Name: 연속 흐름의 제조 및 작동, 투과화 감지 기능이 있는 미세 전기 천공 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 배우세요 미세유체 전기천장 장치 제조법으로 세포막 투과화를 실시간 모니터링하고 최적의 펄스 조건을 결정하는 방법입니다. HEK293 세포를 이용한 단일 세포 전기천장 및 고효율 유전자 전달 기술을 익힐 수 있습니다.

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저자는 국립 과학 재단 (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918)과 미국 교육부의 정밀 및 개인화 의학 신흥 분야의 대학원 교육 (P200A150131)의 재정 지원을 인정하고 싶습니다.

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<li>SU-8 2000 Permanent Negative Epoxy Photoresist. KAYAKU. , Available from: 
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<li>Beh, C. W., Zhou, W. Z., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS-glass+bonding+using+grafted+polymeric+adhesive+-+alternative+process+flow+for+compatibility+with+patterned+biological+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS-glass bonding using grafted polymeric adhesive - alternative process flow for compatibility with patterned biological molecules.</a> Lab on a Chip. 12 (20), 4120-4127 (2012).</li>
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<li>Lissandrello, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+continuous-flow+microfluidic+electroporation+of+mRNA+into+primary+human+T+cells+for+applications+in+cellular+therapy+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput continuous-flow microfluidic electroporation of mRNA into primary human T cells for applications in cellular therapy manufacturing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18045(2020).</li>
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이 프로토콜에 제시된 방법론은 주로 특수 전기 천공 실험 설정에 통합되는 미세 유체 장치의 미세 가공에 중점을 둡니다. 미세 가공 공정의 세부 사항을 설명 할 때 자주 사용되는 '레시피'라는 용어는 작동하는 장치를 성공적으로 제작하기 위해 각 단계를 따르거나 최적화하는 것의 중요성을 암시합니다. 그러나 UV 노출 시간/에너지, PVD 스퍼터링 속도/지속 시간 및 산소 플라즈마 발생기 설정과 같이 최적화되지 않은 공정 내의 특정 중요한 단계는 제조 공정과 전기천공 실험의 성공적인 실행 모두에 문제가 될 수 있습니다. 제작 프로세스 문제 해결은 주로 시행 착오 또는보다 통제 된 실험 설계 실험 설계를 통해 수행됩니다. 추가적으로, 프로토콜 내에서 상이한 단계들을 수행하기 위해 대체될 수 있는 대안적인 미세가공 기술, 예컨대 DRIE(Deep Reactive Ion Etching)가 있다(즉, 연질 리소그래피 공정을 수행하기 위해 DRIE 에칭된 성형 구조를 사용함). 또한 레시피를 최적화하고 장치를 설계/제작하는 것은 현장 초보자에...

CAR-T(키메라 항원 수용체 조작 T 세포) 세포 치료 및 CRISPR(클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복 DNA 서열)/Cas9를 사용한 유전자 편집과 같은 생물의학 연구의 현재 치료 혁신은 외인성 물질을 세포 내 공간1에 성공적이고 효율적으로 전달하는 능력에 크게 의존합니다. CAR-T 요법에서, 세포 치료제 제조에서 유전자 전달 단계를 수행하기 위한 황금 표준은 바이러스 벡터2를 사용하는 것이다. 바이러스 매개 유전자 전달은 효율적인 전달 방식이지만 몇 가지 단점도 있습니다. 여기에는 제조 비용, 세포 독성, 면역원성, 돌연변이 유발/종양 발생 가능성및 전달될 유전자의 크기 제한이 포함됩니다3. 이러한 한계로 인해 대체 비 바이러스 전달 기술의 연구 개발이 이루어졌습니다.
바이러스 매개 유전자 전달의 대안인 전기천공은 세포의 DNA, RNA 및 단백질 형질감염을 수행하기 위해 최적의 전기 펄스 파형의 적용에 의존합니다. 외부 전기장의 인가 후, 세포막이 잠시 손상되어, 세포가 불침투성 외인성 물질4의 세포내 전달에 취약하게 된다. 바이러스 매개 전달에 비해 전기 천공은 일반적으로 안전하고 작동하기 쉽고 운영 비용이 낮기 때문에 유리합니다. 전기천공은 소분자 화물과 대분자 화물을 모두 전달할 수 있으며 혈통에 관계없이 세포를 형질감염시키는 데 효율적일 수있습니다5. 전기천공 후 바람직한 결과, 즉 양호한 생존력 및 양호한 전기-형질주입 효율을 달성하려면, 다양한 실험 파라미터가 공동-최적화될 필요가 있다. 여기에는 세포 유형6, 세포 밀도, 분자 농도7, 전기천공 버퍼 특성(예: 분자 조성, 전도도 및 삼투압)8, 전극 크기/기하학적구조9, 전기 펄스 파형(모양, 극성, 펄스 수)10 이 포함됩니다(그림은 그림 1 참조). 이러한 각 파라미터가 전기천공 실험의 결과에 상당한 영향을 미칠 수 있지만, 적용된 펄스의 전기 에너지가 결과 세포 생존율과 전기 형질주입 효율8 사이의 본질적인 트레이드 오프의 근원이기 때문에 펄스 파형이 특히 자세히 연구되었습니다.
일반적으로 전기 천공 실험은 거시적 규모로 수행되며, 여기서 세포는 전기 천공 큐벳 내의 대형 병렬 플레이트 전극 세트 사이에 100 마이크로 리터의 버퍼에 현탁됩니다. 전극은 일반적으로 전극 거리가 1-4mm 인 알루미늄으로 제조됩니다. 피펫을 통해 셀을 수동으로 로드하면 큐벳이 부피가 큰 전기 펄스 발생기에 전기적으로 연결되어 사용자가 펄스 파형 파라미터를 설정하고 적용하여 셀 현탁액을 전기천공할 수 있습니다. 매크로 스케일 또는 벌크 전기천공은 셀 밀도&gt;106 cells/mL를 처리할 수 있지만 전기 펄스 파형 설정을 최적화할 때 이 기능은 낭비가 될 수 있습니다. 이는 세포 집단 수가 제한될 수 있는 1차 세포 유형을 전기천공할 때 특히 중요합니다. 또한 전극 사이의 거리가 멀기 때문에 펄스 발생기는 전계 강도 &gt;1kV / cm11)를 달성하기 위해 큰 전압을 공급할 수 있어야합니다. 이러한 고전압은 전해질 버퍼를 통한 저항성 전력 소산을 일으켜 줄 가열을 초래하며, 이는 결과적인 셀 생존율(12)에 해로울 수 있다. 마지막으로, 조밀한 세포 현탁액 상에서 전기천공을 수행하는 것은 결과적인 전기-형질감염 효율 및 세포 생존율의 선천적 가변성으로 일관되게 부담될 것이다. 현탁액의 각 셀은 주변 셀로 인해 다른 전기장 강도를 경험할 수 있습니다. 경험된 전기장 강도가 증가 또는 감소하는지 여부에 따라, 생성된 세포 생존율 또는 전기-형질주입 효율이 각각 부정적인 영향을 받을 수 있다(11). 거시적 규모의 전기 천공에 대한 이러한 단점은 마이크로 규모에서 작동하고 단일 셀 수준에서 더 나은 제어를 허용하는 대체 기술의 추구 및 개발로 이어졌습니다.
BioMEMS 또는 생물 의학 마이크로 전자 기계 시스템 분야는 마이크로 일렉트로닉스 산업의 기술 발전에서 비롯됩니다. 특히, 생물 의학 연구의 발전을위한 마이크로 장치를 개발하기 위해 미세 가공 공정을 활용합니다. 이러한 발전은 생체 내 전기 모니터링(13)을 위한 마이크로-전극 어레이, in situ 전기천공을 위한 용량성 마이크로-전극(14), 소형화된 organ-on-a-chip 장치(15), 마이크로유체 현장 진단 16, 바이오 센서(17), 및 나노-및 마이크로-전기천공 장치(19,20,21)를 포함하는 약물 전달 시스템(18)의 개발을 포함한다. . 생물학적 세포와 동일한 크기 규모로 장치를 설계하고 제조할 수 있는 능력으로 인해, 나노- 및 마이크로-전기천공 기술은 그들의 거시적 규모의 대응물(22, 23)과 비교할 때 유리하다. 이러한 전기 천공 장치는 일반적으로 10에서 100 마이크로 미터 간격의 전극 세트가 통합되므로 고전압 펄스 응용 분야의 요구 사항을 제거합니다. 이 기능은 전해질을 통한 전류를 크게 줄여 독성 전기 분해 제품의 축적과 이러한 시스템에서 줄 가열의 영향을 줄입니다. 마이크로스케일 채널은 또한 펄스 인가 동안 훨씬 더 균일한 전기장이 셀에 신뢰성 있게 인가되는 것을 보장하여, 보다 일관된 결과(24)를 초래한다. 또한, 미세-전기천공 장치가 미세유체 플랫폼에 통합되는 것도 일반적이며, 이는 세포 치료제 제조(25)에서 매우 바람직한 기능인 완전 자동화된 기술로의 미래 통합을 위해 그 자체를 제공한다. 마지막으로, 마이크로 스케일 전기 천공은 전기 천공 이벤트의 전기 조사를 허용합니다. 예를 들어, 세포막 투과화의 정도는 단일 세포 수준(26,27)에서 실시간으로 모니터링될 수 있다. 이 방법의 목적은 전기천공 프로토콜을 최적화하면서도 이전 최첨단 기술에 비해 처리량을 증가시키기 위해 세포막 투과 정도를 측정할 수 있는 미세유체, 단일 셀 미세 전기천공 장치의 미세 가공, 시스템 작동 및 분석을 설명하는 것입니다.
단일 세포 수준의 전기 천공을 수행하는 것은 더 이상 새로운 기술이 아니며, 2001 년 Rubinsky et al.에 의해 정적 세포 전기 천공 기술28의 개발로 처음 입증되었습니다. 그들의 마이크로 장치는 전기 천공 사건을 전기적으로 모니터링하는 능력을 최초로 입증했기 때문에 혁신적이었습니다. 이는 장치의 처리량을 증가시키기 위해 병렬화된 방식으로 세포막 투과 정도를 전기적으로 감지할 수 있는 정적 단일 세포 전기천공 기술의 개발로 이어졌습니다. 그러나 병렬화 및 배치 처리를 사용하더라도 이러한 장치는 단위 시간29,30 당 처리 할 수있는 총 셀 수가 심각하게 부족합니다. 이러한 제한은 훨씬 더 큰 처리량(31)에서 단일 셀 레벨 마이크로-전기천공을 수행할 수 있는 유동-관통 장치의 개발로 이어졌다. 정적에서 유동 환경으로의 이 장치 전환은 전기천공 펄스 적용 후 세포막 투과 정도를 전기적으로 모니터링하는 기능을 제한합니다. 이 작업에 설명 된 방법은 개별 세포의 세포막 투과 정도를 연속적인 직렬 방식으로 전기적으로 감지, 펄싱 및 모니터링 할 수있는 미세 전기 천공 기술인이 두 기술 간의 격차를 해소합니다.
이 기술은 최근 Zheng et al. 그 작업에서이 기술의 기능은 전기 천공 펄스의 진폭과 지속 시간이 모두 다양하고 세포막 투과를 나타내는 후속 전기 신호가 탐구 된 파라 메트릭 연구의 완료와 함께 도입되었습니다32. 결과는 전기천공 펄스의 강도의 증가(즉, 인가된 전기장의 증가 또는 펄스 지속시간의 증가)가 측정된 세포막 투과화의 증가를 야기한다는 것을 보여주었다. 시스템을 추가로 검증하기 위해 성공적인 전기 천공의 일반적인 형광 지표 인 요오드화 프로피듐33을 세포 현탁액에 추가하고 전기 펄스를 적용한 직후에 형광 이미지를 캡처했습니다. 광 신호, 즉 세포 내부의 요오드화 프로피듐의 형광 강도는 세포막 투과 정도의 전기적 측정과 강한 상관 관계가 있었으며,이 전기 측정의 신뢰성을 검증했습니다. 그러나이 연구는 번역 할 수있는 의미가 거의 또는 전혀없는 소분자 프로피듐 요오드화물의 전달만을 고려했습니다.
이 작업에서는 생물학적 활성 플라스미드 DNA(pDNA) 벡터를 전달하고 전기천공 후 재도금 및 배양된 세포의 전기 형질감염 효율을 평가하는 동시에 시스템의 처리량을 개선하기 위해 이 기술의 새로운 응용 프로그램이 도입되었습니다. 이전 작업은 전기천공 이벤트를 전기적으로 측정할 수 있는 기존 미세 전기 천공 기술을 능가하지만, 장치의 현재 상태는 여전히 세포 감지, 펄스 적용 및 세포막 투과화 측정을 수행하기 위해 전극 세트 사이의 긴 세포 이동 시간(~250ms)이 필요합니다. 단일 채널을 사용하면 처리량이 초당 4셀로 제한됩니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, pDNA 전기-형질감염을 수행하기 위해 새로운 개념의 세포집단-기반 피드백-제어 전기천공이 도입된다. 이 시스템은 저생리학적 전도도 전기천공 버퍼를 사용하여 다양한 전기천공 펄스 응용 분야에서 단일 세포의 전기적 조사를 허용합니다. 전기적 반응에 기초하여, '최적의' 전기천공 펄스가 결정된다. 그런 다음 세포막 투과화 결정이 무효화되고 유속이 증가하며 전기천공 펄스 듀티 사이클이 세포 통과 시간과 일치하여 전극 사이를 이동하는 셀당 하나의 펄스를 보장하는 '고처리량' 모드가 구현됩니다. 이 작업은 마이크로 장치의 제조를 위한 미세 가공 단계, 실험을 수행하는 데 필요한 재료/장비 및 설정, 장치의 작동/분석 및 전기 형질주입 효율(eTE)에 대한 광범위한 세부 정보를 제공합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63103/63103fig01.jpg"> 그림 1: 전기천공 결과에 영향을 미치는 실험 요인. (왼쪽) 세포 현탁액 - 전기 천공이 시작되기 전에 고려해야 할 중요한 요소에는 페이로드 (이 경우 pDNA), 농도, 세포 밀도 및 전기 천공 완충액 특성이 포함됩니다. 고려해야 할 전기천공 완충액 특성은 전도도, 삼투압 및 이러한 값에 기여하는 정확한 분자 조성입니다. (가운데) 펄스 애플리케이션-정확한 펄스 유형(구형파 대 지수 감쇠) 및 펄스 파형(단일 펄스 대 펄스 트레인)을 최적화하여 결과 세포 생존율과 전기 형질주입 효율을 모두 최대화해야 합니다. 전기 천공 공정에서 구현되는 일반적인 펄스 트레인은 일반적으로 일련의 고전압 (HV) 펄스 또는 HV와 저전압 (LV) 펄스 크기 사이에서 회전하는 일련의 펄스로 구성됩니다. (오른쪽) 세포 회수-다운스트림 처리 단계, 특히 세포가 이송되는 회수 세포 배양 배지는 최적화되어야 합니다. 특징이 없는 경우(맨 왼쪽), 전체 전기천공 공정 최적화를 위해 추가 업스트림 셀 처리 단계를 구현할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63103/63103fig1v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>150mm 직경의 페트리 접시</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>웨이퍼 고정을위한 6.1.1 단계</td></tr><tr><td>24 웰 조직 배양 플레이트</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td>단계 10.3.6 전기 천공 셀 플레이트</td></tr><tr><td>33220A 파형 / 함수 발생기</td><td>애질런트</td><td></td><td>9.2.3 단계 electroporation 펄스 발생기</td></tr><tr><td>4 ''Si-wafers</td><td>University Wafer</td><td></td><td>subsection 2.1 미세유체 채널 제작을 위한</td></tr><tr><td>6-웰 조직 배양 플레이트</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>단계 8.1.8 플레이트 세포에</td></tr> 아<tr><td>세톤</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td>단계 2.1.2 청소 및 &nbsp; 단계 5.1 포토레지스트 리프트오프</td></tr><tr><td>Allegra X-22R 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>단계 8.1.4, 8.3.2. 및 8.3.3. 세포를 스핀 다운</td></tr> AutoCAD <tr><td>2018</td><td>Autodesk</td><td></td><td>하위 섹션 1.1. 투명 마스크 설계:</td></tr><tr><td>완충 산화물 에칭 10:1</td><td>VWR</td><td>901621-1L</td>, HF 에칭 CCD 흑백 현미경 카메라<td>용 하위 섹션 3.1</td></tr>, <tr><td></td><td>Hamamatsu</td><td>Orca 285 C4742-96-12G04</td><td>단계, 11.2.3. CMOS 카메라 이미징</td></tr><tr><td>- Sensicam QE 1.4MP,</td><td>PCO</td><td></td><td>하위 섹션 9.3, 실험 설정의 일부</td></tr><tr><td>: 전도성 에폭시</td><td>CircuitWorks</td><td>CW2400</td><td>하위 섹션 7.6. 와이어 부착용</td></tr><tr><td>원추형 원심분리기 튜브, 15mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td>단계 8.1.4. 세포 원심분리용</td></tr><tr><td>Dektak 3ST Surface Profilometer</td><td>Veeco(Sloan/Dektak)</td><td></td> <td>표면 프로필로메트리 용 2.1.15 및 5.4단계</td></tr><tr><td>일회용 생검 펀치, 0.75mm</td><td>Robbins Instruments</td><td>RBP075</td><td>단계 6.2.3 입구 액세스</td></tr><tr><td>일회용 생검 펀치, 3mm</td><td>Robbins Instruments</td><td>RBP30P</td><td>단계 6.2.3 출구 액세스용</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>abcam</td><td>ab108410</td><td>단계 11.2.2. 라이브 셀 염색</td></tr><tr><td>Dulbecco' 의 변형된 독수리' s Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885084</td><td>단계 8.1.2. 미디어 구성의 일부</td></tr><tr><td>E3631A 바이폴라 트리플 DC 전원 공급</td><td>장치 Agilent</td><td></td><td>단계 9.2.1.-9.2.2.실험 설정 부분</td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U Inverted&nbsp; 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td>&nbsp; 하위 조항 9.3. 실험 설정</td></tr><tr><td>EVG620 UV 리소그래피 시스템의</td> 일부 <td>EVG</td><td></td><td>&nbsp; 단계 2.1.9. 및 2.2.7. UV 노출용</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Neuromics</td><td>FBS001</td><td>단계 8.1.2. 미디어 구성의 일부</td></tr><tr><td>FS20 초음파 세척기</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>하위 섹션 5.1. 포토레지스트 리프트 오프</td></tr><tr><td>유리 미디어 병(캡 포함), 100mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB800100</td><td>단계 8.2.1. 버퍼 보관용</td></tr><tr><td>유리 미디어 병(캡 포함), 500mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB800500</td><td>단계 8.1.2.for 배지 저장</td></tr><tr><td>HEK-293 세포주</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>하위 섹션 8.1 세포 배양</td></tr><tr><td>HEPES 완충액 시</td><td>그마 Aldrich</td><td>83264-100ML-F</td><td>단계 8.2.1 부분 electroporation 완충액 조성</td></tr><tr><td>물 헥사 메틸 디 실라잔</td><td>시그마 Aldrich</td><td>379212-25ML</td><td>단계 2.2.3 접착 촉진제</td></tr><tr><td>HF2LI 락인 증폭기</td><td>취리히 실험</td><td></td> 설정의 일부 기기 하위 <td>섹션 9.2</td></tr><tr><td>HF2TA 전류 증폭기</td><td>취리히 악기</td><td></td><td>하위 섹션 9.2 실험 설정의 일부</td></tr><tr><td>이소프로필 알코올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A459-1</td><td>세척을 위한 2.1.2단계, SU-8 개발 후 웨이퍼 헹굼을 위한 2.1.14단계, PDMS</td></tr><tr><td>IX81 형광 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td>를 세척하기 위한 6.3.1단계L-글루타민 용액 이미징을 위한 11.2.3단계</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513-20ML</td><td>단계 8.1.2. 매체 조성의 일부</td></tr><tr><td>M16878/1BFA 22 게이지 와이어</td><td>AWC</td><td>B22-1</td><td>장치 제작을 위한 하위 섹션 7.5</td></tr> 염화<tr><td>마그네슘</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337-100G</td><td>단계 8.1.2 전기천공 완충액 조성 MF</td></tr><tr><td>319 개발자</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>10018042</td><td>단계 2.2.9. 포토레지스트 현상</td></tr>액 <tr><td>Microposit S1818 포토레지스트</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>1136925</td><td>단계 2.2.4 전극 패터닝용 포지티브 포토레지스트</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드, 75 x 25 mm</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td>단계 2.2.1 전극 소다 석회 유리 기판</td></tr><tr><td>모델 2350 고전압 증폭기</td><td>TEGAM</td><td>2350</td><td>단계 9.2.5. 실험 설정의 일부</td></tr><tr><td>내쇼날인스트루먼트 LabVIEW</td><td>내쇼널 인스트루먼트</td><td></td><td>데이터 수집</td></tr><tr><td>바늘, 30G x 1</td><td>in BD Scientific</td><td>305128</td><td>단계 10.1.1. 시스템의 일부 프라이밍</td></tr><tr><td>PA90 IC OPAMP 전원 회로</td><td>Digi-key</td><td>598-1330-ND</td><td>사용자 정의 회로의 일부</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P4458-20ML</td><td>단계 8.1.2. 미디어 구성의 일부</td></tr><tr><td>플라스미드 pMAX-GFP</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>단계 8.3.4. 세포 내 전달을 위한</td></tr><tr><td>플라스틱 튜브, 0.010'' x 0.030"</td><td>VWR</td><td>89404-300</td><td>단계 10.1.2. 시스템 프라이밍</td></tr><tr><td>플래티넘 타겟</td>용 <td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>하위 섹션 4.2. 물리적 기상 증착용</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>단계 8.2.1. 전기천공법 완충액 구성의 일부</td></tr><tr><td>펌프 11 PicoPlus 미세유체 주사기 펌프</td><td>Harvard Apparatus</td><td>MA1 70-2213</td><td>단계 10.1.4. 시스템 프라이밍용</td></tr><tr><td>PVD75 물리적 기상 증착 시스템</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>하위 섹션 4.1. 물리적 기상 증착</td></tr><tr><td>PWM32 스피너 시스템</td><td>진행 연구</td><td></td><td>단계 2.1.6 및 2.2.2. 포토레지스트</td></tr><tr><td>를 사용한 기판 코팅용PX-250 플라즈마 처리 시스템</td><td>3 월 악기</td><td></td><td>하위 섹션 7.2 PDMS 및 유리 기판 본딩</td></tr><tr><td>SDG1025 기능 / 파형 발생기</td><td>Siglent</td><td></td><td>단계 9.2.2. 실험 설정의 일부</td></tr><tr><td>수산화 나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td>단계 8.2.1. 전기 천공 버퍼 구성의 일부</td></tr><tr><td>SU-8 2010 네거티브 포토 레지스트</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>Y111053</td><td>단계 2.1.7. 미세 유체 채널 패터닝</td></tr><tr><td>SU-8 개발자</td><td>Microchem</td><td>Y010200</td><td>단계 2.1.12. 포토레지스트 현상</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td>단계 8.2.1. electroporation buffer composition의 일부</td></tr><tr><td>Sylgard 184 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>단계 6.2.1&nbsp; 10 : PDMS 폴리머와 경화제의 1 혼합물</td></tr><tr><td>주사기, 1 ml</td><td>BD Scientific</td><td>309628</td><td>단계 8.3.4. 시스템 프라이밍의 일부</td></tr><tr><td>SZ61 실체 현미경 시스템</td><td>올림푸스</td><td></td><td>하위 섹션 7.3. 채널 및 전극 정렬을 위해</td></tr><tr><td>조직 배양 처리 T25 플라스크</td><td>팔콘</td><td>353108</td><td>단계 8.1.2 단계</td></tr><tr><td>티타늄 표적</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>하위 섹션 4.2. 물리적 기상 증착</td></tr><tr><td>투명도 마스크</td><td>CAD/ART 서비스</td><td></td><td>단계 2.1.9. 및 2.2.7. 포토리소그래피용</td></tr><tr><td>트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)실란</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td>단계 6.1.2. 웨이퍼 실란화용</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td>단계 8.1.3. 및 8.3.1. 세포 수확용</td></tr></tbody></table>

연속 흐름의 제조 및 작동, 투과화 감지 기능이 있는 미세 전기 천공 시스템

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

CAR-T 세포 요법과 같은 현재의 치료 혁신은 바이러스 매개 유전자 전달에 크게 의존하고 있습니다. 이 기술은 효율적이지만 높은 제조 비용을 수반하여 유전자 전달을 위한 대체 방법을 사용하는 데 관심을 갖게 되었습니다. 전기 천공은 유전자 및 기타 외인성 물질의 세포 내 전달을위한 전기 물리적, 비 바이러스 적 접근법입니다. 전기장을 인가하면 세포막이 일시적으로 세포 내로 분자 전달을 허용합니다. 일반적으로 전기 천공은 많은 수의 세포를 처리하기 위해 대규모로 수행됩니다. 그러나 이러한 접근 방식에는 광범위한 경험적 프로토콜 개발이 필요하며, 이는 1차 및 형질주입하기 어려운 세포 유형으로 작업할 때 비용이 많이 듭니다. 세포를 투과시키기에 충분한 전기장 강도를 달성하기 위해 큰 전압의 요구 사항과 결합 된 긴 프로토콜 개발은 마이크로 스케일 전기 천공 장치의 개발로 이어졌습니다. 이러한 미세 전기 천공 장치는 일반적인 미세 가공 기술을 사용하여 제조되며 높은 처리량 기능을 유지할 수있는 잠재력으로 더 큰 실험 제어를 허용합니다. 이 작업은 연속 흐름 하에서 단일 세포 수준에서 세포막 투과 수준을 감지 할 수있는 미세 유체 전기 천공 기술을 기반으로합니다. 그러나 이 기술은 초당 처리되는 4개의 셀로 제한되었으므로 시스템 처리량을 늘리기 위한 새로운 접근 방식이 제안되고 여기에 제시됩니다. 세포 집단 기반 피드백 제어로 표시되는이 새로운 기술은 다양한 전기 천공 펄스 조건에 대한 세포 투과 반응을 고려하고 테스트중인 세포 유형에 가장 적합한 전기 천공 펄스 조건을 결정합니다. 그런 다음 더 높은 처리량 모드가 사용되며, 여기서 이 '최적의' 펄스가 이동 중인 세포 현탁액에 적용됩니다. 장치를 제작하고, 미세유체 실험을 설정 및 실행하고, 결과를 분석하는 단계가 자세히 제시됩니다. 마지막으로, 이 미세 전기천공 기술은 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 DNA 플라스미드를 HEK293 세포에 전달함으로써 입증됩니다.

그림 4는 단일 펄스 진폭에 대한 단일 셀 수준 막 투과화 감지의 작동 원리를 강조합니다. 전기천공 실험 개시 후, 세포 검출 알고리즘은 포인트-바이-포인트, 기울기 기반 검출 방법을 통해 세포 검출을 위한 최적의 임계값을 결정한다. 그런 다음 시스템은 측정된 전류의 상당한 음의 변화에 대해 (1)을 지속적으로 모니터링하며, 이는 셀의 유입을 나타냅니다. 이는 생물학적 세포막의 절연 특성으로 인해 세포가 전극 세트를 통과 할 때 임피던스가 순간적으로 증가하여 측정 된 전류가 급격히 감소하여 일관된 세포 감지 (2)가 가능하여 궁극적으로 컴퓨터 제어 펄스 애플리케이션 (4)으로의 전환을 트리거합니다. 절연 셀은 전극 사이에서 부피의 전해질을 대체하여 셀 크기에 비례하는 전류 강하를 초래합니다. 이러한 전류의 변화는 ΔIC (3)로서 표기된다. ΔIC 계산 직후, 미리 결정된 전기 펄스가 이동 중인 세포에 투...

이 프로토콜은 랩온어칩, 마이크로유체 전기천공 장치를 구축하는 데 필요한 미세 가공 기술을 설명합니다. 실험 설정은 연속 흐름에서 제어된 단일 세포 수준 형질주입을 수행하며 집단 기반 제어를 통해 더 높은 처리량으로 확장할 수 있습니다. 세포막 투과 정도를 실시간으로 전기적으로 모니터링하는 기능을 보여주는 분석이 제공됩니다.

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

이 방법을 통해 연구원은 원하는 세포 유형에 대한 최적의 전기 천공 펄스 조건을 결정하는 동시에 기존의 경험적 실험 접근 방식의 필요성을 최소화 할 수 있습니다. 이 방법은 마이크로 전기 천공 기술을 활용하여 전기 천공 공정 전반에 걸쳐 세포막 투과 정도를 전기적으로 모니터링 할 수있는 확장 가능한 미세 유체 작동 장치를 제조합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 석사 과정 학생 인 Kishankumar Busha가 될 것입니다.시작하려면 스핀 코터의 진공 시스템을 사용하여 실리콘 웨이퍼를 웨이퍼 스핀 코터의 척에 고정합니다. 그런 다음 스피너를 프로그래밍하십시오. 다음으로 4 밀리리터의 SU-8 2010 포토 레지스트를 실리콘 웨이퍼의 중앙에 분배하고 프로그램을 실행하십시오.시스템이 정지되면 진공 청소기를 끕니다. 그런 다음 2D 미세 유체 채널 디자인의 포토 마스크를 마스크 홀더에 고정하고 SU-8 코팅이 위쪽을 향하도록 실리콘 웨이퍼를 웨이퍼 척에 삽입합니다. 노출 설정을 평방 센티미터당 150밀리줄로 지정하고 기기를 실행합니다.UV 노출 후 실리콘 웨이퍼를 SU-8 현상액 용액에 3-4분 동안 부드럽게 교반하면서 담그십시오. 그런 다음 용액에서 웨이퍼를 제거하고 이소프로판올로 표면을 헹굽니다. 다음으로 실리콘 웨이퍼를 섭씨 150도 오븐에 30분 동안 넣어 하드 베이킹합니다.그런 다음 스타일러스 프로파일 로메트리를 사용하여 채널 측벽의 정확한 높이와 기울기를 측정하기 전에 실온으로 식히십시오. 그런 다음 1 밀리리터의 포토 레지스트를 유리 슬라이드 표면에 분배하고 프로그램을 다시 한 번 실행하십시오. 시스템이 정지되면 진공 청소기를 끄고 유리 슬라이드를 제거합니다.2D 전극 디자인의 포토 마스크를 마스크 홀더에 고정한 후 S-1818 코팅이 위쪽을 향하도록 유리 웨이퍼를 웨이퍼 척에 삽입하고 정렬합니다. 노출 설정을 제곱센티미터당 215밀리줄로 지정하고 기기를 실행합니다. 노출 후, 유리 슬라이드를 MF-319 현상액 내에 2분 동안 침지시키고, 부드러운 교반을 가한다.그런 다음 유리 웨이퍼를 제거하고 탈 이온수로 표면을 헹굽니다. 마지막으로 유리 슬라이드를 섭씨 150도 오븐에 넣어 하드 베이킹하여 관심 있는 기판 표면이 위를 향하도록 합니다. 30 분 후 오븐에서 슬라이드를 꺼내 빛으로부터 보호하십시오.에칭 유리 슬라이드를 10 내지 1의 완충된 불산 용액에 1분 동안 폴리테트라플루오로에틸렌 용기

the-fabrication-operation-continuous-flow-micro-electroporation

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

비접촉 유전 (cDEP)는 자신의 고유 유전 특성을 통해 정렬 및 입자의 농축 달성한다. 유체 전극 채널 살균 특성을 비 손상 및 생물학적 입자의 정렬에 cDEP 양복지, DEP에 대한 기존의 금속 전극을 교체합니다. 우리는 cDEP의 마이크로 디바이스를 준비하고 세포의 특성 및 정렬 실험을 수행하는 방법을 보여줍니다.

비접촉식 유전을 통해 라벨이없는 분리 및 세포의 농축

미세 유체 와류를 이용한 일렉트로 플랫폼은 정확하고 독립적 인 투여 량 제어와 동일한 세포 집단에 여러 분자의 순차적 전달을 위해 개발되었다. 시스템의 크기에 기초하여 목표 셀 정제 단계 이전 일렉트로 분자 전달 효율 및 처리 된 세포의 생존 능력을 향상시키는 데 도움.

마이크로 소용돌이를 이용한 순차 분자 전달을위한 Electroporator을

우리는 다수의 미세 채널에서 입자의 검출 및 사이징 다중화, 코드 분할 다중 접속 (CDMA)과 저항 펄스 센서 (RPS)를 결합하는 집적 표면 전극 네트워크와 미세 유체 플랫폼을 보여준다.

입자의 공간 추적을위한 멀티 플렉스 전자 감지와 미세 유체 플랫폼

작동 조건에 관계없이 상기 ICP 대역의 전파를 정지 할 수있는 신규 한 이온 농도 분극 (ICP) 플랫폼에 대한 프로토콜을 설명한다. 플랫폼의 독특한 능력은 ICP 현상이 극성은 이온 고갈과 농축, 병합의 사용에있다.

나란히 이온 교환 멤브레인 사이의 이온 농도 분극을 병합하면 편광 영역의 전파를 차단하는

미세 바이오 센서 플랫폼 설계 및 다양 한 analytes의 신속 하 고 민감한 정량화에 대 한 낮은 비용 드라이 필름 포토 레지스트 기술을 사용 하 여 조작. 이 단일 사용 시스템 중지 흐름 기술에 의하여 효소 연결 된 분석 실험에-칩-움직일의 전기 판독을 허용합니다.

드라이 필름 포토 레지스트 기반 전기 화학 미세 바이오 센서 플랫폼: 장치 제작, 온 칩 시험 준비 및 시스템 운영

이 프로토콜은 미세유체 칩을 기반으로 연속 유동 중합효소 사슬 시스템을 구축하는 방법과 실험실에서 모세관 전기영동 시스템을 구축하는 방법을 설명합니다. 실험실에서 핵산 분석을 위한 간단한 방법을 제시합니다.

연속 유동 PCR 미세유체 칩에서 대장균 의 증폭 및 모세관 전기영동 시스템을 사용한 검출

다공성 기판 전기천공법(PSEP)은 높은 세포 생존율과 일관되고 높은 처리량 전달을 결합합니다. 경상피 전기 임피던스(TEEI) 측정의 도입은 PSEP의 중간 프로세스에 대한 통찰력을 제공하고 무표지 전달을 가능하게 합니다. 이 기사에서는 PSEP 전달 실험과 TEEI 측정 분석을 동시에 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

Transepithelial Electrical Impedance Monitoring을 사용한 다공성 기판 기반 전기천공법

전기천공법(Electroporation)은 펄스 전기장(PEF)을 사용하여 세포 배양에 일시적인 공극을 만들어 분자 화물을 도입하는 것입니다. 이 기술은 최근 연구 및 임상 환경에서 널리 사용되고 있습니다. 여기에서는 최근 개발된 "Electroporation Cytometry System"을 사용하여 살아있는 세포, 형광 현미경 검사를 수행하기 위한 전기천공법 기술에 대해 설명합니다.

U2 OS 세포 배양을 사용한 라이브 셀, 형광 현미경 검사를 위한 전기천공법 세포 분석 프로토콜

"E - DNA"센서는 reagentless, 혈액 및 기타 복잡한 매트릭스에서 직접 도전 경우에도 실적이 전기 biosensors은 핵산, 단백질과 작은 분자 analytes 다양한 범위의 감지 적응되었습니다. 여기에는 센서의 제조 및 사용에 대한 일반적인 절차를 제시한다.

핵산, 단백질과 작은 분자의 Reagentless 감지를위한 전기 -의 DNA Biosensors의 제작

우리는 살균 지속적인 흐름 회로에서 층류 유동 전단 응력에 따라 자기편 세포 수있는 방법을 설명하고 있습니다. 세포 '유착, 형태는 투명 챔버를 통해 신진 대사 분석 및 미래의 실험이나 문화에 대한 전단 노출 후 수확한 세포 회로에서 얻은 샘플을 공부하실 수 있습니다.

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

배우세요 미세유체 전기천장 장치 제조법으로 세포막 투과화를 실시간 모니터링하고 최적의 펄스 조건을 결정하는 방법입니다. HEK293 세포를 이용한 단일 세포 전기천장 및 고효율 유전자 전달 기술을 익힐 수 있습니다.

연속 흐름의 제조 및 작동, 투과화 감지 기능이 있는 미세 전기 천공 시스템

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