Name: SNARE 인신매매를 사용하여 재활용 내시경을 연구하고 분석하는 현미경 기반 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 학습하세요 SNARE 인신매개를 이용한 재활용 내소체의 현미경 분석 방법을 통해 피부 멜라닌세포에서 멜라노좀 생물학을 연구하는 기법을 배워보세요. 이 연구는 색소 침착 장애 이해에 기여합니다.

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이 작품은 생명공학부(BT/PR32489/BRB/10/1786/2019~SRGS)에 의해 지원되었다. 과학 및 공학 연구 위원회 (CRG/ 2019/000281 SRGS); DBT-NBACD(BT/HRD-NBA-NWB/2019-20 ~SRGS) 및 IISc-DBT 파트너십 프로그램(SRGS). 부서의 인프라는 DST-FIST, DBT 및 UGC에 의해 지원되었습니다. AMB는 DBT-JRF(DBT/2015/IISc/NJ-02)에 의해 지원되었습니다.

프로토콜은 플라스미드의 질산순환 에 이어 멜라닌세포의 파종을 포함한다. 추가 단계는 REs의 길이 및 수를 측정하기 위하여 세포의 고정, 면역 염색, 화상 진찰 및 분석을 포함합니다. 프로토콜에 대한 자세한 설명은 아래에 있습니다.
1. 미리 처리 된 커버립에 마우스 멜라닌 세포의 파종
<ol><li>유리 커버를 페트리 접시(즉, 35mm 접시에 4-5)에 지하 막 매트릭스 배지(완전 RPMI 배지1:20: RPMI + 10% 열 비활성화 FBS + 1x 글루타민 + 1x 항생제 믹스)로 코팅하고 조직 배양 후드에서 15분 동안 건조시킵니다. 사용하기 전에 1x PBS로 커버립을 한 번 씻으시면 됩니다.</li>
	<li>페트리 디쉬(예: 35 mm 또는 60mm 접시)에서 야생형 마우스 멜라닌세포(C57BL/6J, a/a, Ink4a-Arf/-- 마우스)를 유지관리합니다.<ol>
<li>1x PBS로 세포를 두 번 세척하고 트립신-EDTA(0.25%) 용액의 0.5 또는 1mL을 트립시화 세포를 추가합니다. 페트리 접시로부터 분리를 위해 세포를 37°C에서 2-5분 동안 배양한다.</li>
		<li>완전한 RPMI 배지의 1 - 2 mL을 추가한 다음 세포를 원심분리기 튜브로 옮기십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 현탁액을 4°C, 376 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 1x PBS로 펠릿을 다시 분리합니다.</li>
	<li>원심분리 단계를 반복하고 완전한 RPMI 배지의 1mL에서 세포를 다시 분리한다.</li>
	<li>지하 막 중간 코팅 커버립의 세포를 50-60% 수렴성(4-5 커버립을 함유한 35mm 세포 배양 접시에 약 6 x 105 셀). 항상 완전한 RPMI 매체에서 도금 된 셀 서스펜션에 PMA 200 nM (작업 재고 40 μM phorbol 12-myristate 13-acetate의 5 μL을 추가)를 추가하십시오.</li>
	<li>파종 후, 플레이트를 12-24h에 37°C로 배양한다.</li>
</ol>2. STX13 플라스미드로 세포의 침입
<ol><li>pEGFP-C1-STX13WT 및 pEGFP-C1-STX13Δ129(in12에 설명)를 사용합니다. mCherry-Rab11은 파리 인스티투트 큐리(참조19)의 그라샤 라포소(Graça Raposo)의 친절한 선물이었습니다. ATCC (TA99)로부터 항 TYRP1 항체.</li>
	<li>12 -24 h의 파종 후, 지질 계 의 형질 전환 시약을 사용하여 플라스미드로 세포를 트랜스펙트합니다. 35mm 접시의 경우, 마이크로센트심분리기 튜브에서 OPTI-MEM 배지의 250 μL에서 5 μL의 트랜스펙트 시약을 취하고 OPTI-MEM의 250 μL에서 각 플라스미드의 약 200 ng를 복용하십시오.</li>
	<li>DNA와 트랜스페트 시약을 포함하는 튜브를 5분 동안 배양합니다. 반복 된 파이펫팅없이 혼합 (총 부피는 약 500 μL될 것입니다). 실온에서 30분 동안 배양하십시오. RT에서 30분 동안 10분마다 튜브를 손도청을 수행합니다.</li>
	<li>인큐베이션 하는 동안, 1 x PBS와 함께 두 번 세포를 세척, 한 번 OPTI-MEM와 함께 다음 세포에 OPTI-MEM의 1 mL를 추가.</li>
	<li>30분 동안 배양을 후, 접시를 덮음으로써 세포에 트랜스펙트 시약-DNA 믹스를 첨가한다.</li>
	<li>세포를 37°C에서 6시간 동안 배양한다. TRANSFection 시약으로 OPTI-MEM 배지를 흡인하고 PMA 200 nM으로 보충된 완전한 RPMI 배지를 추가합니다.</li>
	<li>세포를 37°C에서 48h로 배양한다.</li>
</ol>3. 셀 고정
참고: 다음 절차는 조직 배양 후드 외부에서 수행됩니다.
<ol><li>48h의 트랜스펙트 후, 1x PBS로 세포를 두 번 씻은 다음 30 분 동안 3 % 포름 알데히드 (1 x PBS로 갓 준비)로 세포를 고정합니다.</li>
	<li>고정 후, 1x PBS로 셀을 두 번 씻고 추가 사용까지 1x PBS에 커버립을 보관하십시오. 또는, 셀은 유리 슬라이드 (아래 참조)에 장착하거나 4 ° C에 저장 될 수 있습니다.</li>
</ol>4. 세포의 면역 염색
<ol><li>습한 챔버 준비: 알루미늄 호일로 덮인 페트리 접시에 촉촉한 필터 용지에 파라핀 필름 컷 피스를 배치합니다.</li>
	<li>1차 항체 용액 25μL(1x PBS에서 0.2%, PBS에서 0.1%, PBS1x에서 0.02%, PBS에서 0.02% 나트륨 아지드)를 준비한다. 1:200의 희석시 항체를 추가합니다. 습한 챔버의 파라핀 필름에 드롭으로이 솔루션을 추가합니다.</li>
	<li>조심스럽게 집게로 커버 슬립을 들어 올리고, 1 차적인 항체 염색 용액의 이 방울에 그것을 반전한 다음 습한 챔버의 뚜껑을 덮습니다. 실온에서 30분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>마찬가지로, 1:500의 희석시 이차 항체 용액을 준비하고 습한 챔버의 커버슬립 옆에 있는 파라핀 필름에 놓는다. 핵 염색을 위해, 용액에 DAPI(1:20,000 ~ 1:30,000)를 추가한다.</li>
	<li>집게를 사용하여, 조심스럽게 1 차 항체 용액에서 커버 슬립을 선택하고 1 x PBS (유리 비커에서)에 세 번 찍어.</li>
	<li>티슈 페이퍼의 커버슬립을 탭하여 커버슬립의 초과 PBS를 제거합니다. 습한 챔버에 이차 항체 염색 용액에 배치하고 용액에 형광 태그 항체의 존재로 인해 빛에 노출하지 않습니다.</li>
	<li>실온에서 30분 동안 커버슬립을 다시 배양합니다. 항상 이러한 단계 전체에 걸쳐 세포가 있는 커버슬립의 측면을 주의하십시오.</li>
	<li>인큐베이션 후, 조심스럽게 이차 항체 용액에서 커버 슬립을 선택하고 1 x PBS에 세 번 찍어. 또한, 티슈 페이퍼의 커버슬립을 탭하여 커버슬립의 초과 PBS를 제거한다.</li>
	<li>플루오로마운트-G 장착 시약 12μL을 유리 슬라이드에 놓고 스테인드 커버슬립(유리쪽으로 향)을 장착 시약위에 조심스럽게 놓습니다. 티슈 페이퍼의 유리 슬라이드를 반전한 다음 부드럽게 누릅니다.</li>
</ol>5. 세포의 형광 현미경 검사
<ol><li>60x(오일) 정색 목표 또는 유사한 구성을 가진 다른 현미경을 사용하여 CCD 카메라를 장착한 반전형 형광 현미경을 사용하여 밝은 필드(BF) 및 형광(IF) 필터 하에서 염색된 세포를 이미지화한다.</li>
</ol>6. RE 국소화 된 단백질과 멜라노솜 사이의 중첩의 정량화 :
참고: 다음 단계는 피지 소프트웨어를 사용하여 단백질 사이의 Mander의 중복 계수의 정량화를 위해 다음과 같습니다 (링크에서 자유롭게 다운로드 할 수 있습니다: https://imagej.net/software/fiji/). 여러 채널의 TIFF 이미지를 사용합니다.
<ol><li>
원시 이미지를 엽니다. 이미지 옵션으로 이동하여 색상 | 선택합니다. 채널을 분할하고 분석을 위해 두 채널을 사용합니다.</li>
	<li>플러그인 옵션에 JACoP 플러그인 을 엽니다.</li>
	<li>모든 밝은 반점이 선택되고 배경이 제거될 수 있도록 두 채널모두에 대한 임계값을 설정합니다.</li>
	<li>분석 옵션으로 이동하여 M1 및 M2 계수를 선택하여 Mander의 중복 계수를 얻습니다.</li>
	<li>JACoP 플러그인에서 분석 옵션을 누르고 맨더의 중복 계수를 표시하는 결과를 확인합니다.</li>
</ol>7. 재활용 내성자의 관 수와 길이의 정량화:
참고: 다음 단계는 피지 소프트웨어를 사용하여 튜블러의 수와 길이의 정량화를 위해 다음과 같습니다.
<ol><li>원시 이미지 이미지 로 이동 옵션을 열고 색상 | 채널을 분할 하고 분석을 위해 원하는 채널을 사용합니다.</li>
	<li>다시 이미지로 이동하여 | 유형 선택 8비트 이미지로 변환합니다.</li>
	<li>그런 다음 플러그인으로 이동하여 분석 | 선택합니다. 튜브. 시그마 값을 0.1075로 설정합니다. 확인을 누르고.</li>
	<li>다시 이미지로 이동하여 | 유형 선택 8비트 이미지로 변환합니다.</li>
	<li>이미지 | 조정 | 임계값(모든 이미지에 대해 동일한 임계값을 사용합니다. 이미지는 대략 동일한 강도를 가져야 합니다).</li>
	<li>프로세스 | 바이너리 | 마스크로 변환합니다.</li>
	<li>프로세스로 이동하여 바이너리를 선택한 다음 스켈레톤화를 선택합니다.</li>
	<li>분석으로 이동하여 스켈레톤을 선택하고 스켈레톤 분석을 선택합니다. 결과 및 출력 | 선택(a)| 가장 짧은 경로를 계산하면 |(c) 표시 표시 골격에 대한 자세한 정보를 보여 준다. 확인을 누르고. 참고: 결과는 표고된 형식으로 열립니다. 평균 분기 길이의 열은 선택한 셀의 모든 다른 튜블러의 길이를 보여 주며(마이크로미터에서 값을 얻기 위한 설정 된 배율).</li>
	<li>셀의 튜블 수를 얻기 위해 분석으로 이동하여 파티클 분석 옵션을 선택합니다. 확인을 누르고. 참고: 얻은 결과에서 카운트 열에는 해당 셀의 튜벌레 수가 표시됩니다.</li>
	<li>데이터를 저장하고 분석합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Dell'Angelica, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+building+BLOC%28k%29s+of+lysosomes+and+related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).</li>
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<li>Setty, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-1+is+required+for+cargo-specific+sorting+from+vacuolar+early+endosomes+toward+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">BLOC-1 is required for cargo-specific sorting from vacuolar early endosomes toward lysosome-related organelles.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (3), 768-780 (2007).</li>
<li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AP-1+and+KIF13A+coordinate+endosomal+sorting+and+positioning+during+melanosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">AP-1 and KIF13A coordinate endosomal sorting and positioning during melanosome biogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (2), 247-264 (2009).</li>
<li>Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Burek, C. L., Di Pietro, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-2%2C+AP-3%2C+and+AP-1+proteins+function+in+concert+with+Rab38+and+Rab32+proteins+to+mediate+protein+trafficking+to+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">BLOC-2, AP-3, and AP-1 proteins function in concert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking to lysosome-related organelles.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19550-19563 (2012).</li>
<li>Sitaram, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+a+dileucine-based+sorting+signal+by+AP-1+and+AP-3+reveals+a+requirement+for+both+BLOC-1+and+AP-3+in+delivery+of+OCA2+to+melanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).</li>
<li>Nag, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab4A+organizes+endosomal+domains+for+sorting+cargo+to+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles.</a> Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).</li>
<li>Dennis, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-2+targets+recycling+endosomal+tubules+to+melanosomes+for+cargo+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).</li>
<li>Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STX13+regulates+cargo+delivery+from+recycling+endosomes+during+melanosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis.</a> Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).</li>
<li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab22A+recruits+BLOC-1+and+BLOC-2+to+promote+the+biogenesis+of+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes.</a> EMBO Reports. 19 (12), 45918(2018).</li>
<li>Bowman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BLOC-1-AP-3+super-complex+sorts+a+cis-SNARE+complex+into+endosome-derived+tubular+transport+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A BLOC-1-AP-3 super-complex sorts a cis-SNARE complex into endosome-derived tubular transport carriers.</a> Journal of Cell Biology. 220 (7), 202005173(2021).</li>
<li>Wei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hermansky-Pudlak+syndrome%3A+a+disease+of+protein+trafficking+and+organelle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hermansky-Pudlak syndrome: a disease of protein trafficking and organelle function.</a> Pigment Cell Research. 19 (1), 19-42 (2006).</li>
<li>Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+lysosome-related+organelles%3A+Insights+from+Hermansky-Pudlak+syndrome+and+other+rare+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases.</a> Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).</li>
<li>Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin+13+mediates+cycling+of+plasma+membrane+proteins+via+tubulovesicular+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes.</a> Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).</li>
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</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

재활용 내시경은 내세포 소기관의 코호트이며, 모든 세포 유형21,22,23,24,25에서 화물의 재활용을 세포 표면으로 중재한다. 멜라닌 세포와 같은 전문적인 세포 모형에서, 이 세포기관은 부분적으로 그들의 생물 발생을 위한 melanosomes를 향해 그들의 인신 매매 경로를 전환3,16,26. 또한, REs는 초기/선별 내분에서 카고 분류 후 생성되며 형태학적으로 관형 성 구체 구조로 나타납니다. 그들의 역학 (수 및 길이)는 모터 단백질21,22,2...

멜라닌 안료의 생합성은 멜라노솜, 멜라노세포 특이리소성 세포질(LRO)에서 발생하며, 이는 기존의 리소좀과 공존한다. 내세포 시스템은 멜라노솜의 생물 발생에 중요한 역할을하며, 피부 색및 이온화 방사선에 대한 포토보호에 요구된다1,2,3. 이 과정에서 멜라닌 합성 효소는 초기/선별 내분모에 분류된 다음, 내분비(REs)4,5,6,7,8,9,10이라고 불리는 관 또는 생구 내분모를 통해 조기 멜라노좀으로 이송된다. 이러한 세포기관의 표적화 및 융합은 완전 기능성 색소멜라노솜7,11,12,13,14의 성숙을 조절한다. 이러한 세포기관 또는 화물 선별의 형성에 결함이 있는 것은 허만스키-푸들락 증후군15,16에서 관찰된 오큘로쿠탈 백색증 및 그밖 임상 표현형을 일으키는 원인이 됩니다.
여기에서 우리는 REs를 연구하고 분석하기 위하여 간단한 현미경 기지를 둔 기술을 기술합니다. 이 방법으로, 우리는 멜라노세포12,18에서 내모와 멜라노솜을 분류하는 사이 내모성 및 멜라노솜을 분류하는 것 사이 내모성 17 및 주기에 상주하는 막 단백질, Qa-SNARE Syntaxin (STX)13을 이용했습니다. 또한, N단비정형 규제 도메인(즉 SynN 또는 STX13Δ129)을 삭제하면 SNARE가 멜라노솜에 갇히게 되어 멜라노솜12를 향한 전방 인신매매 경로를 측정할 수 있습니다. 우리는 우리의 연구에서 알려진 재활용 내피 마커 Rab GTPase (Rab)11을 사용했습니다14,19. 단백질 GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab129 및 TYRP1의 형광 이미징은 야생형 멜라노사이클의 양량화에 이어 상대적 국소화의 정량화에 따라 멜라노솜에 대한 표적화 이외에 REs의 특성과 역학을 제공할 것이다. 따라서, 이것은 멜라닌세포에서 REs의 역학을 시각화하고 측정하는 데 사용할 수 있는 간단한 기술이다.

<table><tbody><tr><td>anti-TYRP1 항체 (TA99)</td><td>ATCC</td><td>HB-8704</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668-500</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>022600-050</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 매체 1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31800-022</td><td></td></tr></tbody></table>

snare 인신매매를 사용하여 재활용 내시경을 연구하고 분석하는 현미경 기반 분석

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

재활용 내분 (REs)은 모든 세포 유형의 초기 /정렬 내분비에서 생성 된 관 형 혈관 세포기관입니다. 이 세포기관은 멜라노좀의 생물 발생에 중요한 역할을, 멜라닌 세포에 의해 생성 된 리소솜 관련 세포기관. REs는 멜라닌세포 특이적 화물을 형성 하는 동안 조기 멜라노솜에 전달합니다. 헤르만스키-푸들락 증후군의 여러 돌연변이체에서 관찰되는 REs의 생성에 막힘은 피부, 모발 및 눈의 저색소침착을 초래합니다. 따라서, REs의 역학(수 및 길이 참조)을 연구하는 것은 정상 및 질병 조건에서 이러한 세포기관의 기능을 이해하는 데 유용하다. 이 연구에서는 상주 SNARE STX13을 사용하여 RE 역학을 측정하는 것을 목표로합니다.

STX13Δ129 돌연변이 국소화의 정량화 마우스 야생형 멜라노사이클로 STX13의 면역형 현미경검사는 GFP-STX13WT를 세포 표면 이외에 링형 구조로 국소화한 결과 및 관구조 및 GFP-STX13Δ129를 나타냈다(도 1A). 또한, 세포내 고리 같은 GFP-STX13Δ129는 멜라노이트 단백질 TYRP1(도 1A) 및 밝은 필드 이미지 멜라노솜(data not 도시)과 의 공동국화를 보였다. 앞서 나타낸 바와 같이, 과발현된 GFP-STX13WT의 코호트가 멜라노솜12에서 관찰된다. GFP-STX13WT 및 GFP-STX13Δ129의 상대...

재활용 내분은 내피 관 네트워크의 일부입니다. 여기서는 GFP-STX13을 세포구마커로 사용하여 재활용 내종의 역학을 정량화하는 방법을 제시합니다.

SNARE 인신매매를 사용하여 재활용 내시경을 연구하고 분석하는 현미경 기반 분석

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

현미경 기반 분석법은 SNARE 인신매매를 사용하여 재활용 내시경을 연구하고 분석합니다. 이들은 피부 멜라닌세포입니다. 세포 내부에서 볼 수 있는 검은 색 세포기관은 멜라노솜이라고 합니다.멜라노솜은 리소조메 관련 세포기관 또는 LRO라고 불리는 세포기관의 클래스로 알려져 있다. 재활용 내분은 초기또는 모든 세포 유형의 내모세포를 분류하는 관형 성구 세포기관입니다. 이 세포기관은 멜라노좀의 생물 발생에 중요한 역할을, 멜라노세포에 의해 생성 된 리소조메 관련 세포기관.재활용 내분은 멜라닌세포별 화물을 형성하는 동안 조기 멜라노솜에게 전달합니다. 여러 증후군에서 관찰되는 재활용 내종의 생성은 피부, 모발 및 눈의 과색소 침착에 있는 세포입니다. 따라서, 재활용 내종의 역학을 연구하는 것은 정상 및 질병 조건에서 이러한 세포기관의 기능을 이해하는 데 유용하다.이 연구는 SNARE 구문 -13을 체포하여 재활용 내역의 역학을 측정하는 것을 목표로합니다. 첫 번째 단계는 미리 처리된 커버립에 마우스 멜라닌세포의 파종입니다. 지하 멤브레인 매트릭스 매체에 페트리 접시에 유리 커버립을 코팅합니다.그리고 조직 배양 후드에 15 분 동안 건조. 사용하기 전에 1X PBS로 커버립을 한 번 씻으시면 됩니다. 지하 막 에 세포를 시드 중코팅 커버립 50 받는 다 60%의 역량.항상 완전한 RPMI 매체에서 도금 된 세포 현탁액에 PMA의 200 나노 몰라를 추가하십시오. 세포를 파종한 후 CO2 인큐베이터에 세포를 함유한 접시를 12~24시간 동안 배양한다. 두 번째 단계는 구문 -13 플라스미드를 가진 세포의 형질입니다.DNA 및 트랜스페션 시약을 포함하는 팁을 배양하고 5 분 동안 혼합하고 반복된 파이펫팅없이 섞습니다. 실온에서 30분 동안 10분마다 손으로 튜브를 누릅니다. 인큐베이션 하는 동안, 1X PBS와 함께 두 번 세포를 세척, 한 번 OPTI-MEM, 다음 세포에 OPTI-MEM의 1 마일을 추가.인큐베이션의 30 분을 게시, 접시를 덮음 현명한 방식으로 세포에 경질 시약 DNA 믹스를 추가합니다. 6 시간 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양하십시오. CTI-MEM 배지를 트랜스페트 시약으로 흡인하고 PMA의 200 나노몰라로 보충된 완전한 RPMI 배지를 추가합니다.48 시간 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양하십시오. 세 번째 단계는 셀의 고정입니다. 다음 절차는 조직 배양 후드 외부에서 수행됩니다.48시간의 트랜스펙트 후, 1X PBS로 세포를 두 번 씻은 다음 30분 동안 3%의 포름알데히드로 세포를 고정합니다. 고정 후, 1X PBS로 셀을 두 번 씻고 커버립을 1X PBS에 추가로 사용할 때까지 보관하십시오. 또는, 세포는 유리 판에 장착하거나 섭씨 4도에 보관할 수 있습니다.네 번째 단계는 세포의 면역 염색이다. 습한 챔버를 준비합니다. 페트리 접시에 마우스 필터 용지에 파라필름 컷 조각을 놓습니다.알루미늄 호일로 덮습니다. 1차 항체 용액의 25 마이크로리터를 준비합니다. 1에서 200까지의 희석에 항체를 추가합니다.습한 챔버의 파라필름에 드롭으로이 솔루션을 추가합니다. 조심스럽게 집게로 커버 슬립을 들어 올립니다. 1 차적인 항체 염색 용액의 낙하에 그것을 반전하고, 그 후에 습한 챔버의 뚜껑을 덮습니다.실온에서 30분 동안 배양하세요. 유사하게, 1-500의 희석에서 이차 항체 용액을 준비하고 습한 챔버의 커버슬립 옆에 있는 파라필름에 놓는다. 핵염색을 위해, 용액에 120, 000 ~ 130, 000의 희석에 DAPI를 추가한다.집게를 사용하여, 조심스럽게 1 차 항체 용액에서 커버 슬립을 선택하고 1X PBS에 두 번 찍어. 티슈 페이퍼의 커버슬립을 탭하여 커버슬립의 초과 PBS를 제거합니다. 습한 챔버에 이차 항체 염색 용액에 배치하고 용액에 형광염 염색 항체의 존재로 인해 빛에 노출시키지 않는다.인큐베이션 후, 신중하게 이차 항체 용액에서 커버 슬립을 선택하고 1X PBS에 두 번 찍어. 또한, 티슈 페이퍼의 커버슬립을 탭하여 커버슬립의 초과 PBS를 제거한다. 이미징 시약 12마이크로리터를 유리 슬라이드에 놓고 스테인드 커버슬립을 장착 시약에 조심스럽게 배치합니다.티슈 페이퍼의 유리 슬라이드를 반전한 다음 부드럽게 누릅니다. 다음으로, 형광 현미경을 사용하여 커버슬립을 이미지화하고 ImageJ를 사용하여 이미지를 분석한다. 여섯 번째 단계는 재활용 내성 국소화 단백질과 멜라노솜 사이의 중첩의 정량화이다.구문신-13 델타-129의 정량화는 멜라노솜과 공존한다. 마우스 야생형 멜라닌세포에서 구문신-13의 면역형 현미경검사는 GFP-구문신-13야생형을 정맥 및 관구조로 국소화하였다. 그리고 GFP-구문신-13 델타-129는 셀 표면 이외에 고리와 같은 구조를 국소화한다.또한, 세포내 고리 같은 GFP-구문-13 델타-129는 밝은 필드 이미지 멜라노솜에서 멜라노솜 단백질 TYRP1과 공동화를 보였다. 앞서 나타낸 바와 같이, 과발현된 GFP-구문-13 야생형의 코호트가 멜라노솜에서 관찰된다. GFP-구문신-13 야생형및 GFP-구문-13 델타-129의 상대적 국소화를 멜라노솜에 측정하기 위해, 피지 소프트웨어가 사용되었고 JACOP 플러그인으로 분석이 이루어졌다.측정 된 Mander의 중복 계수는 MOC이며, TYRP1을 가진 GFP-구문 -13 델타-129 사이의 은 TYRP1을 가진 GFP-구문 -13 야생 유형에 비해 약 1.5 배 더 높습니다. 흥미롭게도, TYRP1은 GFP-구문신-13 델타-129를 가진 2.9 배 더 높은 MOC 값을 보여주었습니다. 이러한 데이터는 GFP-구문-13 델타-129 멜라노솜의 국소화가 꾸준한 상태에서 GFP-구문신-13 야생 유형에 비해 상대적으로 높다는 것을 나타낸다.구문신-13 야생형 의 정량화는 재활용 내종의 소중. GFP-구문-13 야생형의 면역형 현미경 검사는 알려진 재활용 내피 단백질 Rab11과 공존성을 보였다. mCherry-Rab11을 가진 GFP-구문-13 야생 타입 사이의 MOC는 GFP-구문-13 야생 타입을 가진 mCherry-Rab11에 비해 약 1.4 배 더 높습니다.GFP-구문신-13 야생형 양성 내구의 수와 길이를 측정하기 위해, 피지 소프트웨어는 프로토콜 섹션에 기재된 바와 같이 사용되었다. mCherry-Rab11은 실험에서 양성 대조군을 사용한다. GFP-구문-13 야생형으로 전감염된 멜라노세포는 mCherry-Rab11을 발현하는 세포에 비해 세포당 튜벌레수가 더 많은 것으로 나타났다.그러나, 튜브는 세포에서 GFP-구문-13 야생 형 및 mCherry-Rab11의 공동 발현시 감소된다. 일곱 번째 단계는 내모의 관 수와 길이를 재활용하는 정량화입니다. 튜브는 세포에서 GFP-구문-13 야생 유형과 mCherry-Rab11의 공동 발현시 감소된다.흥미롭게도, GFP-구문-13 야생형과 mCherry-Rab11모두에서 평균 튜버 길이는 개별적으로 또는 함께 표현하는 세포에서 서로 비교된다. 이 데이터는 GFP-구문신-13 야생 유형이 Rab11과 유사한 내분모를 재활용하는 데 국한되어 있음을 시사합니다. 이 연구는 구문 -13 돌연변이의 N 단자 납품, 즉 GFP-구문 -13 델타-129, 멜라노솜 GFP-구문 -13 델타-129로 지역화하는 것은 아마도 세포 표면에 내분피를 재활용에서 vesicular 밀매에 기자로 사용할 수 있음을 보여주었다.반면, GFP-구문신-13 야생형은 Rab11과 유사한 내모성 재활용에 국한됩니다. 이 연구는 GFP-구문신-13 야생 유형도 멜라닌 세포에서 재활용 내분법을 표시하는 데 사용될 수 있음을 보여 주었다. GFP-구문-13 야생 형은 Rab11이 내피 역학을 변화하기 때문에 Rab11보다 더 나은 재활용 내도 마커일 수 있습니다.GFP-구문신-13 야생형은 안정된 상태 조건에서 역학을 연구하기 위해 잠재적인 재활용 내도 마커를 작용합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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