소아 미만성 정중선 신경아교종의 Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays

미만성 정중선 신경아교종은 매우 침습적인 뇌종양입니다. 이 방법은 주요 접착 분자의 잠재적 역할에 대한 구체적인 통찰력과 함께 DMG 세포가 3D 맥락에서 어떻게 이동하고 침입하는지 실시간으로 연구하는 데 도움이 됩니다. 표지 시약과 특정 항-CD44 항체를 사용하여 DMG 세포의 원형질막에서 CD44의 발현을 3D 이동 및 침습에서도 생세포 이미징으로 연구할 수 있습니다.

이 기술의 적용은 이러한 세포의 운동성에서 CD44의 잠재적인 역할을 강조하여 가치 있고 침습적인 분자 표적을 나타낼 수 있음을 시사합니다. 시작하려면 100마이크로리터의 멸균수를 추가하여 ALR을 재수화하고 피펫팅으로 용액을 혼합합니다. TSM 배지의 ALR과 항체를 둥근 바닥 멀티 웰 플레이트 또는 호박색 튜브에 혼합하고 빛으로부터 보호하십시오.

최종 분석 농도의 3배에서 웰 당 25 마이크로리터를 분주하기에 충분한 양의 배지를 준비한 다음, 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. TSM 배지에서 BSR을 1.5 밀리몰 농도로 희석하여 분석 종료 시 0.5 밀리몰의 최종 농도를 얻습니다. 그런 다음 NS가 앉아있는 우물의 바닥을 만지지 않고 NS의 존재를 육안으로 확인하면서 각 웰에서 75 마이크로 리터의 배지를 부드럽게 천천히 제거합니다.

25 마이크로 리터의 BSR 및 ALR 항체 복합체를 각 웰에 부드럽게 첨가하고 ALR 항체 복합체를 2-3 분 동안 배지와 혼합시킵니다. 도립 현미경을 사용하여 각 NS가 우물 바닥의 중앙에 위치하는지 확인합니다. 바늘을 사용하여 기포를 제거하여 기포가 형성되지 않도록 하십시오.

접시 바닥이 차가워지도록 접시를 얼음 위에 5분 동안 놓습니다. 기포 형성을 방지하고 웰 바닥에 닿도록 미리 냉각된 P200 팁을 웰의 내부 벽에 배치하여 웰당 75마이크로리터의 BMM을 분배합니다. BMM이 매체와 섞일 수 있도록 접시를 얼음 위에 5분 동안 두십시오.

도립 현미경을 사용하여 NS의 위치를 확인하십시오. 그리고 중앙에 존재하지 않는 경우, 플레이트를 섭씨 4도에서 180 x G에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 95%로 설정된 인큐베이터 내에 놓인 살아있는 세포 분석 장비에서 플레이트를 옮깁니다. 웰이 BMM으로 코팅되면 P200 팁을 자릅니다.

선택된 각 웰로부터 50 마이크로리터의 세포 배지 및 NS를 취하여 코팅된 평평한 바닥 웰로 옮긴다. 각 웰에서 NS의 존재와 위치를 육안으로 확인하십시오. 희석된 BSR 및 ALR 항체 50마이크로리터를 각 웰에 부드럽게 첨가하고 시약이 혼합될 때까지 2-3분 동안 기다립니다.

그리고 도립 현미경을 사용하여 대부분의 복제 NS가 웰 중앙에 위치하는지 확인합니다. 기포가 없는지 확인한 후 이전에 시연된 대로 플레이트를 생세포 분석 장비로 부드럽게 옮깁니다. 라이브 셀 분석 기기 소프트웨어에서 획득할 일정 옵션을 선택한 다음 더하기 탭을 클릭하고 일정에 따라 스캔을 선택하여 텍스트 원고에 언급된 간격으로 플레이트를 스캔합니다.

소프트웨어 창에서 선박을 생성하거나 복원한 다음 새로 만들기 옵션을 클릭합니다. 스페로이드 스캔 유형, 위상 및 명시야, 침습 분석을 위한 녹색 이미지 채널 및 4X 대물렌즈를 선택합니다. 희석 클로닝 스캔을 선택하고 4X 대물렌즈를 입력한 다음 이동 분석을 위해 위상 및 녹색을 선택합니다.

플레이트 유형을 선택하고 플레이트 맵에서 강조 표시하여 스캔할 웰을 정의한 다음 스캔 빈도를 설정합니다. Add to Schedule(일정에 추가)을 클릭하고 스캔을 시작합니다. Create New Analysis Definition(새 분석 정의 생성) 탭을 선택합니다.

그런 다음 탭에서 침입 및 이동을 위한 스페로이드 침입 또는 기본 분석기 응용 프로그램을 각각 선택합니다. 이미지 채널에서 침입 및 마이그레이션 적절한 채널을 선택합니다. 해석 설정을 미리 보고 구체화하기 위해 3개에서 4개의 웰 중에서 몇 개의 대표 이미지를 선택합니다.

침습 분석의 경우, 분석 정의 탭에서 명시야 및 녹색 채널의 애플리케이션 설정을 텍스트 원고에 언급된 설정으로 조정하여 스페로이드와 침입 세포 간의 정확한 분할을 생성합니다. 이동 분석의 경우, 위상 및 녹색 채널에서 텍스트 원고에 언급된 대로 응용 프로그램 설정을 조정하여 합류 세포와 녹색 세포 사이의 정확한 분할을 생성합니다. 여러 웰을 임의로 클릭하여 NS에 대한 분석 설정이 올바른지 확인합니다.

분석할 웰과 시점을 선택합니다. 해석 정의를 저장하고 마침(Finish)을 클릭합니다. 원발성 DMG 환자 유래 세포에서 CD44 발현의 대표적인 면역형광 공초점 이미지는 세포 이동 및 침습에서 CD44의 역할을 입증했습니다.

살아있는 3D 세포 면역화학을 통해 CD44 발현을 시각화할 수 있습니다. 이동 및 침입 모두에 대한 시간 경과의 대표적인 프레임은 시간이 지남에 따라 관찰된 동일한 세포에서 녹색 형광 신호의 존재 및 부재를 보여주며, 이는 세포가 이동 및 침입하는 동안 CD44의 발현이 켜졌다 꺼졌다는 것을 시사합니다. 이동 및 침윤 과정을 96시간 동안 추적하여 높은 수준의 CD44를 가진 QCTB-R059 세포를 보여줍니다.

CD44 발현의 정량화 및 시간 경과에 따른 그의 증가는 이동 및 침습 모두에 대해 ALR과 관련된 전체 녹색 형광 신호에 의해 측정되었다. 항-CD44 항체가 살아있는 세포에 사용되면 세포 형태에 영향을 미치고 중간엽 유사에서 아메보이드 유사 침윤으로의 전환과 이러한 세포의 침습 및 이동 능력의 감소를 유도합니다. 이 방법의 가장 중요한 단계는 표지 시약과 항체의 혼합, Matrigel 및 배지에 혼합물의 첨가, 살아있는 세포 이미징 기기에 대한 접근입니다.

이 방법은 직접 세포 및 접촉에 의해 매개되는 DMG 세포 상호작용을 조사하기 위해 2개 이상의 독특한 표지 시약 및 항체를 사용함으로써 추가로 구현될 수 있다. 우리의 방법은 DMG 이동 및 침입의 세포 및 분자 메커니즘을 3D로 조사할 수 있는 새로운 도구를 제공하여 침윤 표현형을 억제하기 위한 새로운 방향을 제공합니다.