Name: 오픈 소스 실험실 로봇에 의해 자동화 된 산탄총 프로테오믹스 샘플 처리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 학습하세요 저비용 오픈 소스 로봇 액체 처리 시스템을 활용한 단백질 생화학 샘플 준비 자동화 방법입니다. 이 프로토콜은 질량 분석 전 처리 과정의 처리량을 높이고 변이성을 줄여 프로테오믹스 연구의 효율성을 향상시킵니다.

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<ol><li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).</li>
<li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li>
<li>Yeung, Y. -G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+detergents+from+protein+digests+for+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis.</a> Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).</li>
<li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).</li>
<li>Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bottom-up+proteomics+depends+on+digestion+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).</li>
<li>Elliott, K. C., Resnik, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientific+reproducibility%2C+human+error%2C+and+public+policy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%22%5BJournal%5D)">Scientific reproducibility, human error, and public policy.</a> Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).</li>
<li>Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Issues+with+data+and+analyses%3A+Errors%2C+underlying+themes%2C+and+potential+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li>
<li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+multiplex+LC-MS%2FMS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I%2C+B%2C+C-I%2C+C-II%2C+C-III%2C+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li>
<li>Müller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111(2020).</li>
<li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li>
<li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li>
<li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona%3A+experimental+methods+for+big+data%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li>
<li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li>
<li>Web URL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021).</li>
<li>Web URL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021).</li>
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 <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021).</li>
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<li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138(2020).</li>
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저자는 선언할 충돌이 없습니다.

프로토콜 내의 중요한 단계 최상의 성능을 위해 OT-2와 호환되는 Opentrons 검증 된 labware, 모듈 및 소모품을 사용해야합니다. 사용자 지정 랩웨어는 Reference14에서 Opentrons의 지시에 따라 만들 수 있습니다. 처음으로 사용할 때 OT-2 데크, 파이펫 및 랩웨어를 교정해야 합니다. 또한 펩티드와 단백질 정화를 위한 구슬을 준비하기 위해 SP3 구슬 제조업체의 지침을 따르는 것도 중요합니다. 특히, 비드 및 펩타이드 결합 반응 동안, 결합 반응의 아세토니톨의 부피는 ≥95%여야하며, 비드 농도는 ≥0.1 μg/μL이어야 한다. 여기서 펩티드 클린업 스크립트에서 최적화된 파라미터를 사용하면 아세토닐트릴 부피 비율은 95%, 비드 농도는 0.37 μg/μL이며 펩타이드 농도는 14-37 μg/mL 범위에 있습니다. 펩티드 질량은 우리의 경험에서 소화 반응의 100 μL에서 40-100 μg로 추정된다. SP3 단백질 정화의 ...

질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스는 생물학적 시료에 많은 단백질의 풍부를 동시에 측정하는 강력한 도구입니다. 생물 정보학 분석을 사용한 프로테오믹스 실험은 일상적으로 생체 마커를 식별하고 병리학 적 메커니즘을 뒷받침하는 관련 생물학적 복합체 및 경로를 발견하기 위해 일상적으로 사용됩니다. 높은 분석 특이성 및 잠재적 정량적 정확도를 갖춘 산탄총 프로테오믹스는 항체에 의존할 필요 없이 임상 샘플 분석을 위한 연구 시설 및 진단 실험실에서 채택될 수 있는 우수한 잠재력을 가지고 있습니다1,2.
산탄총 프로테오믹스 분석을 위한 단백질 샘플을 준비하려면 생물학적 샘플(예: 세포 및 조직)에서 추출한 단백질은 일반적으로 시료 단백질 농도, 단백질 감소 및 알킬레이션 측정, 펩타이드로효소 소화 를 측정하는 것을 포함하여 긴 프로토콜을 사용하여 처리되어야 합니다. 더욱이, 세제를 함유하는 일반적인 용해 완충제에서 추출된 단백질은 종종 세제가 트립신 소화를 방해하고 다운스트림 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 분석3의 성능을 현저히 저하시킬 수 있기 때문에 분석 전에 완충교환 또는 세제 제거의 추가 단계가 필요합니다. 펩타이드는 전형적으로 효소 소화에 따른 LC-MS/MS 호환 용매에서 더 탈염, 건조 및 재구성된다. 이러한 단백질 생화학 절차는 노동 집약적이고 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 따라서 프로테오믹스 워크플로우의 처리량을 계속 제한하고 획득한 data4,5의 가변성에 기여합니다. 인간의 오류와 편견은 데이터 분산 및 재현성에 영향을 미치는 중요한 요인으로 인식되어 왔습니다6,7. 대량 분광샘플 준비 워크플로우에서 인간의 오류를 최소화하기 위해, 자동화된 파이펫팅 로봇 시스템은 산탄총 프로테오믹스및 표적 질량 분광분석에서 단백질 식별 및 정량화의 처리량 과 재현성을 개선하기 위해 활용되었으며, 이러한 발전은 연구 및 임상 설정에서 중요한 프로테오믹스 기술의 광범위한 채택을 계속하는 데 중요한 역할을 해왔습니다. 9,10,11,12,13. 그러나 대부분의 기존 프로토콜은 상당한 투자와 교육이 필요한 로봇 액체 처리 플랫폼을 활용하여 학업 환경이나 제한된 예산으로 많은 실험실에서 유틸리티를 제한합니다.
이 문서에서는 일반적인 산탄총 프로테오믹스 샘플 준비 워크플로우를 반 자동화하기 위해 저렴한 오픈 소스 로봇 액체 처리 시스템인 OT-2를 사용하는 프로토콜을 설명합니다. OT-2는 다른 많은 로봇 액체 처리 시스템보다 비용이 낮으며 작성 시 약 5,000 달러의 비용이 듭니다. 다른 모듈 과 labware의 가격을 고려할 때, 쓰기 의 시간에이 프로토콜에 실험을 설정하는 총 비용은 약 $10,000, 이는 더 비싼 옵션을 통해 실험실의 상당히 넓은 세트에 더 저렴 렌더링. OT-2는 파이썬 스크립트를 통한 오픈 소스 프로그래밍과 호환되며 사용자 정의 DIY 프로토콜 설계에서 뛰어난 유연성을 제공합니다. 사내 개발된 3개의 스크립트를 사용하여, 아래 프로토콜은 정형 단백질 표준(소 혈청 알부민)을 가진 OT-2 스테이션에서 전형적인 산탄총 프로테오믹스 샘플 준비 워크플로우를 실행한다. BSA) 및 정상적인 인간 심장 리자테의 복잡한 단백질 샘플(도 1). (1) BSA 샘플 및 (2) 복잡한 심장 용해 샘플을 처리하는 절차는 각각 프로토콜 섹션 1, 2, 5, 6 및 3, 4, 5, 6에 상세합니다. 세라-매그 카복틸레이트 변형 마그네틱 비즈는 단백질 및 펩타이드 샘플에서 세제 및 염을 제거하기 위해 단일 냄비 고체 상 강화 시료 제제(SP3)에 활용된다. 소 세럼 알부민과 인간의 심장 단백질의 트립틱 소화는 SP3 구슬에 의해 더 세척되고 LC-MS/MS 분석을 위해 제출됩니다. 질량 스펙트럼은 펩티드 및 단백질 식별을 위한 MaxQuant 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 당사가 수행한 대표적인 결과는 프로토콜이 벤치 시간을 절약하면서 우수한 기술적 계수(CV)를 달성하고 손다이에 열등하지 않은 것으로 나타났습니다.

<table><tbody><tr><td>300 &마이크로; L 피펫 팁</td><td>Opentrons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-in-1 튜브 랙 세트</td><td>Opentrons</td><td></td><td>각 세트에는 2개의 베이스 스탠드와 4개의 튜브 홀더 상단(1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL 및 50mL)이 포함되어 있습니다. 이 연구에서는 2mL 및 15mL + 50mL 탑스를 사용합니다.</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC 컬럼</td><td>Thermo Scientific</td><td>#164568</td><td>3 &mu; m 입자; 100 &어링; 기공; 75 &뮤; m x 150 mm</td></tr><tr><td>아세토니트릴 LC-MS 등급</td><td>VWR</td><td>#JT9829</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 블록 세트</td><td>Opentrons</td><td></td><td>이 블록 세트에는 96-well, 2.0 mL 튜브 및 OT-2 온도 모듈과 함께 사용할 수 있는 PCR 스트립과 호환되는 3개의 탑이 포함되어 있습니다. 이 원고에서는 2.0mL 튜브 홀더를 사용합니다.</td></tr><tr><td>암모늄 바이카보네이</td>트 <td>Sigma-Aldrich</td><td># A6141</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 표준, 2mg/mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23210</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO) LC-MS 등급</td><td>Thermo Scientific</td><td>#85190</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨</td><td>시그마-알드리치</td><td>#D5545</td><td></td></tr><tr><td>EASY-Spray HPLC 컬럼</td><td>Thermo Scientific</td><td>#ES800A</td><td></td></tr><tr><td>EasynLC 1200 Nano LC</td><td>Thermo Scientific</td><td>#LC140</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol Proof 195-200</td><td>Fisher</td><td>#04-355-720</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid LC-MS grade</td><td>Thermo Scientific</td><td>#85178</td><td></td></tr><tr><td>Human heart lysate</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB820-59217</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#I1149</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic tube rack</td><td>Thermo Scientific</td><td>#MR02</td><td></td></tr><tr><td>MAXQuant v.1.6.10.43</td><td></td><td></td><td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td></tr><tr><td>mySPIN 6 미니 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>#75004061</td><td>빠른 회전을 위한 벤치탑 미니 원심분리기</td></tr><tr><td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td><td>Opentrons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OT-2 마그네틱 모듈</td><td>Opentrons</td><td></td><td>GEN1</td></tr><tr><td>OT-2, P300 단일 채널 피펫</td>, <td>Opentrons,</td><td></td><td>GEN1</td></tr>, <tr><td>OT-2, P50, 단일 채널 피펫</td>, <td>Opentrons,</td><td></td><td>GEN1</td></tr>, <tr><td>OT-2 로봇 피펫팅 로봇</td><td>, Opentrons,</td><td>OT-2</td><td></td></tr>, <tr><td>OT-2 온도 모듈</td>, <td>Opentrons,</td><td></td><td>GEN1</td></tr><tr><td>Pierce, 정량 비색 펩타이드 분석</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>#23275</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind tubes 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#022431102</td><td></td></tr><tr><td>Protein Sequence Database</td><td>UniProt/SwissProt</td><td></td><td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20검토됨:yes</td></tr><tr><td>Sera-Mag SpeedBead 카르복실레이트 변형 자성 입자, 소수성</td><td>Cytiva</td><td>#65152105050250</td><td></td></tr><tr><td>Sera-Mag SpeedBead 카르복실레이트 변형 자성 입자, Hydrophylic</td><td>Cytiva</td><td>#45152105050250</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>진공 증발기</td></tr><tr><td>Thermo Q Exactive HF 질량 분석기</td><td>Thermo Scientific</td><td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin MS 등급</td><td>Thermo Scientific</td><td>#90057</td><td></td></tr><tr><td>Water LC-MS 등급</td><td>VWR</td><td>#BDH83645.400</td><td></td></tr></tbody></table>

오픈 소스 실험실 로봇에 의해 자동화 된 산탄총 프로테오믹스 샘플 처리

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스 실험은 효소 단백질 소화 및 정리를 포함한 여러 샘플 준비 단계가 필요하며, 이는 상당한 시간의 벤치 노동을 수용하고 배치 대 배치 가변성의 원천을 제시할 수 있습니다. 파이펫팅 로봇을 통한 실험실 자동화는 수동 작업을 줄이고, 처리량을 최대화하며, 연구 재현성을 높일 수 있습니다. 여전히, 표준 자동화 스테이션의 가파른 시작 가격은 많은 학술 실험실에 대한 저렴한 합니다. 이 문서에서는 반자동 단백질 감소, 알킬레이션, 소화 및 정화 단계를 설정하는 지침을 포함하여 저렴한 오픈 소스 자동화 시스템(Opentrons OT-2)을 사용하여 프로테오믹스 샘플 준비 워크플로우에 대해 설명합니다. 뿐만 아니라 응용 프로그램 프로그래밍 인터페이스를 통해 OT-2 시스템을 프로그래밍하는 오픈 소스 파이썬 스크립트를 동반.

3개의 파이썬 스크립트는 OT-2 로봇과 호환되며, 단일 단백질 표준 소 혈청 알부민(기술적으로 복제n = 5 소화)과 세제 함유 인간 심장 리자테 샘플(n= 5 소화)을 사용하여 질량 분광법 프로테오믹스에 대한 샘플 준비를 수행하는 여기에 제공됩니다. 각 다이제스트 제품은 두 개의 펩타이드 정리 반응으로 분할됩니다. BSA 및 심장 샘플의 각 실행에서 확인된 펩티드 스펙트럼 일치(PSM), 펩티드 및 단백질의 수는 도 4 및 도 5로 도시된다. 728PSM과 65펩타이드의 중앙값은 BSA 샘플로 확인되었으며, 각각 5.2%와 3.2%의 변이 계수(CV)가 확인되었다. 복잡한 심장 시료로 9,526PSM, 7,558펩타이드 및 1,336개의 단백질의 중앙값이 7.6%, 5.9%, 변이계 3.6%로 10런중에서 확인되었다. 총 1,935개의 단백질이 심장 샘플의 10개의 실행에서 확인되었으며, 그 중 1,677개의 단백질이 ...

상세한 프로토콜과 3개의 Python 스크립트는 광원 로봇 액체 처리 시스템을 운영하여 세제 제거, 단백질 소화 및 펩타이드 탈염 단계를 포함하는 대량 분광 실험에 대한 반자동 단백질 샘플 준비를 수행하기 위해 제공됩니다.

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

이 프로토콜은 대량 분광 실험 전에 단백질 생화학 제제를 수행하기 위해 자동화를 사용하여 프로테오믹 연구에 대한 더 높은 처리량과 낮은 가변성을 허용합니다. 이 프로토콜은 더 많은 실험실에 저렴한 저비용 프로그래밍 가능한 액체 처리 시스템을 사용합니다. 우리는 추가 개발을 위해 수정 할 수있는 오픈 소스 Python 스크립트를 제공합니다.절차를 시연하는 것은 밀턴 아마야, 우리의 실험실에서 석사 학생이 될 것입니다. 시작하려면 noSP3_Digestion 엽니다. 텍스트 편집기의 py 스크립트를 지정하고 사용자 지정 여기만 지정 섹션에서 필요에 따라 실험별 변수를 지정합니다.그런 다음 Opentrons 앱을 열고 Opentrons 앱의 프로토콜 탭에 스크립트를 업로드합니다. 다음으로 파이썬 스크립트에 지정된 OT2 데크의 해당 위치에 필요한 랩웨어와 파이펫을 배치합니다. 그런 다음, 15밀리리터 플러스 50 밀리리터 튜브 홀더 상단을 가진 4-in-one 튜브 랙의 A1 웰에 암모늄 중탄산염 용액을 배치하고 2밀리리터 튜브 홀더 상단이 있는 4-in-1 튜브 랙의 A1 웰에 단백질 샘플을 배치합니다.A1에서 시작하여 수직으로 아래로 이동, 온도 모듈의 상단에 배치 알루미늄 블록의 우물에 2 밀리리터 단백질 저결합 튜브를 수동으로 배치합니다. 그런 다음 DTT 용액을 4-in-one 튜브 랙의 A6 웰에 2밀리리터 튜브 홀더 상단을 배치합니다. 로봇이 알루미늄 블록의 샘플 튜브에 중탄산염 버퍼의 적절한 부피를 전송하는 동안 관찰한다.그런 다음 로봇 프로그램이 일시 중지되고 메시지를 표시하는지 수동으로 확인하여 프로토콜을 다시 시작하기 전에 슬롯 4에 있는 2밀리리터 튜브 랙의 A6에 DTT가 로드되었는지 확인합니다. DTT 튜브의 위치를 확인하고 튜브 캡을 연 후 Opentrons 앱의 이력서 버튼을 클릭하여 계속합니다. 로봇이 DTT 솔루션의 10마이크로리터를 각 샘플에 잘 전송하고 5개의 혼합 라운드를 전달합니다.그런 다음 로봇 프로그램이 일시 중지되어 메시지를 표시하고 샘플 튜브에서 캡을 닫아야 합니다. 그런 다음 튜브의 캡을 수동으로 닫고 다시 시작하려면 클릭합니다. 로봇의 온도 모듈이 알루미늄 블록을 가열하기 시작하고 온도가 섭씨 55도에 도달하고 5 분 배양하여 샘플이 섭씨 55도까지 얻을 수 있도록 기다립니다.로봇은 DTT에 의한 단백질 감소를 허용하기 위해 30 분 동안이 온도를 유지합니다. 인큐베이션 중에 요오도아세타미드 용액을 준비하고 알루미늄 호일로 수동으로 감싸빛에 노출되지 않도록 하십시오. 인큐베이션 후 로봇의 프로그램이 일시 중지되고 경고 메시지가 표시되면 샘플 튜브에서 캡을 열고 샘플 튜브를 제한 해제하고 다시 시작하려면 클릭하십시오.다음으로, 로봇의 프로그램이 경고 메시지와 함께 일시 중지되었는지 수동으로 확인하고, 프로토콜을 재개하기 전에 슬롯 4에 있는 2밀리리터 튜브 랙의 B6에 요오도아세타미드가 로드되었는지 확인합니다. 요오도아세타미드 튜브의 랙 위치를 확인하고 튜브 캡을 연 후, Resume를 클릭하고 로봇이 각 샘플 튜브에 요도아세타미드 용액의 10 마이크로리터를 전송하고 5개의 혼합 라운드를 전송하도록 합니다. 로봇의 프로그램이 일시 중지되고 메시지가 표시되면 샘플 튜브의 캡을 닫고 샘플 튜브를 캡으로 덮은 다음 깨끗한 호일로 알루미늄 블록 전체를 덮고 Resume를 클릭하여 계속합니다.샘플이 섭씨 22도에서 30분 동안 배양될 때까지 기다린 후, 이오도아세아미드 인큐베이션이 완료되면 로봇의 온도 모듈이 비활성화되도록 하십시오. 로봇의 프로그램이 일시 중지되고 경고 메시지가 표시되면 트립신이 프로토콜을 재개하기 전에 슬롯 4에 있는 2 밀리리터 튜브 랙의 C6에 로드되었는지 확인하고 튜브 캡이 열려있는 2 밀리리터 튜브 랙의 C6 웰에 트립신 솔루션을 배치하고 이력서를 클릭하여 계속하십시오. 그런 다음 로봇의 프로그램이 일시 중지되고 경고 메시지가 표시되면 온도 모듈의 샘플 튜브에 캡을 열고 샘플 튜브를 뚜껑을 열고 다시 시작하려면 다시 시작합니다.로봇이 트립신 10마이크로리터를 각 샘플 튜브로 옮기고 5개의 혼합 라운드를 전송하는 동안 대기합니다. 하룻밤 동안 트립신 소화 후 벤치탑 미세 원심 분리기를 사용하여 샘플을 잠시 회전시키고 샘플을 자기 튜브 랙에 놓습니다. 2분 후, 피펫으로 상체를 새로운 단백질 저결합 미세원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮기고 샘플을 냉장고에 보관합니다.다음으로 SP3_peptide_cleanup 엽니다. 텍스트 편집기의 py Python 스크립트를 지정하고 사용자 지정 여기만 하는 섹션에서 필요에 따라 실험 변수를 지정합니다. 그런 다음 Opentrons 앱의 프로토콜 탭에 스크립트를 업로드합니다.파이썬 스크립트에 지정된 OT2 데크의 해당 위치에 필요한 랩웨어와 파이펫을 배치하고 자기 모듈이 켜져 있고 로봇에 연결되어 있는지 확인합니다. 마그네틱 모듈 상단에 새로운 2밀리리터, 96웰 의 깊은 웰 플레이트를 놓습니다. 다음으로, 소화된 샘플을 A1에서 시작하여 세로로 아래로 이동하는 2밀리리터 튜브 랙에 놓습니다.그런 다음, 로봇이 소화된 시료의 55마이크로리터를 자기 모듈의 깊은 우물판의 우물로 전송합니다. 로봇 프로토콜이 일시 중지되고 메시지를 표시하는지 확인하고, 준비된 구슬이 프로토콜을 재개하기 전에 슬롯 4에 있는 2밀리리터 튜브 랙의 A6에 로드되었는지 확인합니다. 그런 다음, 소용돌이와 잠시 미니 벤치 탑 원심 분리기에서 SP3 구슬을 회전하고 캡을 열고 2 밀리리터 튜브 랙의 A6 우물에 배치합니다.로봇 프로그램이 일시 중지되고 메시지를 표시하는지 확인하면 프로토콜을 재개하기 전에 슬롯 5에 위치한 15 밀리리터 의 A4에 80 %의 에탄올이 로드되었는지 확인하십시오. 그런 다음 튜브 랙에 A4에 80% 에탄올 용액을 잘 배치하고 Resume를 클릭하여 계속합니다. 로봇이 파이프팅 속도를 느리게 바꾸고, 각 우물에서 상퍼를 흡인하고, 폐튜브에 분배하는 동안 관찰한다.로봇이 파이펫팅 속도를 다시 기본값으로 변경하고 자기 모듈을 분리할 때까지 기다립니다. 로봇 프로그램이 일시 중지되고 메시지를 표시하면, 심모늄 중탄산 튜브에 캡을 열고, 암모늄 중탄산염 용액의 캡을 열고, 이력서를 클릭하여 계속합니다. 로봇이 자기 모듈을 분리하는 동안 대기, 각 우물에 암모늄 중탄산염 버퍼의 250 마이크로 리터를 전송하고, 즉시 10 시간 동안 혼합.그런 다음, 로봇이 파이프팅 속도를 느리게 변경하는 동안 관찰하고, 각 우물에서 폐기물 튜브로 상수체를 전송합니다. 로봇이 각 우물에 암모늄 중탄산염 버퍼의 100 마이크로 리터를 전송하고 즉시 10 번 혼합 될 때까지 기다립니다. 로봇 프로그램이 일시 중지되고 메시지를 표시하는지 확인하고 프로토콜을 다시 시작하기 전에 새로운 수집 튜브가 2밀리리터 알루미늄 블록에 배치되었는지 확인합니다.그런 다음, 마지막 샘플 튜브 직후 알루미늄 블록에 저단백질 보존 마이크로센심분리기 튜브의 새로운 세트를 배치하고, 계속하려면 Resume를 클릭합니다. 로봇이 심모늄 중탄산염 버퍼의 각 샘플을 새로운 2 밀리리터 튜브로 전송하는 동안 대기합니다. 로봇의 프로그램이 일시 중지되고 메시지를 표시하면 트립신이 프로토콜을 재개하기 전에 슬롯 4에 있는 2 밀리리터 튜브 랙의 C6에 로드되었는지 확인하고 튜브 캡이 열려있는 2 밀리리터 튜브 랙의 C6 웰에 트립신 솔루션을 배치하고 이력서를 클릭하여 계속합니다.프로그램이 실행완료되면, 파라핀 필름으로 샘플 튜브 캡을 감싸고, 모든 샘플을 온도 제어 믹서로 옮기고, 1, 000 RPM 흔들림으로 16~20시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. BSA 샘플을 사용하면 728펩타이드 스펙트럼 일치 및 65펩타이드의 배지가 각각 5.2%와 3.2%의 변이계로 확인되었다. 복잡한 심장 샘플을 통해 9, 526 펩티드 스펙트럼 일치, 7, 558 펩타이드 및 1, 336 단백질의 배지가 각각 7.6%5.9%와 3.6%의 변이계로 10런에서 확인되었다.펩티드 정량화의 가변성을 결정하기 위해, 추출된 이온 크로마토그램 강도의 변이계는 독특한 단백질을 매핑하는 10개의 펩타이드에 대해 계산되었다. 인간 대 로봇 실험 결과의 가변이 BCA 분석과 비교했을 때, 로봇 BCA 분석의 평균 계수는 인간 매뉴얼 BCA 분석보다 낮았다. 이 프로토콜은 각 샘플을 처리하는 벤치 시간을 줄입니다.그것은 우리가 다중 약물 치료 사이 세포주 패널에 있는 proteomics 다름을 탐구하는 쪽을 포장합니다.

shotgun-proteomics-sample-processing-automated-an-open-source-lab

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

전기 분야의 응용 프로그램에 의해 전극의 배열에 - 디지털 Microfluidics는 개별 방울 (ML ~ NL)의 조작에 의해 특징 기법입니다. 그것은 빠른 속도, 순차, 소형 자동 생화학 assays을 수행에 적합합니다. 여기서 우리는 몇 가지 proteomic 처리 단계를 자동화 할 수있는 플랫폼을보고합니다.

자동 Proteomic 처리를위한 디지털 Microfluidics

이 비디오는 전사 인자와 DNA 간의 상호 작용을 모니터링하는 데 도움이 되는 고성능 형광 이방성에 대해 설명합니다. 이 분석은 형광단으로 표지된 DNA의 분자 회전 또는 이방성으로 인한 편광 정도를 측정하여 형광단으로 표지된 DNA 분자와 특정 전사 인자의 상호 작용을 모니터링합니다.

Transcription Factor-DNA Binding Affinity를 결정하기 위한 형광 이방성

TruTip은 다공성, 모 놀리 식 바인딩 행렬 피펫 팁에 삽입 그것에 간단한 핵산 추출 기술입니다. 따라서, 샘플 준비 형식은 대부분의 액체 취급 장비와 호환되며, 높은 처리량 임상 응용 및 샘플 유형에 여러 매체에 사용할 수 있습니다.

일반적인 액체 취급 로봇에 TruTip 기술을 사용하여 임상 샘플에서 DNA와 RNA의 높은 처리량, 자동 추출

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

여기 우리는 큰 규모에 높은 감도 가진 평형에서 및 솔루션에서 바인딩 선호도 결정 하기 위한 새로운 방법을 제시. 이 녹음 방송 요인 DNA 바인딩의 정량 분석을 향상 시킵니다. 메서드를 사용 하면 제어 전달 시스템에 자동화 된 형광 이방성 측정을 기반으로 합니다.

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

여기서, 우리는 질량 분광법 기반 정량적 단백질 분석을 위한 자동화된 혈장 단백질 소화 방법을 제시한다. 이 프로토콜에서는 단백질 변성, 감소, 알킬화 및 트립신 소화 반응을 위한 액체 전달 및 배양 단계가 간소화되고 자동화됩니다. 원하는 정밀도로 96웰 플레이트를 준비하는 데는 약 5시간이 걸립니다.

자동화된 워크스테이션을 사용한 질량 분석법을 위한 플라즈마 시료 준비

결합된 전구체 동위원소 라벨링 및 동위원소 태그(cPILOT)는 사용 가능한 동면 태그와 함께 동시에 분석할 수 있는 샘플 수를 증가시킬 수 있는 향상된 샘플 멀티플렉스 전략입니다. 로봇 플랫폼의 통합은 실험 처리량, 재현성 및 정량적 정확도를 크게 증가시켰습니다.

결합된 전구체 이소토픽 라벨링 및 동서성 태그(cPILOT)를 사용하여 자동화된 샘플 멀티플렉스

설명된 프로토콜은 라벨 기반 및 라벨 자유 양수의 두 가지 접근법을 사용하여 조직 샘플의 최적화된 정량 적 프로테오믹스 분석을 제공합니다. 라벨 기반 접근법은 단백질의 보다 정확한 양을 얻을 수 있는 장점이 있으며, 라벨없는 접근법은 비용 효율적이며 코호트의 수백 가지 샘플을 분석하는 데 사용됩니다.

조직 샘플의 질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스의 포괄적인 워크플로우

NMR에 의한 단편 기반 스크리닝은 생체고분자(DNA, RNA 또는 단백질)에 대한 소분자 결합제를 신속하게 식별하는 강력한 방법입니다. 자동화 기반 시료 전처리, NMR 실험 및 획득 조건, 분석 워크플로우를 설명하는 프로토콜이 제시됩니다. 이 기술은 검출을 위해 1H 및 19FNMR 활성 핵 모두를 최적으로 이용할 수 있습니다.

최소 샘플이지만 최대 자동화 모드에서 NMR 기반 단편 스크리닝

Shotgun 질량분석법 기반 지질체학은 다양한 설치류 조직에서 한 번의 측정으로 광범위한 지질 등급에 대한 민감한 정량적 스냅샷을 동시에 제공합니다.

설치류 조직의 산탄총 지질체

학습하세요 저비용 오픈 소스 로봇 액체 처리 시스템을 활용한 단백질 생화학 샘플 준비 자동화 방법입니다. 이 프로토콜은 질량 분석 전 처리 과정의 처리량을 높이고 변이성을 줄여 프로테오믹스 연구의 효율성을 향상시킵니다.

오픈 소스 실험실 로봇에 의해 자동화 된 산탄총 프로테오믹스 샘플 처리

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