설치류의 머리에서 정의된 가속도를 생성하기 위한 수동 머리 움직임의 적용
2022년 7월 21일
본 프로토콜은 적당한 속도로 러닝머신을 달리는 동안 생성된 설치류의 머리에서 기계적 가속도를 재현하는 맞춤형 '패시브 헤드 모션'' 시스템을 설명합니다. 그것은 신체 운동의 유익한 효과로부터 기계적 요인 / 요소를 해부 할 수 있습니다.
우리의 프로토콜은 신체 운동이 유기체 항상성을 지원하는 방법에 대한 질문에 답하는 데 도움이됩니다. 이 시스템을 통해 걷기 및 조깅과 같은 신체 활동의 복잡한 결과로부터 뇌에 대한 직접적인 기계적 영향을 해부 할 수있었습니다. 시작하려면 수술 용 테이프를 사용하여 쥐의 머리 위에 가속도계를 고정하십시오.
마취에서 완전히 회복 된 후, 쥐를 러닝 머신 기계에 넣으십시오. 런닝 머신을 분당 20 미터의 적당한 속도로 조정하십시오. 응용 소프트웨어를 사용하여 쥐가 트레드밀을 작동할 때 X, Y 및 Z축을 따라 수직 가속도의 크기를 측정합니다.
소프트웨어에서 얻은 값을 PHM 시스템의 수직 가속 주파수 크기와 일치시킵니다. 플랫폼의 진동 진폭과 프로펠러 모양의 캠의 회전 속도를 미리 설정합니다. 그런 다음 마우스를 엎드린 위치에 놓고 헤드는 발진기에 있고 나머지 몸체는 정적 플랫폼에 놓습니다.
모터를 켜서 플랫폼을 수직으로 진동시키고 PHM을 마우스에 적용합니다. 투명한 플라스틱 케이스에 비디오 카메라를 24FPS의 프레임 속도로 설정하여 전체 공간을 녹화합니다. 다음으로, 마우스에 5 개의 하이드 록시 트립토판을 복강 내 투여한다.
마우스를 투명 케이지에 넣고 30 분 동안 녹화를 시작하십시오. 녹화 된 비디오를 0.5x 속도로 검토하고 수동으로 머리 경련을 계산합니다. 슬라이드 상자에서 마우스 뇌의 냉동 절개를 검색합니다.
샘플이 완전히 탈수될 때까지 슬라이드를 실온에서 깨끗한 물티슈에 그대로 두십시오. 액체 차단제 펜을 사용하여 냉동 절단 조직 주위에 원을 그립니다. 그런 다음 TBS-T 솔루션을 추가하십시오.
트레이 바닥에 젖은 물티슈를 놓아 슬라이드를 위한 촉촉한 환경을 만듭니다. TBS-T로 투과 제거한 후 차단을 위해 4 % 당나귀 혈청을 넣고 실온에서 1 시간 동안 배양합니다. TBS-T에 5 분 동안 담가 슬라이드를 한 번 헹굽니다.
그런 다음 각 슬라이드에 적절하게 희석된 1차 항체와 dappy 믹스 100마이크로리터를 적용합니다. 트레이를 덮고 실온에서 밤새 배양하십시오. 배양 후 TBS-T로 각각 5 분 동안 세 번 헹굽니다.
적절하게 희석된 종 일치 형광 2차 항체 100 마이크로리터를 적용하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. TBS-T로 각각 5분 동안 3회 헹군 후 장착 매체로 슬라이드를 장착하고 커버 슬립으로 슬라이드를 덮습니다. 장착 후 형광 현미경으로 샘플을 봅니다.
PHM 시스템은 러닝 머신 달리기 동안 쥐의 머리와 동등한 약 1.0 배 G에서 수직 가속 피크를 생성하도록 조정되었습니다. 마우스에 PHM을 적용하면 전두엽 피질 뉴런에서 5-HT2A 수용체 신호 전달에 대한 PHM의 억제 효과를 나타내는 대조군 마우스와 비교하여 머리 경련 반응이 크게 약화되었습니다. PHM에서 실행되는 러닝 머신은 5-HT2A 수용체 내재화 및 마우스 전두엽 피질 뉴런을 크게 향상 시켰습니다.
내재화 및 막 관련 5-HT2A 수용체 양성 영역의 정량화는 새로운 양성 영역에 비해 이러한 관찰을 확인하였다. 5-HT2A 수용체 양성 뉴런에서 c-Fos 발현의 면역염색 및 정량화는 PHM에서 실행되는 트레드밀이 5-HTP 유도 c-Fos 발현을 하향조절한다는 것을 보여주었다. 이것은 5-HT2A 수용체 활성화 및 마우스 PFC 뉴런의 하류 세포 이벤트입니다.
운동 효과의 기계적 측면을 조사하기 위해 머리 이외의 신체 부위에 기계적 개입을 적용할 수 있습니다.
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개요
본 연구에서는 새롭게 개발된 수동 머리 운동(passive head motion, PHM) 시스템을 통해 트레드밀 러닝과 같은 신체적 운동이 유기체의 항상성에 어떻게 영향을 미치는지 조사합니다. 쥐가 겪는 기계적 가속도를 시뮬레이션함으로써, 이 프로토콜은 기계적 요인과 그것이 뇌 기능에 미치는 구체적인 영향을 효과적으로 분리하여 분석합니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 신체 운동과 항상성
- 기계적 자극 수용의 신경과학
- 기계적 요인이 뇌 신호 전달 경로에 미치는 영향
배경
- 생리학적 조절에서 신체 활동의 역할
- 신경세포 반응에 미치는 기계적 영향
- 운동에 대한 뇌 반응 이해의 중요성
사용된 방법
- 맞춤 설계된 수동 두부 운동(PHM) 시스템
- 생물학적 모델로서의 설치류(쥐 및 생쥐)
- 뇌 분석을 위한 형광 염색 및 면역 조직 화학 분석
주요 결과
- PHM은 마우스의 머리 떨림 반응을 유의미하게 감쇄시켰음
- 전전두엽 피질 뉴런에서 5-HT2A 수용체의 내면화 증가
- 기계적 개입 후 c-Fos 발현의 하향 조절
결론
- 본 연구는 뇌에 미치는 기계적 영향력을 조사하기 위한 유효한 방법을 제시합니다.
- 연구 결과는 운동 생리학 및 신경 신호 전달에 대한 심층적인 이해에 기여합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
운동이 뇌 신호 전달에 미치는 직접적인 기계적 영향을 분석하는 것은 신경생물학적 타겟의 리스크를 줄이고 초기 발굴 단계에서 기전적 가설을 명확히 하는 데 매우 중요합니다. 수동 두부 운동(passive head motion, PHM) 시스템은 설치류의 머리에 정의된 기계적 가속도를 제어 가능하고 재현성 있게 전달함으로써, 기계적 자극 수용(mechanotransduction) 연구에 있어 예측 신뢰도를 높여줍니다. 이러한 기능은 신경정신질환 및 운동 관련 치료 프로그램의 타겟 검증과 중개 연구의 연속성을 위한 근거를 제공합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 운동으로 유도된 뇌 항상성에 관여하는 기계적 자극 전달 경로의 조사를 가능하게 합니다.
- 특정 신경세포군에서 세로토닌 수용체 신호 전달의 기능적 검증을 지원합니다.
- 기계적 효과와 전신적 운동 효과를 분리함으로써 기전적 리스크 감소를 용이하게 합니다.
- 경로 활성화 및 수용체 내면화에 대한 정량적 벤치마크를 제공합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 후속 신경약리학적 스크리닝을 위한 검증된 설치류 모델을 준비합니다.
- 재현 가능한 분석법 개발을 위해 기계적 자극 파라미터를 표준화합니다.
- 머리 가속도 프로파일 및 수용체 국소화 지표와 같은 정량적 결과물을 생성합니다.
- 기계적 자극 민감성 경로에 대한 화합물의 효과를 신뢰성 있게 평가할 수 있도록 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 인간의 운동에서 관찰되는 질병 관련 기계적 자극과 전임상 모델을 일치시킵니다.
- 기전 발견부터 바이오마커 기반의 전임상 검증까지의 연속성을 지원합니다.
- 신경정신과 및 운동 모사 후보 물질의 위험 조정된 진전을 위한 정보를 제공합니다.
- 기계적 신호 전달의 중개 바이오마커를 평가하기 위한 플랫폼을 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
PHM 시스템은 설치류 모델에서 기계적 신호 전달에 대한 가설 기반 테스트를 가능하게 함으로써 발견부터 전임상 단계까지의 연속체에 통합되며, 타겟 검증과 중개 바이오마커 개발을 모두 지원합니다.
- 기초 생물학 발견: 뇌 신호 전달 경로의 기계적 활성화에 대한 귀무가설 검정을 지원합니다.
- 스크리닝: 분석 표준화를 위해 재현 가능하고 정량적인 기계적 자극을 제공합니다.
- 분석: 가속도 프로파일, 수용체 내포 작용 및 c-Fos 발현과 같은 측정 가능한 결과물을 제공합니다.
- 중개 연구: 기전 연구 결과를 운동 및 신경정신과 연구와 관련된 전임상 모델로 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 기계적 신호 전달 및 신경생물학 연구를 위해 재사용 가능한 플랫폼을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 기전적 가설 및 타겟 검증에 대한 예측 신뢰도를 높임.
- 운영적 가치: 표준화되고 확장 가능하며 재현 가능한 기계적 자극 프로토콜을 가능하게 함.
- 전략적 가치: 뇌 타겟에 미치는 직접적인 기계적 영향을 명확히 하여 go/no-go 결정 과정을 개선함.
- 포트폴리오 영향: 신경정신질환 및 운동 모사 프로그램의 위험 조정 우선순위 설정을 지원함.
실행 시 고려 사항
- 설치류 핸들링, 신경생물학 및 정량적 이미징에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 제어된 기계적 자극 장치와 고해상도 형광 현미경 장비가 필요합니다.
- 자극 파라미터와 분석 종점(endpoint)에 대한 팀 간의 표준화가 요구됩니다.
- 설치류 종 및 운동 패러다임에 따른 적응을 위해 프로토콜 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 기계적 개입은 접근 가능한 신체 부위로 제한되며, 전신 운동 효과를 완전히 재현하지 못할 수 있습니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Measurement of Magnitudes of Accelerations and Adjustment of the PHM System
1:33
Quantification of Mouse Head-Twitch Response
2:03
Immunohistochemical Analysis of Prefrontal Cortex (PFC) Collected from Euthanized Mouse Brain
3:22
Results: Effect of Treadmill Running and PHM Application in Mouse PFC Neurons
4:37
Conclusion
