테이프 방법 및 핸드헬드 마이크로어레이를 사용한 조직 마이크로어레이의 수동 구성

조직 마이크로어레이 또는 TMA는 공여체 블록이라고 하는 포르말린 고정 파라핀 임베디드 조직 블록에서 조직 코어로 알려진 작은 예시적인 조직 조각을 단일 파라핀 블록으로 조립하는 중요한 연구 도구입니다. 테이프 방법은 직립 코어 주위에 블록을 주조하여 건설 공정을 반전시키는 완전 수동 시공 방법이므로 비이상적인 기증자 블록과 호환되며 저렴하고 널리 사용 가능한 일회용 핸드헬드 조직 마이크로어레이를 사용합니다. 이 과정의 다단계 워크플로우는 Mr.Lee Wisner와 Dr.Brandon Larsen에 의해 시연될 것입니다.

TMA 블록을 구성 할 때 기억해야 할 가장 중요한 개념 중 하나는 포르말린 고정 파라핀 임베디드 조직 블록의 조직이 실제로 입체 구조라는 사실입니다. 우리는이 개념을 설명하는 데 도움이되는 애니메이션을 개발했습니다. 여기서 볼 수있는 것은 포르말린 고정 파라핀 임베디드 조직 블록을 묘사 한 애니메이션으로 블록 내에서 해당 조직의 입체 특성을 보여줍니다.

조직이 블록 상단에서 볼 수 있으며 그 영역이 상당히 크다는 것을 알 수 있습니다. 우리가 X선 시야를 가질 수 있었다면, 그리고 블록을 통해 볼 수 있었다면, 우리는 조직이 실제로 바다의 빙산처럼 그 블록 내에서 더 깊은 곳에서 균일하게 형성되지 않았 음을 알 수 있습니다. 그 조직 블록 내에는 표면에 보이지 않는 추가적인 조직 조각이있을 수 있습니다.

그 조직의 중심 깊숙한 곳 내에 괴사 또는 조직 죽음의 영역이있을 수 있습니다. 병리학자는 실제로 해당 조직 블록의 상단에서 이차원 섹션을 검토 한 다음 해당 슬라이드에 주석을 달아 관심있는 조직을 포함하고 괴사 또는 실제로 관심이없는 다른 유형의 조직을 제외한 영역을 표시해야합니다. 조직의 적절한 코어 샘플링을 용이하게하기 위해 병리학자는 세 가지 일을해야합니다.

첫째, 슬라이드 마킹 펜을 사용하여 병리학자는 다른 조직을 피할 수 있도록 슬라이드에 관심있는 조직을 표시합니다. 둘째, 피해야 할 관심 영역 내에 영역이있는 경우 병리학자는 동일한 마킹 펜을 사용하여 샘플링해서는 안되는 영역을 얼룩지게 할 수 있습니다. 마지막으로, 다른 색상의 펜을 사용하는 것이 바람직하며, 병리학자는 코어 샘플링 및 TMA 구축을위한 관심 영역 내에서 이상적인 영역을 표시해야합니다.

그 과정이 완료되면 조직 구성이 코어 샘플이 얻어지는 곳에서 더 깊이 바뀔 수 있으며 애니메이션에서 이것을 보여줄 것이며, 코어의 위치는 조직의 깊이와 그 블록 내에 존재하는 것에 따라 달라질 수있는 코어의 구성을 결정한다는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 여기서 우리가 설명하고있는 첫 번째 핵심은 조직의 일부를 상반부에서 포착하는 것이지만 블록 내 깊숙한 곳에는 더 이상 코어가 얻어지는 조직이 없으므로 파라핀 왁스 만 샘플링되었습니다. 여기서 설명한 두 번째 핵심은 조직이 해당 위치에서 해당 블록의 전체 깊이에 걸쳐 존재하기 때문에 전체 길이를 따라 조직을 캡처했습니다.

세 번째 코어는 조직의 일부를 포획한 다음, 조직이 존재하지 않는 중앙에 파라핀 왁스의 일부를 포획한 다음, 그 블록의 하단 부분에 조직이 있던 하단 끝에서 조금 더 많은 조직을 포획하였다. 병리학 검토가 완료되면 TMA 구성에 사용할 기증자 블록의 최종 목록을 컴파일 한 다음 TMA 맵을 작성하십시오. TMA 맵은 코어가 완성된 TMA 및 생성된 TMA로부터 절단된 슬라이드 장착형 조직 절편에 위치할 위치를 개략적으로 요약한 것이다.

방향을 위해, TMA 맵이 세 개씩 세 개 또는 네 개의 행렬과 같은 짝수 행렬에 코어를 배치하는 것을 방지하고 하나 이상의 방향 마커를 포함하는지 확인합니다. 테이프 방법은 거꾸로 된 코어 주위에 용융 왁스를 부어 건설 프로세스를 반전시키기 때문에 TMA 맵의 미러 이미지 인 건설 맵으로 알려진 두 번째 맵을 만들어야합니다. 건설 맵은 완성 된 TMA의 올바른 위치에 나타나기 위해 건설 중에 각 코어를 배치해야하는 위치를 보여줍니다.

맵이 생성되면 금속 TMA 베이스 몰드를 준비합니다. 코어 배치를 안내하려면 일회용 용지 체크 무늬 격자를 사용하십시오. 용지 체크 무늬 격자를 크기에 맞게 자르고 격자 뒷면에 이중 스틱 테이프 조각을 부착합니다.

그리드와 테이프를 금속 트레이에 넣고 그리드 위에 두 번째 더블 스틱 테이프를 추가합니다. 병리학 검토 된 H & E 슬라이드를 FFPE 조직 블록에 오버레이하여 펀칭하고 병리학 자의 표시를 사용하여 조직 블록을 펀칭 할 위치를 식별하십시오. 일회용 또는 재사용 가능한 핸드헬드 수동 코어 펀치를 사용하여 FFPE 공여체 블록을 적절한 영역에서 펀치합니다.

재사용 가능한 코어 펀치를 사용하는 경우 각 티슈 펀치 전후에 청소해야 합니다. 코어 펀치에서 코어를 꺼냅니다. 바늘 픽을 사용하여 배출된 코어를 더블 스틱 테이프로 덮인 격자의 십자선에 놓습니다.

코어의 조직 끝이 테이프와 접촉하고 건설 맵에 표시된 올바른 위치에 있도록 코어가 거꾸로 직립 방식으로 배치되었는지 확인하십시오. 모든 공여체 블록이 부식되고 코어가 적절한 위치에 배치 될 때까지 반복하십시오. 모든 코어가 제자리에 놓이면 플라스틱 카세트에 라벨을 붙이고 코어가 들어있는 금속베이스 위에 놓습니다.

카세트를 놓을 때 키가 큰 코어가 기울어 지거나 쓰러지기 때문에 코어의 높이는 금속 트레이의 깊이를 초과해서는 안됩니다. 녹은 파라핀을 카세트를 통해 코어 트레이에 부드럽게 붓습니다. 용융된 파라핀이 넘치도록 허용하여 TMA의 몸체에 기포가 없도록 하십시오.

파라핀이 카세트의 상단에 채워져 카세트가 매립되고 응고되면 파라핀 블록에 단단히 결합되도록하십시오. 블록을 실온에서 30분 동안 식히고 이 시간 동안 블록을 움직이지 마십시오. 블록을 섭씨 네 도에서 30분 동안 냉장 보관하여 완전히 응고시킵니다.

완전히 설정되면 금속 베이스 몰드를 부드럽게 분리하고 파라핀 블록에서 이중 스틱 테이프를 제거합니다. TMA가 구축되면 마이크로톰을 사용하여 새로운 TMA를 절편화하십시오. 블록이 적절하게 직면되면 전체 얼굴 조직 섹션을 수집하십시오.

섹션을 미리 예열 된 수조로 옮기고 조직 섹션을 슬라이드 마운트하십시오. 일단 건조되면, H&E 염색 및 필요할 수 있는 추가적인 면역조직화학 염색을 위한 대표적인 섹션을 제출하십시오. 병리학 적 검토를 위해 염색 된 TMA 섹션을 제출하십시오.

TMA 검증을 위해 병리학자는 TMA 블록의 H & E 슬라이드를 검토하고 현미경으로 각 원형 지점을 검토하여 관심있는 조직이 존재하는지 확인해야합니다. 건설 과정의 중요한 구성 요소는 TMA 코어를 얻어야하는 곳에서 주어진 기증자 블록에서 관심있는 조직을 식별하는 것입니다. 이 그림의 첫 번째 열은 병리학 자의 표시가있는 모범적 인 기증자 H & Es를 보여줍니다.

두 번째 열은 H&E 염색된 조직의 펀칭된 영역을 보여준다. 세 번째 컬럼은 하나 및 두 개의 컬럼에 표시된 영역의 공여체 블록으로부터 수확된 TMA 코어의 H&E 염색된 조직을 보여준다. 병리학자는 일치하는 기증자 블록과 TMA 코어 H&Es를 함께 보고 관심 영역이 수집되었고 조직 조성이 동일한지 검증할 수 있습니다.

테이프 방법으로 TMA를 성공적으로 완료하기 위한 두 가지 원칙 메트릭이 있습니다. 첫 번째는 예상되는 위치와 서로 떨어져있는 거리에 조직 코어 점의 존재이며, 이는 육안 검사에 의해 평가됩니다. A와 B에 표시된 이미지는 성공적으로 완료된 두 개의 테이프 방법 TMA와 해당 H&E 슬라이드를 보여줍니다.

이러한 TMA 블록의 육안 검사는 코어가 각 TMA 및 해당 섹션에 존재하고 정기적으로 간격을 두고 있음을 보여줍니다. 테이프 방법 시공 공정 중에 발생할 수 있는 주요 구성 문제 중 일부는 이미지 C.Core에 표시된 바와 같이 응고 전에 금속 베이스의 조기 제거로 인한 블록과 카세트의 분리를 포함하며, 이미지 D에 표시된 바와 같이 임베디드 코어의 전복 및/또는 배치 드리프트는 용융된 파라핀의 과도하게 난류가 쏟아지는 동안 발생할 수 있고, 접착력이 좋지 않은 양면 스틱 테이프로 인해 악화 될 수 있습니다. 이 도면은 예시적인 TMA가 예시적인 각각의 코어에 대한 H&E 염색을 보여준다.

핵심 지점 중 하나를 제외한 모든 것이 H & E에 있습니다. 그림은 또한 코어 중 일부는 완전한 원형 조직 점으로 존재하지만 다른 코어는 완전히 존재하지 않는다는 것을 보여줍니다. 이러한 조직 손실은 드문 일이 아니며 모든 코어를 완전히 드러내기 위해 직면 한 블록이 불충분하기 때문일 수 있습니다.

대안적으로 불완전한 존재 또는 조직의 전체 부재는 그 코어의 불량한 조직 품질로부터 유래할 수 있으며, 이는 염색 과정 동안 조직 손실을 초래할 수 있다. 이 다음 그림에서는 TMA를 추가로 검증하기 위해 TMA 절편에 대해 면역조직화학 및 RNA ISH 염색을 수행하였다. 본원에 나타낸 바와 같이, TMA를 구축하는데 사용되는 조직에 따라 다양한 염색이 사용될 수 있다.

Vimentin은 품질 관리로 사용됩니다. U6은 RNA 품질의 지표입니다. EBER는 EBV 상태를 확인하는 데 사용됩니다.

및 CD20은 B 세포의 존재를 나타내는 B 세포 마커이다. 이들은 TMA를 검증하는 데 사용할 수있는 몇 가지 얼룩입니다. 이 비디오를 시청 한 후에는 테이프 방법을 사용하여 조직 마이크로 어레이를 만드는 방법과 TMA가 중요한 시간 및 자원 절약 연구 도구인 이유를 이해해야합니다.

또한 TMA 구축은 이상적인 과정이 아니며 지속적인 병리학 적 지침 및 검토가 건설 과정뿐만 아니라 TMA 섹션에 실제로 관심있는 조직이 실제로 존재하는지 확인하기 위해 TMA 섹션에서 수행되는 면역 조직 화학 연구에도 중요한 구성 요소임을 이해해야합니다.