Name: 비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 간 세포외 기질의 3D 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 학습하세요 비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 간 세포외 기질의 3D 이미징 방법을. 제자리 관류 및 탈세포화와 이광자 현미경을 활용하여 간 섬유화 과정에서 ECM 재형성을 시각화합니다.

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기술적인 도움을 주신 박혜석 의원님께 감사드립니다. 이 연구는 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, NJT), 국립 노화 연구소 (NIA), NIH (1R01AG060726, NJT)의 자금 지원으로 지원되었습니다. 이광자 현미경 이미징에 대한 기술 지원을 제공한 Beckman Center의 Cell Sciences Imaging Facility의 Jon Mulholland와 Kitty Lee에게 감사드립니다.

동물 실험은 스탠포드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUCs)와 팔로 알토의 재향 군인 병원에서 승인 한 실험 절차에 따라 수행됩니다. 6-8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스에게 14주 동안 식수에 4.2% 고과당 옥수수 시럽( 표 참조)이 첨가된 사료 또는 패스트푸드 사료를 먹였다5. 마우스는 12시간 어두운/밝은 주기로 표준 케이지에 보관되었습니다.
1. 간 관류의 외과적 준비 및 절차
<ol><li>시술 전에 마우스의 무게를 잰다.</li>
	<li>복강 주사를 통해 케타민(90mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)( 재료 표 참조)을 투여하여 마우스를 마취합니다. 다음 단계를 진행하기 전에 발가락을 꼬집어 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 참고: 이소플루란은 비생존 수술이기 때문에 여기에 필요하지 않습니다.</li>
	<li>머리 깎기를 사용하여 복부 부위를 면도하고 70 % 에탄올로 피부를 소독하십시오. 마우스를 뒤쪽에 놓고 테이프로 수술 보드에 다리를 고정시킵니다.</li>
	<li>발가락 꼬집음으로 마취 깊이를 재확인한 후 Mayo 가위와 Adson 집게( 재료 표 참조)를 사용하여 하복부를 옆으로 3cm 절개한 다음 하복부에서 검상돌기까지 수직으로 5cm 절개합니다. 흉강이 열리지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>복막을 연 후 장을 동물의 왼쪽에 부드럽게 놓고 레이온 팁 어플리케이터( 재료 표 참조)로 간 오른쪽 엽을 들어 올려 문맥을 노출시킵니다.</li>
	<li>24G IV 카테터를 사용하여 문맥을 카테터로 삽입합니다. 문맥의 말단부에 카테터를 삽입합니다. 문맥이 간엽으로 분기되기 전에 카테터 팁을 놓습니다.</li>
	<li>카테터가 정맥에 들어가면 즉시 바늘을 빼십시오. 카테터를 통해 1mL 주사기를 사용하여 PBS로 간을 관류하여 카테터가 정맥 내부에 올바르게 위치하는지 확인합니다. 참고: PBS 관류 시 모든 로브는 즉시 희미해져야 합니다. 카테터가 올바르게 배치되면 정맥혈이 카테터를 통해 빠르게 흐릅니다.</li>
	<li>Dumont 마이크로 집게, Castroviejo 미세 바늘 홀더 및 4-0 봉합사( 재료 표 참조)를 사용하여 문맥 분기 아래에 스티치를 배치하고 1cm 아래에 두 번째 스티치를 배치하여 카테터를 고정합니다.</li>
</ol>2. 조직 탈세포화
<ol><li>Luer 커넥터를 사용하여 카테터를 실리콘 튜브(길이 ~1m, 내경 3mm, 외경 4.1mm)에 연결합니다. 실리콘 튜브를 연동 펌프와 탈이온수가 들어 있는 저장소에 연결합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>튜브 내부의 기포를 조심스럽게 제거하고 관류 중에 새로운 기포가 생성되지 않도록 하십시오. 연동 펌프를 0.2mL/분(즉, 288mL/24시간)의 유량으로 설정합니다.</li>
	<li>먼저 탈이온수(~50mL/마우스)로 2시간 동안 관류합니다. 관류 중에 간색이 빨간색에서 노란색으로 바뀝니다. 참고: 동물은 관류 10분 후에 만료됩니다.</li>
	<li>관류 용액을 0.5%(wt/vol) 나트륨 데옥시콜레이트(DOC, 재료 표 참조)로 전환하고 밤새(18시간, ~250mL/마우스) 계속합니다. 간은 관류가 끝나면 하얗게 됩니다(그림 1).</li>
	<li>관류 용액을 탈이온수(~50mL/마우스)로 전환하고 2시간 동안 관류합니다.</li>
	<li>Dumont 마이크로 집게와 마이크로 스프링 가위( 재료 표 참조)를 사용하여 탈세포화된 간을 채취하고 PBS가 포함된 페트리 접시에서 조심스럽게 세척합니다.</li>
	<li>탈세포화된 조직을 작은 조각으로 절단하여 즉각적인 이미징을 수행하거나 탠덤 질량 분석법, ELISA 또는 웨스턴 블롯과 같은 추가 생화학적 분석을 위해 -80°C에서 동결합니다.</li>
</ol>3. 이미징을 위한 슬라이드 준비(다광자/공초점 형광 현미경 사용)
<ol><li>탈세포화된 간 조각(<3 x 3 x 3mm)을 현미경 슬라이드로 옮기고 조직을 중간에 놓습니다.</li>
	<li>조직 건조를 방지하기 위해 피펫으로 10μL의 페이드 방지 마운팅 배지( 재료 표 참조)를 조직에 추가합니다.</li>
	<li>커버 유리로 조직을 덮고 작은 힘을 가하여 샘플을 평평하게 만듭니다. 커버 유리의 가장자리를 무색 투명 매니큐어로 밀봉합니다(그림 2). 참고: 현미경을 통한 직립 이광자의 설정으로 인해 샘플에 커버 유리가 사용되었습니다. 그러나 도립 현미경을 사용하는 경우 샘플을 다르게 배치할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 이미지 획득
<ol><li>커버 유리 상단에 침지 오일 한 방울을 떨어뜨리고 슬라이드를 현미경 슬라이드 홀더에 놓습니다. 이멀젼 오일에 닿을 때까지 20x 오일 대물 렌즈를 내립니다.</li>
	<li>보라색(405nm) 채널로 전환하고 셔터를 켜고 샘플에 초점을 맞춥니다. 이미징을 위해 관심 영역을 탐색하고 배치합니다. 레이저 광을 사용한 이미지 획득으로 이동하기 전에 셔터를 끄십시오.</li>
	<li>컴퓨터 제어로 전환하고 이광자 레이저를 시작합니다. 먼저 이광자 레이저를 켠 다음(그림 3A) 이광자 레이저 컨트롤러(재료 표 참조)와 셔터(그림 3B, C)를 켭니다. 출력 전력이 2.5W보다 높은지 확인하십시오. 형광 소광을 방지하기 위해 레이저 출력을 줄입니다. 선택한 형광단을 수용하기 위해 검출기(광전자 증배관과 하이브리드 모두)를 선택하고 조정합니다. 참고: 이광자 이미징은 860nm의 여기 파장에서 수행되었습니다. 콜라겐 SHG 및 이광자 여기 형광(TPEF) 이미지를 위해 각각 2개의 채널을 선택했습니다. 415-445 nm의 파장 범위에 해당하는 하나의 채널은 SHG 신호에서 콜라겐의 상세한 구조를 감지했습니다. 또 다른 채널은 TPEF 신호를 수집하기 위해 465-669nm 범위를 커버했습니다.</li>
	<li>동시 또는 순차적 이미지 획득을 선택합니다. 핀홀을 가장 높은 값으로 조정합니다. 레이저 파장, 게인, 전력 및 오프셋을 조정합니다. 픽셀 유지 시간, 픽셀 크기, 평균화 및 확대/축소를 조정합니다(그림 4A).</li>
	<li>컴퓨터 z-컨트롤러를 스크롤하여 z-치수를 설정하고, 시작 및 끝점을 정의하고, 볼륨(z-스택) 내에서 제공되는 이미지 수를 선택합니다. 이미지를 획득합니다. 참고: 여기서는 20μm Z 부피와 1μm Z 단계 크기를 선택했습니다(그림 4B).</li>
</ol>

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<li>Shimoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+liver+scaffolds+promote+liver+regeneration+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12543(2019).</li>
</ol>

저자는이 기사와 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.

현재 프로토콜은 저유속 DOC in situ 관류를 통한 탈세포화가 부서지기 쉬운 삼중 나선 및 천연 원섬유 콜라겐 구조를 보존하여 NASH 간 섬유증에서 동적 ECM 리모델링을 캡처하기 위한 안정적이고 비용 효율적인 플랫폼을 제공한다는 것을 보여줍니다. ECM 성분을 확인하거나 세포 배양을 위한 생물학적 스캐폴드를 생성하기 전에 정상 및 섬유성 간에서 탈세포화를 수행했지만, 간 섬유증에서 ECM 리모델링의 역학은 잘 연구되지 않았습니다 8,9,10. 이 방법을 통해 연구자는 다양한 섬유증 모델을 비교할 수 있습니다.
현재 DNase, 소듐 도데실 설페이트(SDS) 또는 Triton X-10011을 사용하는 다양한 관류 프로토콜이 있다. DNase는 대량의...

비알코올성 지방간 질환(NAFLD)은 성인 인구의 20%-25%에 영향을 미치는 가장 흔한 간 질환입니다. NAFLD 환자의 25%는 비알코올성 지방간염(NASH)으로 진행되며, 여기서 간경변, 간부전 및 간세포 암종의 위험이 증가합니다1. 향후 20년 동안 NASH는 미국에서 200만 명의 간 관련 사망을 차지할 것으로 추정됩니다. 승인된 치료법이 없기 때문에 NASH 환자에서 간 섬유증을 유발하는 메커니즘을 해독하고 표적 치료법을 개발하는 것이 시급합니다3.
세포외 기질(ECM)은 조직 항상성을 조절하기 위해 세포와 양방향 통신을 발휘하는 역동적이고 복잡한 미세환경이다4. 간 ECM은 프로테오글리칸, 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴 및 기타 비구조적 단백질(예: 올팩토메딘 및 트롬보스폰딘)과 같은 구조적 요소로 구성되어 물리적 및 구조적 지지를 제공한다4.
간 섬유증은 NASH3를 포함한 다양한 병인의 간 손상에 대한 만성 상처 치유 반응입니다. 이는 동적 ECM 매트릭스 리모델링 과정의 불균형으로 인해 발생하며 손상된 간에서 과도한 구조 단백질을 특징으로 합니다4. 섬유 형성은 서로 다른 간 세포 유형 간의 동적 세포-세포 통신에 달려 있습니다. 간 성상 세포(HSC)가 활성화되면 평활근 알파 2 액틴 발현, 이동 및 증식 근섬유아세포 유사 세포로 분화하고 상처 봉합 작용으로 ECM 단백질을 합성합니다. 활성화된 HSC는 간에서 콜라겐을 생성하는 세포의 중심입니다1.
ECM 리모델링의 분자 메커니즘, 섬유증의 패턴 및 세포 사건과의 관계는 명확하지 않습니다. 3차원(3D) ECM 구조에 대한 더 나은 이해는 질량분석법 기술이 ECM 단백질 조성을 분석하는 데 도움이 되었음에도 불구하고 여전히 필요하다4. 전통적으로 Masson의 삼색 염색, Picro Sirius Red 염색 및 SHG(2차 고조파 생성) 이미징은 2차원(2D) 얇은 간 섹션에서 수행되었습니다. NASH의 전형적인 섬유증 패턴은 "치킨 와이어"라고 불리며, 이는 영역 3까지 확장되며 perisinusoidal/pericellular fibrosis 5,6입니다. 그러나 천연 간의 3D 구조, 특히 조직 절편을 포함하지 않는 연구에 초점을 맞춘 연구가 부족했습니다. 간 섬유증에서 동적 ECM 리모델링 전반에 걸쳐 섬유증의 패턴과 특성을 식별하기 위한 강력한 이미징 접근 방식은 NASH 메커니즘에 대한 이해를 크게 강화하고 새로운 치료 표적을 식별할 것입니다.
이러한 문제를 해결하기 위해 탈세포화(decellularization)를 통해 천연 간 ECM을 이미지화하도록 빠르고 효율적인 프로토콜을 최적화했습니다7. 전체 간 탈세포화는 세제 관류를 통해 기본 3D ECM 네트워크를 유지하면서 간 세포 내용물을 제거하는 접근 방식입니다. 마우스는 14주 동안 차우 또는 패스트푸드 식단(FFD)을 먹였습니다. 탈세포화는 삼중 나선 및 천연 원섬유 콜라겐 구조를 보존하기 위해 중성 세제와 낮은 유속으로 현장 문맥 관류 후 수행되었습니다. ECM의 콜라겐 구조 변화를 분석하기 위해 이광자 현미경을 적용했습니다. 정상 및 NASH 간에서 기본 ECM 구조의 3D 이미지를 재구성하고 분석했습니다. 현장 관류 탈세포화를 수행하고 이광자 현미경으로 스캐폴드를 분석하면 간에서 동적 ECM 리모델링을 시각화할 수 있는 실용적이고 저렴한 플랫폼을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3</td><td>MONOCRYL</td><td>Y494G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 봉합</td>사 <td>피셔 사이언티픽</td><td>10-000-649</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true</td></tr><tr><td>AnaSed 주사 (자일라진)</td><td>AnaSed</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>이 약은 면허가 있는 수의사에 의해 또는 면허가 있는 수의사의 지시에 따라 사용됩니다.</td></tr><tr><td>BD INSYTE AUTOGUARD I.V. BC 기술이 적용된 카테터</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> 382612 <tr><td>차우 다이어트</td><td>Envigo</td><td># 2918</td><td>다이어트 제어. 고품질 성분으로 제조되고 설치류의 임신, 수유 및 성장을 지원하도록 설계된 고정된 공식, 오토클레이브 불가 식단입니다.</td></tr><tr><td>패스트 푸드 다이어트 (AIN76A Western Diet)</td><td>테스트 다이어트</td><td></td><td>1810060</td></tr><tr><td>https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf Hematoxylin and Eosin Stain Kit</td><td>vectorlabs</td><td>H-3502</td><td>https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html</td></tr><tr><td>Kent Scientific 쥐 수술 키트</td><td>fisher scientific</td><td>13-005-205</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit</td></tr><tr><td>케타민 하이드로 클로라이드 주입</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-996-06 - 10 mL - 바이알.</td><td>KetaVed는 Administration and Dosage에 나열된 종 외에도 인간 이하의 영장류에 대해 임상적으로 연구되었습니다.</td></tr><tr><td>Leica SP5 upright Confocal, multi-photon</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Luer connector (SPIN-LOCK이 있는 3방향 스톱콕)</td><td>bbraun</td><td>D300</td><td></td></tr><tr><td>https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html Picrosirius 레드 스테인 키트</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>24901</td><td>https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771</td></tr><tr><td>레이온 팁 애플리케이터</td><td>퓨리탄</td><td>25-806 1PR</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 데옥시콜레이트</td><td>시그마알드리치</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>시럽</td><td>www.target.com</td><td>24 fl oz</td><td>https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801</td></tr><tr><td>가변 속도 연동 펌프</td><td>INTLLAB</td><td>BT100</td><td>https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1</td></tr><tr><td>VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 미디엄</td><td>vectorlabs</td><td>H-1000-10</td><td>https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html</td></tr></tbody></table>

비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 간 세포외 기질의 3d 이미징

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

비알코올성 지방간염(NASH)은 미국에서 가장 흔한 만성 간 질환으로 7천만 명 이상의 미국인에게 영향을 미칩니다. NASH는 섬유증으로 진행될 수 있으며 결국 간세포 암종의 중요한 위험 요소인 간경변으로 진행될 수 있습니다. 세포외 기질(ECM)은 구조적 지원을 제공하고 모세포 신호를 통해 간 항상성을 유지합니다. 간 섬유증은 동적 ECM 리모델링 과정의 불균형으로 인해 발생하며 구조 요소의 과도한 축적 및 글리코사미노글리칸의 관련 변화를 특징으로 합니다. NASH의 전형적인 섬유증 패턴은 "치킨 와이어"라고 불리며, 일반적으로 Masson의 삼색 염색과 Picrosirius Red 염색에 의해 관찰되는 특징을 기반으로 영역 3 perisinusoidal/pericellular 섬유증으로 구성됩니다. 그러나 이러한 기존의 얇은 2차원(2D) 조직 슬라이드 기반 이미징 기술은 상세한 3차원(3D) ECM 구조 변화를 입증할 수 없어 간 섬유증에서 동적 ECM 리모델링에 대한 이해를 제한합니다.
현재 작업은 위의 문제를 해결하기 위해 탈세포화를 통해 간의 기본 ECM 구조를 이미지화하는 빠르고 효율적인 프로토콜을 최적화했습니다. 쥐에게 14주 동안 차우나 패스트푸드 식단을 먹였습니다. 제자리 문맥 관류 후 탈세포화를 수행하고, 이광자 현미경 기술을 적용하여 천연 ECM의 변화를 이미지화하고 분석했습니다. 정상 간과 NASH 간의 3D 이미지를 재구성하고 분석했습니다. 현장 관류 탈세포화를 수행하고 이광자 현미경으로 스캐폴드를 분석함으로써 간에서 동적 ECM 리모델링을 시각화할 수 있는 실용적이고 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공했습니다.

콜라겐 섬유는 2차 고조파 생성 및 이광자 현미경으로 검출되었습니다. 신호는 부서지기 쉬운 삼중 나선 및 천연 원섬유 콜라겐 구조에서 비롯됩니다. 콜라겐 아형을 분석하기 위해 특정 항체를 사용하지 않았습니다. 그러나 이것은 이미징 기술에 추가될 수 있습니다.
탈세포화 없이 간 조직을 연구할 때 콜라겐 네트워크의 고해상도 이미지를 얻는 것은 어렵습니다 (그림 5A). 탈세포화된 ECM에서 콜라겐 섬유(녹색)는 평행하거나 서로 얽혀 있는 것처럼 보입니다 (그림 5B). Chow와 FFD 간 사이의 ECM 구성 요소의 형태 및 공간 분포에 명백한 차이가 있었습니다. 차우 식단을 섭취한 쥐의 콜라겐 섬유는 서로 얽히고 잘 조직된 네트워크를 나타냈습니다. 그러나 FFD를 사용하는 마우스에서는 콜라겐 다발이 더 적은 연결성으...

현재 프로토콜은 비알코올성 지방간염(NASH) 동안 세포외 기질(ECM) 리모델링의 역학을 시각화하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼을 구축하기 위해 간 상피내 관류/탈세포화 및 이광자 현미경 방법을 최적화합니다.

비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 간 세포외 기질의 3D 이미징

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

NASH는 세계에서 가장 중요한 만성 간 질환 중 하나입니다. 섬유증, 간경변, 결국 간암으로 진행될 수 있습니다. NASH에서 ECM의 동적 변화를 연구하면 섬유증을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.기존의 이미징은 3D ECM 구조 변화를 입증할 수 없어 간 섬유증에서 동적 ECM 리모델링 과정에 대한 이해를 제한합니다. 시작하려면 절차 전에 마우스의 무게를 잰다. 마우스를 마취시킨 후 이발기로 복부 부위를 면도하고 70% 에탄올로 피부를 소독합니다.마우스를 뒤쪽에 놓고 테이프로 수술 보드에 다리를 고정시킵니다. Mayo 가위와 Adson 집게를 사용하여 하복부에서 측면으로 3cm 절개를합니다. 그런 다음 흉강을 열지 않고 하복부에서 xiphoid 과정까지 수직으로 5cm 절개합니다.복막을 연 후 장을 동물의 왼쪽에 부드럽게 놓고 레이온 팁 어플리케이터로 간 오른쪽 엽을 들어 올려 문맥을 노출시킵니다. 문맥을 카테터로 삽입하려면 24게이지 IV 카테터를 문맥의 말단부에 유도합니다. 문맥이 간엽으로 분기되기 전에 카테터 팁을 놓습니다.카테터가 정맥에 들어가면 즉시 바늘을 빼십시오. 카테터를 통해 1밀리리터 주사기를 사용하여 PBS로 간을 관류하여 카테터가 정맥 내부에 올바르게 위치하는지 확인합니다. Dumont 마이크로 집게, Castroviejo 미세 바늘 및 4-0 봉합사를 사용하여 문맥 분기 아래에 스티치를 배치하고 1cm 아래에 두 번째 스티치를 배치하여 카테터를 고정합니다.카테터를 루어 커넥터로 길이 1m, 내경 3mm, 외경 4.1mm의 실리콘 튜브에 연결합니다. 실리콘 튜브를 연동 펌프와 탈이온수가 들어 있는 저장소에 연결합니다. 튜브 내부의 기포를 조심스럽게 제거하고 관류 중에 새로운 기포가 생성되지 않도록 하십시오.연동 펌프를 분당 0.2밀리리터의 유량 출력으로 설정합니다. 먼저 탈이온수로 2시간 동안 정독하면 관류 중에 간의 색이 빨간색에서 노란색으로 바뀝니다. 관류 용액을 0.5% 데옥시콜산나트륨으로 전환하고 밤새 계속하면 관류가 끝날 때 간이 하얗게 됩니다.관류 용액을 탈이온수로 전환하고 2시간 동안 관류합니다. Dumont 마이크로 집게와 마이크로 스프링 가위를 사용하여 탈세포화된 간을 채취하고 PBS가 포함된 페트리 접시에서 조심스럽게 씻습니다. 탈세포화된 간의 작은 조각을 현미경 슬라이드로 옮기고 조직을 중간에 놓습니다.조직 건조를 방지하기 위해 피펫으로 10마이크로리터의 퇴색 방지 장착 매체를 조직에 추가합니다. 커버 유리로 조직을 덮고 작은 힘을 가하여 샘플을 평평하게 만듭니다. 커버 유리의 가장자리를 무색 투명 매니큐어로 밀봉하십시오.커버 유리 상단에 침지 오일 한 방울을 떨어뜨리고 현미경 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓습니다. 20X 오일 대물 렌즈가 이멀젼 오일에 닿을 때까지 내립니다. 파장 405 나노 미터의 보라색 채널로 전환하십시오.셔터를 켜고 샘플의 초점을 맞춥니다. 이미징을 위해 관심 영역을 탐색하고 배치합니다. 레이저 광을 사용한 이미지 획득으로 이동하기 전에 셔터를 끄십시오.2 광자 레이저를 시작하려면 컴퓨터 제어로 전환하고 먼저 2 광자 레이저를 켭니다. 그런 다음 두 개의 광자 레이저 컨트롤러와 셔터를 켜서 출력 전력이 2.5와트보다 높은지 확인합니다. 형광 소광을 방지하기 위해 레이저 출력을 줄입니다.선택한 형광단을 수용하기 위해 광증배관과 하이브리드를 모두 선택하고 조정하십시오. 동시 또는 순차적 이미지 획득을 선택합니다. 핀홀을 가장 높은 값으로 조정합니다.레이저 파장, 게인, 파워를 조정하고, 픽셀 체류 시간 오프셋, 픽셀 크기 평균화 및 확대/축소를 수행합니다. 컴퓨터 Z 컨트롤러를 스크롤하고 Z 치수를 설정합니다. 시작 및 끝점을 정의하고 볼륨 내에 지정된 이미지 수를 선택합니다.이미지를 획득합니다. 두 광자 현미경을 수행한 후, 탈세포화되지 않은 콜라겐 섬유는 콜라겐 네트워크의 저해상도 이미지를 나타냈습니다. 탈세포화된 세포외 기질에서, 차우와 패스트푸드 식단 간 사이의 형태 및 공간 분포에서 명백한 차이가 관찰되었습니다.차우 다이어트를 한 콜라겐 섬유와 마우스는 서로 얽히고 잘 조직된 네트워크를 보인 반면, 패스트푸드 다이어트를 한 마우스는 연결성이 낮은 콜라겐 다발을 보여주었습니다. 간 세포외 기질의 3차원 구조는 차우 다이어트를 한 쥐의 콜라겐 섬유가 잘 조직된 네트워크를 보였지만 패스트푸드 다이어트 마우스에서는 그렇지 않았음을 보여줍니다. 탈세포화된 세포외 기질에서 원섬유 콜라겐의 품질을 확인하기 위해, 슬라이드를 헤마톡실린 에오신 및 피크로시리우스 레드로 염색하였다.헤마톡실린과 에오신은 모든 세포가 제거되었음을 보여줍니다. Picrosirius red 염색 이미지에서, 차우 먹인 쥐의 세포 외 기질은 잘 조직 된 네트워크를 나타냈다. 대조적으로, 패스트 푸드 다이어트를하는 쥐는 더 조밀 한 콜라겐 섬유를 보여주었습니다.관류하기 전에 튜브 내부의 기포를 조심스럽게 제거하십시오. 거품은 간에서 혈관을 막고 관류에 영향을 미칩니다.

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연구

JoVE Journal

Medicine

의학

비알코올성 지방간염의 마우스 모델에서 간 세포외 기질의 3D 이미징

간의 면역 세포를 안정적으로 생체 내 고해상도 이미징하는 것은 어려운 일입니다. 여기에서는 집중 치료 모니터링과 함께 생체 내 다광자 레이저 스캐닝 현미경을 통해 장기간(약 6시간)에 걸쳐 마우스 간에 있는 면역 세포의 이동 및 세포-세포-상호 작용을 연구할 수 있는 매우 민감하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

CXCR6.Gfp 기자 마우스를 사용하여 건강하고 병에 걸린 간에서 면역 세포의 장기 생체 내에 다중 광자 현미경 이미징

여기서 제시된 것은 변형된 콜라게나아제 관류 기술을 사용하여 성인 마우스 간으로부터 마우스 간세포의 분리를 위한 프로토콜이다. 또한 3D 콜라겐 샌드위치 설정에서 간세포의 장기 배양뿐만 아니라 담즙 카나리아 형성 및 치료에 대한 반응을 연구하기 위한 세포골격 성분의 면역 라벨링이 기술된다.

체외에서 담즙 관내 형성에서 세포골격의 역할을 연구하기 위해 1 차 마우스 간세포의 격리 및 3D 콜라겐 샌드위치 문화

이 프로토콜은 섬유성 기질 구획을 동반한 3D 생체 모방 모델을 제공합니다. 생리학적으로 관련된 하이드로겔을 사용하여 기질 세포 외 매트릭스의 생체 물성 특성, 세포 상호 작용, 종양 성장 및 전이의 활성 중재자를 모방합니다.

튜닝 가능한 바이오 물속성과 3D 환경에서 종양-스트로마 상호 작용을 연구하는 간암을 위한 생체 모방 모형

이 프로토콜은 비침습적으로 비 알코올 성 지방 간 질환의 설치류 모델에서 간 조직 변화를 관찰하고 정량화하기 위해 향상된 초음파 기술의 사용을 설명합니다.

NAFLD/NASH의 쥐 모형에 초음파 및 전단 파 단층 사진 의 응용

간 질환은 섬유증이나 간경변증을 촉진하는 많은 원인에 의해 유도됩니다. 이식은 건강을 회복하기위한 유일한 옵션입니다. 그러나 이식 가능한 장기의 희소성을 감안할 때 대안을 모색해야합니다. 우리의 연구는 동물 모델에서 간 조직에 콜라겐 비계의 이식을 제안한다.

간 재생 전략으로 3차원 콜라겐 매트릭스 스캐폴드 이식

식이 유발 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 마우스 모델을 사용하여 NAFLD의 진행 단계를 평가하기 위한 비침습적 방법으로 새로운 생체 내 미세 컴퓨터 단층 촬영 이미징 기술의 사용을 설명하며, NAFLD 관련 간 조절 장애에 크게 관여하기 때문에 주로 간 혈관 네트워크에 초점을 맞춥니다.

비알코올성 지방간 질환의 진행을 평가하기 위한 새로운 생체 내 미세 컴퓨터 단층 촬영 이미징 기술

이 연구의 목적은 간섬유증의 조기 진단을 위한 새로운 3차원 디지털 모델을 개발하는 것인데, 여기에는 환자의 간에서 각 복셀의 경직도가 포함되어 있어 다양한 섬유증 단계에서 환자의 간 분포 비율을 계산하는 데 사용할 수 있습니다.

자기공명탄성검사(Magnetic Resonance Elastography)를 기반으로 한 간섬유증 조기 진단을 위한 3차원 디지털 모델

여기에서는 쥐 눈의 전방에 생착된 간 스페로이드의 비침습적 in vivo 이미징을 허용하는 플랫폼에 대해 설명합니다. 워크플로우는 일차 간 세포에서 스페로이드를 생성하는 것부터 마우스 눈에 이식하고 컨포칼 현미경을 통해 세포 해상도로 생체 내 이미징을 수행하는 것까지 다양합니다.

쥐 눈의 전방에 생착된 간 회전 타원체의 In vivo 이미징

대사 기능 장애, 간 유전자 발현 변화 및 진행성 섬유증 3기로 진행되는 섬유증을 포함하여 인간 MASLD와 유사한 간 조직병리학적 변화를 동반한 대사 기능 장애 관련 지방성 간 질환(MASLD)의 마우스 모델. 이 모델은 MASLD 병태생리학 연구 및 새로운 치료법의 전임상 연구에 사용할 수 있습니다.

섬유증을 동반한 대사성 기능 장애 관련 지방성 간 질환의 마우스 모델

이 프로토콜은 생체 마우스의 인체 현미경(IVM)을 위한 최첨단 재사용 간 영상 도구(RHIT)를 도입하여 신속하고 급성 실험을 위한 조직 안정성을 향상시킵니다. RHIT의 3D 프린팅 설계는 비용 효율적인 생산, 확장성, 다재다능함을 제공하여 다양한 크기의 쥐에서 대사 과정을 장기간 관찰할 수 있게 합니다.

재사용 간 영상 도구: 간내 현미경을 위한 재사용 가능한 3D 프린팅 도구

이 프로토콜은 간별 세포 형태를 온전한 간 조직에서 시각화하고 모델링하기 위한 포괄적인 영상 파이프라인을 제공합니다. 이 접근법은 마우스 유전학을 이용한 형광 표 지, 현장 간 관류 기반 조직 준비, 그리고 광학 투명성을 달성하기 위한 수정된 iDISCO 조직 클리어링 방법을 결합합니다.

간 섬유증 마우스 모델에서 간 별형 세포 형태 매핑

학습하세요 비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 간 세포외 기질의 3D 이미징 방법을. 제자리 관류 및 탈세포화와 이광자 현미경을 활용하여 간 섬유화 과정에서 ECM 재형성을 시각화합니다.

비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 간 세포외 기질의 3D 이미징

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