 수정하십시오.<ol>
<li>신선한 고정 용액을 준비하려면 메탄올과 빙초산을 3:1의 부피비로 혼합하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>슬라이드를 탈이온수(dH2O)로 헹구고 실온에서 공기 중에서 건조시킵니다.</li>
	<li>2x SSC 버퍼가 들어있는 항아리를 수조에서 56°C로 예열한다. 사용하기 전에 버퍼를 20x SSC로 갓 희석하십시오.<ol>
<li>20x SSC를 준비하려면 염화나트륨 176g과 시트르산나트륨 88g을 dH2O 800mL와 완전히 섞는다. pH를 측정하고 pH 5.3 ± 0.2로 조정한다. 그런 다음 dH2O를 추가하여 최종 부피를 1L로 가져옵니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제조된 BM 얼룩을 예열된 2x SSC 완충액에서 10분 동안 세척하고, 이를 실온에서 탈이온수에 침지시켰다.</li>
	<li>도말기를 에탄올 구배(각각 1분 동안 70%, 85%, 및 100% 에탄올)로 탈수시킨다. 도말기를 10 분 동안 공기 건조시킵니다.</li>
</ol>3. BM 얼룩 물고기와 세척
참고: 모든 단계는 형광 담금질을 방지하기 위해 어두운 방에서 수행되었다.
<ol><li>염색체 17 (CEP17) 프로브 혼합물의 TP53 / 센트로미어를 혼성화 영역에 추가하고 커버 슬립으로 덮으십시오. 미세한 핀셋으로 부드럽게 눌러 아래에서 기포를 제거하십시오.</li>
	<li>커버슬립의 모든면을 고무 시멘트로 밀봉하여 견고성을 유지하십시오.</li>
	<li>고무 시멘트를 응고 한 후 슬라이드를 자동 FISH 기계에 놓습니다. 78°C에서 5분 동안 변성을 수행하고, 이어서 37°C에서 하룻밤 동안 혼성화시켰다.</li>
	<li>FISH 기계에서 슬라이드를 가져옵니다. 미세한 뾰족한 핀셋을 사용하여 고무 시멘트를 부드럽게 제거하십시오.</li>
	<li>슬라이드를 실온에서 2x SSC에 약 1 또는 2분 동안 담그고 커버슬립을 닦아냅니다.</li>
	<li>슬라이드를 68°C에서 2분 동안 수조에서 0.4x 예열된 0.4x SSC/0.3% NP-40 완충액으로 세척한다.<ol>
<li>20x SSC(pH 5.3) 20mL와 950mL의 dH2O를 완전히 혼합하여 0.4x SSC/0.3% NP-40 용액을 준비합니다. 그런 다음 NP-40 3 mL를 넣고 완전히 용해 될 때까지 완전히 혼합하십시오. pH를 측정하고 NaOH로 7.0-7.5로 조정한다. 그런 다음 dH2O를 첨가하여 전체 용액의 최종 부피를 1 L로 가져옵니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>슬라이드를 2x SSC로 37°C 수조에서 1분 동안 세척한다. 어둠 속에서 똑바로 세워 10 분 동안 완전히 말리십시오.</li>
	<li>10μL의 DAPI를 혼성화 영역에 추가하고 커버슬립으로 덮으십시오.</li>
</ol>4. 물고기 분석 및 이미징
<ol><li>형광 현미경 상에서 적합한 필터 세트를 사용하여 혼성화된 슬라이드를 본다.</li>
	<li>단색 청색 형광단 광학 필터를 사용하여 세포 핵의 형광 강도를 관찰하십시오. DAPI 필터 세트에서 세포 핵 이미지를 촬영합니다.</li>
	<li>염색체 센트로미어 프로브를 사용하여 세포에 얼마나 많은 염색체가 포함되어 있는지 보여줍니다. CEP17에 녹색 형광을 부착하십시오. 스펙트럼 녹색 형광단 광학 필터를 사용하여 CEP17의 위치를 관찰하십시오. CEP17 신호 이미지를 녹색 필터 세트 아래에서 가져옵니다.</li>
	<li>TP53 유전자를 주황색 형광으로 표지하십시오. 스펙트럼 오렌지 형광단 광학 필터를 사용하여 TP53을 관찰하십시오. 이 세트에서 TP53 신호 이미지를 가져옵니다.</li>
	<li>이 세 이미지를 병합하고 숫자 이상이 있는지 검사하십시오. 참고: 정상 위상 세포에서는 청색 형광이 있는 핵 내부에서 두 개의 주황색과 두 개의 녹색 신호가 관찰되며, 이는 한 쌍의 정상 염색체 17을 나타냅니다(그림 1).</li>
</ol>

<ol><li>Sonneveld, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+multiple+myeloma+with+high-risk+cytogenetics%3A+a+consensus+of+the+International+Myeloma+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group.</a> Blood. 127, 2955-2962 (2016).</li>
<li>Radbruch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competence+and+competition%3A+the+challenge+of+becoming+a+long-lived+plasma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell.</a> Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).</li>
<li>Lai, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+cytogenetics+in+multiple+myeloma%3A+a+study+of+151+patients+including+117+patients+at+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis.</a> Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).</li>
<li>Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+increasing+evidence+for+a+multistep+transformation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process.</a> Blood. 91, 3-21 (1998).</li>
<li>Munsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+recommendations+for+risk+stratification+in+multiple+myeloma%3A+report+of+the+International+Myeloma+Workshop+Consensus+Panel+2%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2.</a> Blood. 117, 4696-4700 (2011).</li>
<li>Gole, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cIg-FISH+On+Patients+with+Multiple+Myeloma+-+A+Modified+and+Simple+Technique+Easily+Incorporated+Into+Routine+Clinical+Service%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service.</a> Blood. 120, 4792-4792 (2012).</li>
<li>Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematology%2C+ICSH+guidelines+for+the+standardization+of+bone+marrow+specimens+and+reports%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Laboratory+Hematology%22%5BJournal%5D)">Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).</li>
<li>Štifter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+evaluation+of+bone+marrow+aspirate+and+biopsy+is+superior+in+the+prognosis+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma.</a> Diagnostic Pathology. 5, 30(2010).</li>
<li>Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+on+direct+hematological+bone+marrow+smears%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears.</a> Pathology. 27, 86-90 (1995).</li>
<li>Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+morphology%2C+esterase+cytochemistry%2C+and+interphase+cytogenetics+of+peripheral+blood+and+bone+marrow+smears%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).</li>
<li>Dunning, K., Safo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultimate+Wright-Giemsa+stain%3A+60+years+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making.</a> Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).</li>
<li>Woronzoff-Dashkoff, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wright-giemsa+stain.+Secrets+revealed%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The wright-giemsa stain. Secrets revealed.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).</li>
<li>McPherson, R. A., Pincus, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Henry%27s+Clinical+diagnosis+and+Management+by+Laboratory+Methods+E-book%5BTitle%5D)+AND+%22Elsevier+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2017).</li>
<li>Ross, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+the+European+Myeloma+Network+on+interphase+FISH+in+multiple+myeloma+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders.</a> Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

MM에서 유전 적 위험 계층화에 FISH를 적용하는 것이 필수적입니다. FISH 보고의 중요한 부분은 모든 유핵세포가 아니라, 항-CD138 마그네틱 비드로 분류하거나 세포질 면역글로불린 경쇄 κ 또는 λ로 마킹함으로써 특이적으로 정제되거나 확인된 클론 PC이다. PC 분류 후 상간 FISH 또는 cIg-FISH는 BM에서 PC의 상대적으로 낮은 비율로 인해 MM의 진단에 유의한 것으로 밝혀졌다. 그러나 이러한 방법에는 복잡한 공정, 높은 시편 요구 사항 및 높은 실험 비용을 포함한 몇 가지 단점이 있습니다. 오십 대의 PC는 현미경 스테이지 Vernier 캘리퍼로 신속하게 찾을 수 있습니다. BM 도말은 항응고제 BM 표본보다 훨씬 쉽게 얻을 수 있는데, 항응고된 BM을 얻기 위해서는 핵을 얻기 위한 복잡한 절차가 필요하기 때문이다. 따라서, 우리는 MM 세포의 검출을 위한 BM 도말 FISH에 대한 설득력 있는 방법을 확립하였다.
첫째, BM 얼룩은 숙련 된 형태 학적 분석가...

다발성 골수종 (MM)은 생물학적 이질성이 강하고 임상 효능이 큰 개인차를 가진 악성 혈장 세포 (PC) 질환으로 생존 기간은 수개월에서 수십 년 사이입니다. 세포유전학적 특성은 MM의 중요한 예후 지표이다. 위험 계층화 시스템과 유전 적 특성에 기반한 개별화 된 치료법은 MM1에 대한 임상 연구에 대한 강렬한 관심의 주제가되었습니다. 골수 (BM)의 형광 계내 혼성화 (FISH) 패널에서 테스트 된 PC의 수차에는 del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t (4;14) (IGH / FGFR3), t (11;14) (IGH / MYEOV), t (14;16) (IGH / MAF), t (14 : 20) (IGH / MAFB), 1q21 (CKS1B) 이득 / 증폭 및 1p (CDKN2C) 결실이 포함됩니다.
표준 형이상상 세포유전학은 MM 환자의 초기 평가에 포함되어야 한다. 기존의 G 밴드 핵형이 전체 염색체 분석의 이점을 제공하지만,이 방법의 낮은 수율은 많은 위음성 결과를 초래합니다2. 전통적으로, PC는 B 림프구 분화의 최종 단계 생성물이기 때문에 분할이 불가능한 것으로 간주되어 왔다. 이로 인해 분할 이미지를 얻기가 어렵습니다. 장기 배양(6일)을 통한 MM에서의 개선된 세포유전학적 분석 및 사이토카인에 의한 배양의 자극은 새로 진단된 MM 환자에서 세포유전학적 이상을 확인하기 위한 유망한 방법일 수 있다3. 그러나 배양 시간이 6일로 연장되었을 때조차도, 세포유전학적 이상은 MM 환자의 30%-50%에서 정확하게 보고되었다4. 또한, MM은 그의 예후 이질성을 반영하는 복잡한 세포유전학적 수차를 특징으로 한다. 그러나 전통적인 염색체 밴딩 기술의 해상도가 낮기 때문에 MM에서 염색체 이상을 쉽게 탐지하지 못할 수 있습니다.
세포질 면역글로불린 경쇄 κ/λ로 CD138 양성 자기 비드 기반 PC 분류 또는 마킹 후, 바람직하게는 상간 FISH는 MM5,6의 분석에 없어서는 안 될 필수 요소이다. CD138 양성 선별 샘플은 종양 세포의 최적화된 수율을 위해 강력하게 권장된다. 그러나, 세포유전학적 수차의 정확한 정량화는 PC 분류를 위해 적어도 4mL의 항응고된 BM을 필요로 한다. 또한, CD138 면역자기 비드 분류와 FISH 또는 세포질 κ/λ 경쇄 면역글로불린과 FISH 테스트(cIg-FISH)의 조합은 수많은 실험 비용을 증가시키고 시간이 많이 걸립니다.
보통, PC 비율은 염색된 BM 도말 또는 BM 생검 섹션7,8의 형태학적 검사로부터 먼저 평가된다. 최고 품질의 BM 표본 (첫 번째 골수 흡인물 샘플)은 형태 학적 테스트에 사용되는 반면, FISH 또는 기타 검출을 위해 보내진 샘플은 종종 말초 혈액으로 희석 비율이 높은 보조 흡인물 샘플입니다.
1990년대 초, 여러 연구에 따르면 BM 도말들은 간질성 FISH 검사에 직접 사용될 수 있으며, 이는 신뢰할 수 있고 반복 가능한 방법인 것으로 입증되었습니다9. 말초 혈액 및 BM 도말의 FISH와 결합 된 세포 형태학 및 에스테라제 세포 화학에 기초한 우아한 연구는 과립 및 림프구성 백혈병 환자의 염색체 이상을 밝히는 데 큰 임상 적 중요성을 확인했습니다10.
본원에서, 우리는 MM 환자에서 상간 FISH 검출의 성공을 개선하기 위한 신규한 방법을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>자동 FISH 기계</td><td>Leica&nbsp; Corporation</td><td>S500-24</td><td>FINAL Assy Thermobrite 240V</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>06J49-001</td><td>DAPI 카운터스테인</td></tr><tr><td>FISH 분석 소프트웨어</td><td>IMSTAR&nbsp; 법인:</td><td>IMSTAR</td><td>, FISH, 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>, FISH 프로브,</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>05N56-020</td><td>Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH 프로브 키트</td></tr><tr><td>고정 부피 피펫</td><td>Eppendorf China Ltd.</td><td></td><td>M33768H 10&nbsp; 마이크로리터</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX53</td><td>전방 형광 현미경</td></tr><tr><td>핵형 분석 소프트웨어</td><td>IMSTAR&nbsp; 주식회사</td><td>IMSTAR</td><td>핵형 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Olympus&nbsp; 주식회사</td><td>BX41</td><td>전방 광 현미경</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>07J05-001</td><td>NP-40</td></tr><tr><td>플라스틱 염색 염색 랙</td><td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td><td>RSJ-501</td><td>&nbsp; 24 슬라이드</td></tr><tr><td>플라스틱 염색 염색 탱크</td><td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td><td>RSJ-516</td><td>&nbsp; 24 슬라이드</td></tr><tr><td>고무 시멘트</td><td>Marabu&nbsp; GmbH & Co. KG</td><td>FixoGum&nbsp;</td><td>고무 시멘트</td></tr><tr><td>SSC</td><td>애보트 분자 Inc.</td><td>02J10-032</td><td>20&times; SSC</td></tr><tr><td>수조</td><td>Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.</td><td>DK-8D</td><td>다중 온도 수조</td></tr></tbody></table>

다발성 골수종의 골수 얼룩의 계내 형광 혼성화

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

형광 계내 혼성화 (FISH) 검출은 가장 흔한 혈액학적 악성 종양 중 하나인 다발성 골수종 (MM)의 유전 적 위험 계층화에 없어서는 안될 방법입니다. MM의 식별 특성은 골수에 악성 혈장 세포가 축적되어 있다는 것이다. MM에 대한 FISH 보고서는 항-CD138 자기 비드로 분류하거나 세포질 면역 글로불린 경쇄 κ 또는 λ로 마킹함으로써 모든 유핵 세포보다는 정제되거나 확인된 클론 혈장 세포에 주로 초점을 맞춥니다. 골수 간 상 핵은 일반적으로 신선한 골수 세포로부터 얻어집니다. 그러나, 혈장 세포 표본의 만족스러운 농축은 다량의 신선한 헤파린 항응고 골수를 필요로 하며, 이는 어려운 골수 추출 또는 골수 건조 탭의 경우에는 얻을 수 없다. 여기에서, 우리는 염색 또는 염색되지 않은 골수 도말에 대한 FISH 검출의 성공을 개선하기 위한 새로운 방법을 확립한다. 골수 얼룩은 항응고 된 골수 표본보다 쉽게 얻을 수 있습니다.

새로 진단된 MM 환자의 초기 형태학적 평가에서, BM 도말에서 PC의 15%는 정상 PC보다 더 많은 양의 세포질과 함께 더 크고 어두운 핵을 갖는 것으로 밝혀졌다(도 2A). 면역표현형 기술에 의해 검출된 헤파린 항응고된 BM의 첫 번째 튜브는 모노클로날 비정상적 PC의 2.3%만을 밝혀냈다. FISH 또는 cIg-FISH 기술과 조합된 CD138 면역자기 비드 분류는 정확한 FISH 결과를 얻기 위해 필수적이다. 그러나, 흡기 BM은 드라이 탭인 경우에 제한된다. BM 도말은 상간 FISH를 시험하기 위해 사용되었다. BM 필름에서 대표적인 비뚤어진 PC를 형광 현미경 스테이지 버니어 캘리퍼에 의해 국소화하였다(도 2B). FISH는 TP53 및 CEP17 에 대해 시험하기 위해 BM 도말에 적용되었다. FISH 결과는 하나의 상간 PC 핵에서 네 개의 주황색과 네 개의 녹색 신호를 보여 주었고 (<s...

여기에서, 우리는 다발성 골수종 환자로부터의 골수 도말에 대한 계내 혼성화 검출에서 위상간 형광의 성공을 개선하기 위한 프로토콜을 제시한다.

Fluorescence in situ hybridization (FISH) detection is an indispensable method in genetic risk stratification in multiple myeloma (MM), which is one of ...

다발성 골수종에서 유전 적 위험 계층화에 FISH라고 불리는 Situ Hybridization의 형광 적용은 필수적입니다. FISH 보고서의 중요한 부분은 모든 유핵세포가 아니라 항-CD138 마그네틱 비드로 분류하거나 세포질 카파 또는 람다 경쇄 면역글로불린으로 마킹하여 cIg FISH라고 불리는 FISH 테스트를 통해 특이적으로 정제되거나 확인된 클론 혈장 세포입니다. 혈장 세포 분류 후 상간 FISH 또는 cIg FISH는 골수에서 혈장 세포의 상대적으로 낮은 비율로 인해 다발성 골수종의 진단에 중요한 것으로 밝혀졌습니다.그러나 이러한 방법에는 복잡한 공정, 높은 시편 요구 및 높은 실험 비용을 포함한 몇 가지 단점이 있습니다. 혈장 세포는 골수 얼룩에 신속하게 위치 할 수 있습니다. 이를 바탕으로 우리는 다발성 골수종 세포의 검출을 위해 골수 도말 FISH를 사용합니다.이 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었으며 우한 대학의 중난 병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 표본은 중국 우한 대학의 중난 병원 혈액학과의 다발성 골수종 환자로부터 수집되었다. 첫 번째 0.2 밀리리터의 골수 용액을 깨끗한 일회용 유리 슬라이드에 놓고 골수를 신속하게 제거하여 골수 얼룩을 균일 한 두께와 날카로운 꼬리로 퍼뜨린 다음 자연스럽게 말립니다.골수 필름을 실온에서 약 10 초 동안 Wright-Giemsa 용액 1 밀리리터로 덮으십시오. 한 밀리리터의 인산염 완충액을 슬라이드에 첨가하면, 염료 용액이 건조되거나 슬라이드에서 흘러내리는 것을 방지하기 위해 주의가 요구되었다. 염료 용액을 부드럽게 혼합하고 실온에서 15 분 동안 유지하십시오.슬라이드를 깨끗한 물로 헹구고 실온에서 공기 중에서 건조시킵니다. 순방향 광 현미경을 사용하여 악성 혈장 세포를 감지하면 혈장 세포가 잘 분산되어야합니다. 이제 우리가 현장에서 보는 것은 상당히 분산 된 혈장 세포입니다.이것은 전형적인 이중 핵 혈장 세포입니다. 혼성화 된 영역을 10 분 동안 고정 용액으로 덮어 혈장 세포를 변색시키고 고정시킵니다. 슬라이드를 탈이온수로 헹구고 실온에서 공기 중에서 건조시킵니다.두 번 SSC 버퍼가 들어있는 항아리를 수조에서 섭씨 56도까지 예열하십시오. 제조된 골수 도말기를 예열된 SSC 완충액에서 두 번 10분 동안 세척한 다음, 실온에서 탈이온수에 침지시킨다. 에탄올 구배에 도말기를 각각 70%85%와 100%에탄올로 1분 동안 탈수시킨다.얼룩을 공기 중에 10 분 동안 말립니다. 먼저 17번 염색체 프로브 혼합물의 센트로미어에 TP53을 하이브리디제이션 영역에 추가하고 커버 슬립 프레스로 미세한 뾰족한 핀셋으로 부드럽게 덮어 아래에서 기포를 제거합니다. 커버 슬립의 모든면을 고무 시멘트로 밀봉하여 우수한 견고성을 보장합니다.고무 시멘트를 응고시킨 후 슬라이드를 자동 FISH 기계에 올려 놓고 5분 동안 섭씨 78도에서 변성을 수행한 후 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 혼성화를 수행하였다. FISH 기계에서 슬라이드를 가져옵니다. 미세한 뾰족한 핀셋을 사용하여 고무 시멘트를 부드럽게 제거하십시오.슬라이드를 실온에서 SSC에 두 번 담그고 약 한 분 또는 두 분 동안 커버 슬립을 세척합니다. 슬라이드를 섭씨 68도 예열 완충액으로 수조에서 두 분 동안 세척하십시오. 슬라이드를 섭씨 37도 수조에서 두 번 SSC로 한 분 동안 씻으십시오.어둠 속에서 바로 설치하여 혼성화 된 부위에 10 마이크로 리터의 DAPI에서 10 분 동안 완전히 건조시키고 커버 슬립으로 덮으십시오. 형광 현미경 상에 적합한 필터 세트를 사용하여 혼성화 슬라이드를 보고, 단색 청색 형광단 광학 필터를 사용하여 세포 핵의 형광 강도를 관찰한다. DAPI 필터 세트에서 세포 핵 이미지를 촬영합니다.CEP17은 녹색 형광으로 표지되었다. 스펙트럼 녹색 형광단 광학 필터를 사용하여 CEP17의 위치를 관찰하십시오. CEP17 신호 이미지를 녹색 필터 세트에서 가져옵니다.TP53 유전자를 주황색 형광으로 표지하였다. 스펙트럼 오렌지 형광단 광학 필터를 사용하여 TP53을 관찰하고, TP53 신호 이미지를 세트 아래에서 촬영하고,이 세 이미지를 전체로 병합하고 수치 이상을 검사하십시오. 정상 간상 세포에서 두 개의 주황색 및 두 개의 녹색 신호가 핵 내부에서 관찰되고 청색 형광은 한 쌍의 정상 염색체 17을 나타낸다.결과는 다발성 골수종 환자에서 골수의 형태학 및 유전학을 보여주었다. 그림 A는 골수 도말에서 혈장 세포의 15 %가 정상보다 많은 양의 세포질과 함께 더 크고 어둡고 핵을 갖는 것으로 나타났습니다. 도 B는 골수 번짐에서 유핵혈장 세포를 대표하여 대표적인 그레이스케일 이미지를 나타내었다.그림 C는 혈장 세포의 한 상간 핵에서 네 개의 주황색과 네 개의 녹색 신호를 보여 주었으며, 이는 염색체 17의 네 사본이 핵에 국한되어 있음을 시사한다. 도 D는 이 환자의 비정상적인 염색체 핵조영이 하나의 핵에서 두 쌍의 염색체 17을 확인한 것을 보여주었다. 골수 얼룩은 항응고제 골수 표본보다 훨씬 쉽게 얻을 수 있는데, 항응고 골수를 얻기 위해서는 핵을 얻기 위한 복잡한 절차가 필요하기 때문입니다.따라서, 우리는 다발성 골수종 세포의 검출을 위해 골수 도말 FISH에 대한 설득력있는 방법을 확립했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 장골 척추에서 골수를 흡인하는 기술과 생검을 위한 도말 준비에 대해 설명합니다. 이 예에서는 급성 골수성 백혈병(AML) 환자의 골수 흡인을 수행하고 세포를 검사하여 중요한 예후 바이오마커인 측정 가능한 잔류 질환(MRD)을 확인합니다.

골수 흡인: 세포 형태를 검사하기 위해 골수를 얻는 방법

복잡한 조직 대중은 장기에서 종양, 다양한 세포 요소로 구성되어있다. 우리는 세포의 기원뿐만 아니라 단백질 발현에 따라 세포의 특성을 해독 스펙트럼 unmixing 다음 다중 매개 면역 형광 염색과 함께 멀티 라벨 형광 형질 전환 마우스를 이용한 조직 내에서 세포의 표현형의 기여를 밝혀.

세포의 기원, 종류, 그리고 상호 작용의 시각화를위한 형광 조직 이식에 따라 정량 멀티 스펙트럼 분석

골수의 조직학적 데이터를 정량적으로 분석하는 전략을 제시합니다. 조직 절편에서 형광 표지된 세포에 대한 컨포칼 현미경 검사는 자동으로 분석되는 2차원 이미지를 생성합니다. 다양한 세포 유형의 공동 국소화 분석을 시뮬레이션된 이미지의 데이터와 비교하여 세포 상호 작용에 대한 정량적 정보를 제공합니다.

조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

원발성 다발성 골수종 세포에 대한 고처리량 약물 감수성 분석을 설명합니다. 이는 멀티웰 플레이트에서 골수 미세환경(세포외 기질 및 기질 포함)을 재구성하는 것과 세포 생존율의 종적 정량화를 위한 비침습적 방법으로 구성됩니다.

차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

본 프로토콜은 전신 조사에 노출된 후 마우스의 골  수 세포에서 염색체 간 안정 이상을 식별하는 데 있어 다중 형광 현장 혼성화(mFISH) 및 스펙트럼 핵형 분석(SKY)의 유용성을 설명합니다.

여러 형광에 의한 간 염색체 안정 수차의 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (mFISH) 및 방사선 조사 마우스의 스펙트럼 핵형 분석 (SKY)

또는 측정 최소 잔여 질병 (MRD)의 위험 평가 정제 하 고 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 재발 예측에 대 한 중요 한 예 후 바이오 마커 이다. 이러한 포괄적인 지침과 일관 되 고 정확한 식별 및 MRD의 검출을 위한 모범 사례 권장 사항을 효과적인 AML 치료 결정에 도움이 수 있습니다.

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

여기 우리는 다중 형광 immunohistochemical 얼룩 및 여러 암 관련 항 림프 종에서의 동시 지역화에 대 한 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 모든 조직 섹션에서 생체의 colocalization 분석을 확장할 수 있습니다.

멀티플렉스 형광 Immunohistochemical 얼룩, 이미징, 및 림프 종 조직학 샘플 분석

여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 집단을 분리하고 특성화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 질병 진행에 따라 내피 및 중간엽 기질 세포를 포함한 비조혈 골수 틈새의 변화를 식별합니다.

골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 골수 미세환경 집단 식별

여기에서는 인류 세포 분석 기반 방법을 사용하여 마우스에 이종 이식하고 골수 흡인에서 얻은 급성 인간 골수성 백혈병 세포에서 mTORC1, JAK/STAT5 및 MAPK 경로의 다운스트림 신호를 분석합니다. p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 및 p-ERK1/2 수준은 고감도의 차세대 스펙트럼 유세포 분석기를 사용하여 동시에 측정됩니다.

급성 골수성 백혈병 환자 유래 이종이이식의 세포내 인류 세포분석

학습하세요 다발성 골수종 진단을 위한 골수 얼룩 FISH 기법으로, 항CD138 자기 비드 분류와 형광 현미경 관찰을 통해 클론 골수 세포를 정확히 식별하고 유전학적 위험도를 평가하는 방법입니다.

다발성 골수종의 골수 얼룩의 계내 형광 혼성화

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