비알코올성 지방간염의 마우스 모델에서 간 세포외 기질의 3D 이미징

NASH는 세계에서 가장 중요한 만성 간 질환 중 하나입니다. 섬유증, 간경변, 결국 간암으로 진행될 수 있습니다. NASH에서 ECM의 동적 변화를 연구하면 섬유증을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

기존의 이미징은 3D ECM 구조 변화를 입증할 수 없어 간 섬유증의 동적 ECM 리모델링 과정에 대한 이해를 제한했습니다. 시작하려면 절차 전에 마우스의 무게를 측정하십시오. 마우스 마취 후 이발기를 사용하여 복부 부위를 면도하고 70% 에탄올로 피부를 소독합니다.

마우스를 등에 대고 테이프로 수술 보드에 다리를 고정합니다. Mayo 가위와 Adson 집게를 사용하여 하복부를 측면으로 3cm 절개합니다. 그런 다음 흉강을 열지 않고 낮은 복부에서 xiphoid process까지 수직으로 5cm 절개합니다.

복막을 연 후 장을 동물의 왼쪽으로 부드럽게 놓고 레이온 팁 어플리케이터로 간의 오른쪽 엽을 들어 올려 문맥을 노출시킵니다. 문맥에 카테터를 삽입하려면 24게이지 IV 카테터를 문맥의 말단부에 유도합니다. 문맥이 간엽으로 분기하기 전에 카테터 팁을 놓습니다.

카테터가 정맥에 들어가면 즉시 바늘을 빼십시오. 카테터를 통해 1ml 주사기를 사용하여 간에 PBS를 관류하여 카테터가 정맥 내부에 올바르게 배치되었는지 확인합니다. Dumont 마이크로 핀셋, Castroviejo 마이크로 니들 및 4-0 봉합사를 사용하여 문맥의 분기 아래에 실밥을 놓고 1cm 아래에 두 번째 실밥을 꿰매어 카테터를 고정합니다.

루어 커넥터를 사용하여 길이 1m, 내경 3mm, 외경 4.1mm의 실리콘 튜브에 카테터를 연결합니다. 실리콘 튜브를 연동 펌프와 탈이온수가 들어 있는 저장소에 연결합니다. 튜브 내부의 기포를 조심스럽게 제거하고 관류 중에 새로운 기포가 생성되지 않도록 합니다.

연동 펌프를 분당 0.2밀리리터의 유량 출력으로 설정합니다. 먼저 탈이온수로 2시간 동안 정독하면 관류 중에 간의 색이 빨간색에서 노란색으로 바뀝니다. 관류 용액을 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트로 전환하고 밤새 계속하면 관류가 끝날 때 간이 하얗게 됩니다.

관류 용액을 탈이온수로 전환하고 2시간 동안 관류합니다. Dumont 마이크로 집게와 마이크로 스프링 가위를 사용하여 탈세포화된 간을 수집하고 PBS가 있는 페트리 접시에서 조심스럽게 씻습니다. 탈세포화된 간의 작은 조각을 현미경 슬라이드로 옮기고 조직을 가운데에 놓습니다.

티슈 건조를 방지하기 위해 피펫으로 10마이크로리터의 페이드 방지 장착 매체를 티슈에 추가합니다. 커버 유리로 조직을 덮고 작은 힘을 가하여 샘플을 평평하게 만듭니다. 커버 유리의 가장자리를 무색 투명 매니큐어로 밀봉하십시오.

커버 유리 상단에 이머젼 오일 한 방울을 떨어뜨리고 슬라이드를 현미경 슬라이드 홀더에 놓습니다. 20X 오일 대물 렌즈가 이멀젼 오일에 닿을 때까지 내립니다. 파장 405나노미터의 보라색 채널로 전환합니다.

셔터를 켜고 샘플의 초점을 맞춥니다. 이미징을 위해 관심 영역을 탐색하고 배치합니다. 레이저 광을 사용한 이미지 획득으로 이동하기 전에 셔터를 끄십시오.

두 광자 레이저를 시작하려면 컴퓨터 제어로 전환하고 먼저 두 광자 레이저를 켜십시오. 그런 다음 두 광자 레이저 컨트롤러와 셔터를 켜서 출력 전력이 2.5와트보다 높은지 확인합니다. 형광 담금질을 방지하기 위해 레이저 출력을 줄이십시오.

선택한 형광단을 수용할 수 있도록 검출기, photo multipliers 및 hybrid를 선택하고 조정합니다. 동시 또는 순차 이미지 획득을 선택합니다. 핀홀을 가장 높은 값으로 조정합니다.

레이저 파장, 게인, 파워를 조정하고, 픽셀 체류 시간을 오프셋하고, 픽셀 크기 평균화를 조정하고, 확대/축소를 수행합니다. 컴퓨터 Z 컨트롤러를 스크롤하고 Z 치수를 설정합니다. 시작과 끝점을 정의하고 볼륨 내에 지정된 이미지 수를 선택합니다.

이미지를 획득합니다. 두 개의 광자 현미경을 수행한 후, 탈세포화가 없는 콜라겐 섬유는 콜라겐 네트워크의 저해상도 이미지를 드러냈습니다. 탈세포화된 세포외 기질(extracellular matrix)에서, 차우(chow)와 패스트푸드 다이어트 간 사이의 형태와 공간 분포에서 명백한 차이가 관찰되었습니다.

콜라겐 섬유와 차우(chow) 다이어트를 한 쥐는 서로 얽히고 잘 짜여진 네트워크를 보인 반면, 패스트푸드 다이어트를 한 쥐는 연결성이 낮은 콜라겐 다발을 보여주었습니다. 간 세포외 기질의 3차원 구조는 차우 다이어트를 한 쥐의 콜라겐 섬유가 잘 조직된 네트워크를 보였지만 패스트푸드 다이어트 쥐에서는 그렇지 않았음을 보여줍니다. 탈세포화된 세포외 기질에서 섬유소 콜라겐의 품질을 확인하기 위해 슬라이드를 Hematoxylin Eosin 및 Picrosirius red로 염색했습니다.

헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin)은 모든 세포가 제거되었음을 보여줍니다. Picrosirius 붉은 염색 이미지에서 차우를 먹인 쥐의 세포 외 기질은 잘 조직된 네트워크를 보여주었습니다. 대조적으로, 패스트푸드 식단을 섭취한 쥐는 콜라겐 섬유가 더 조밀한 것으로 나타났습니다.

관류 전에 튜브 내부의 기포를 조심스럽게 제거하십시오. 거품은 간의 혈관을 막고 관류에 영향을 미칩니다.