Name: 글리포세이트 기반 제품이 마이크로바이옴에 미치는 잠재적 영향의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 배우세요 글리포세이트 기반 제품이 식물, 동물, 토양 미생물군집에 미치는 영향을 정량화하는 생물정보학 방법론입니다. 이 워크플로우는 미생물 생태학 연구에 활용 가능한 강력한 실험 설계를 제공합니다.

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이해 상충 : 없음.

이 프로토콜은 EPSPS 단백질의 분석에 기초하여 마이크로바이옴에 대한 GBP의 효과를 정량화하는 방법에 대한 일반적인 지침을 제공한다. 이 프로토콜은 세 가지 중요한 단계를 가지고 있습니다 : (i) 미생물 데이터로부터 EPSPS 단백질의 정량화. 이 단계는 EPSPS가 제초제의 직접 표적 효소이기 때문에 중요합니다. 따라서, EPSPS 유전자의 카피를 갖는 종은 GBP의 사용에 의해 영향을 받을 수 있다. 그럼에도 불구하고, EPSPS 유전자의 카피가 결여된 종조차도 대안적인 비표적 메카니즘(43,44)을 통해 제초제에 의해 영향을 받을 수 있다. (ii) EPSPS 유전자의 분석이 연구의 설계에 포함되지 않은 경우, 16S rRNA(박테리아) 또는 ITS (진균)를 분석함으로써 양호한 추정치를 얻을 수 있다. 이 경우, 포괄적인 참조 테이블에 의존하는 것이 필수적이다 (예를 들어, ATGC 데이터베이스는 몇몇 밀접하게 관련된 종으로부터의 EPSPS 단백질의 서열을 제공한다). (iii) EPSPS 단백질은 EPSPS의 활성 부위의 특정 아미노산 잔기에 따라 글리포세이트에 잠재적으로 민감하거나 내성인 것으로 나뉜다. 그러나, 단일 아미노산에 영향을 미치는 돌연변이는 이러한 분류(45)를 변경할 수 있고, 부류들 사이의 전이는 비교적 짧은 기간에 발생할 수 있다(14).
글리포세이트에 대한 유기체의 잠재적 민감성은 참조 게놈, 아미노산 마커 및 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다. (i) 참조 게놈: EPSPS 효소는 아미노산 마커 및 모티프의 존재에 기초하여 글리포세이트에 잠재적으로 민감성(클래스 I[알파 또는 베타]46,47) 또는 내성(클래스 II 48,49, III50 및 IV51)으로 분류될 수 있다(클래스 III의 경우). 이들 아미노산 마커 및 모티프는 비브리오 콜레라 (vcEPSPS, 클래스 I), 콕시엘라 버네티 (cbEPSPS, 클래스 II), 브레분디모나스 수포 (bvEPSPS, 클래스 III), 및 스트렙토마이세스 다바웬시스 (sdEPSPS, 클래스 IV)의 EPSPS 단백질 내의 아미노산 잔기의 위치에 기초한다. (ii) 아미노산 마커: 글리포세이트는 EPSPS 효소와 상호작용하고 포스포에놀피루베이트(PEP, EPSPS 효소의 두 번째 기질)52,53과 경쟁한다. 특정 종에서, EPSPS 서열의 작은 아미노산 변화는 PEP에 대해 더 높은 친화도 및 글리포세이트 12,14,52,54,55에 대한 내성을 제공한다. 다른 서열에서, 글리포세이트는 EPSPS 서열을 비억제 입체형태(45)로 결합한다. 글리포세이 트에 대한 많은 내성 12,14,48,49,52,54,55 및 56,57 EPSP 서열이 기술되었지만, EPSPS에 대한 현재의 분류 시스템은 4개의 주요 부류(I-IV)12로 나뉘어져 있다(표 5 ). (iii) 서열 정렬: EPSPS 효소를 분류하기 위해, 우리는 다중 서열 정렬 프로그램-디폴트 파라미터35-와 함께, 참조 서열(vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS 및 sdEPSPS)의 각각에 대해 질의 서열의 쌍 정렬을 수행하였다. 이러한 정렬은 질의 서열에서 아미노산 마커의 위치를 확인하기 위해 필요하다. 그 결과, 효소는 아미노산 마커 및 클래스 III 기반 모티프 마커의 존재에 기초하여 기술된12-클래스 I, II 및/또는 IV로 분류된다.
이 프로토콜은 네 가지 알려진 유형의 EPSPS를 기반으로합니다 : 한 유형은 민감하고 다른 세 유형은 내성입니다). 그러나, 원핵생물에서 EPSPS 서열의 대략 10%는 아직 분류되지 않았다(고세균에서 16%, 박테리아에서 8%)12. 따라서, 추가 연구는 글리포세이트 감수성을 결정하기 위해 이러한 서열을 분석해야 한다. EPSPSClass 서버는 새로운 유전자 마커를 검사할 수 있는 옵션을 제공합니다. EPSPS의 알려진 클래스의 식별은 섹션 4.4에 표시된 것처럼 간단합니다. 및 그림 5. 또한, 사용자가 자신의 질의와 참조 단백질을 비교하고자 하는 경우, 서버는 참조 서열과 아미노산 마커 세트를 수동으로 포함하는 옵션을 제공한다(그림 11). 이 옵션은 EPSPS의 새로운 클래스를 확인하고 다른 제초제 및 표적 서열을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.
EPSPS 클래스의 분석은 서열 분석 및 아미노산 마커의 존재 / 부재에 의해 결정됩니다. 이것은 현장에서 가설 테스트에 사용할 수있는 예비 추정치입니다. 아미노산 마커는 경험적 및 관찰 연구46,47,48,49,50,51에 기초한 문헌에서 결정되었다. 그러나, EPSPS 부류를 결정하기 위한 기준 단백질 서열은 제한된 수의 종에서만 시험되었으며, 때때로 글리포세이트에 대한 내성을 설명하지 못할 수 있다. 보상 돌연변이 및 EPSPS-관련 도메인 (주로 진균에서)의 효과는 또한 글리포세이트58에 대한 감수성에 영향을 미칠 수 있다. 이 논문의 분석은 네 가지 EPSPS 클래스를 기반으로합니다. 인간 장내 미생물에서 박테리아를 조사한 결과, 그 중 약 30%가 분류되지 않은 것으로 나타났으며(즉, 이들 종의 EPSPS 단백질은 알려진 부류에 속하지 않음), 다른 EPSPS 부류를 확인하기 위해서는 추가적인 연구가 필요하다. 또한, 박테리아 및 식물의 EPSPS 단백질 서열은 단일도메인인 반면, 진균 EPSPS 단백질은 여러 도메인(59)을 포함한다는 것을 주목해야 한다. 따라서, 진균에서 폴딩된 단백질은 글리포세이트에 대한 EPSPS 효소의 상이한 반응을 유도할 수 있다. 더욱이, 추가적인 비-표적 내성 (예를 들어, 유출 펌프 및 EPSPS 유전자13의 과발현) 또는 글리포세이트에 대한 민감성 (예를 들어, 미토콘드리아 수송 사슬12에 대한 글리포세이트의 효과)은 고려되지 않는다.
GBPs는 1974 년부터 제초제로 사용되어 왔으며 1991 년부터 널리 활용되어 왔지만, 이것은 글리포세이트에 대한 유기체의 잠재적 인 민감성을 결정하는 최초의 생물 정보학 방법입니다. 상기 방법은 표적 서열에서 공지된 아미노산 잔기의 확인에 기초한다. 따라서, 우리의 방법은 종에 대한 글리포세이트의 잠재적 효과에 대한 기준선 추정치를 제공한다. 가까운 장래에, 신규한 생물정보학 방법은 분류되지 않은 서열12,54,55의 글리포세이트에 대한 잠재적 감수성을 결정하기 위해 EPSPS 단백질의 추가적인 부류를 포함해야 한다. 또한, EPSPS 효소의 정확한 거동이 단일 아미노산 변화12,14,52,54,55에 의해 달라질 수 있다는 점을 감안할 때, 실리코 실험에서 EPSPS 단백질의 폴딩에 작은 변화뿐만 아니라 진균 58의 단백질 구조에 대한 EPSPS 관련 도메인의 영향을 고려해야 합니다. . 더욱이, 글리포세이트에 대한 내성은 EPSPS 단백질56,57의 과발현에 의해 생성될 수 있음이 밝혀졌다; 따라서 코돈 용도(60)의 개선에 기초한 생물정보학 분석은 유전자 발현을 최대화하거나 최소화하는 신규한 EPSPS 서열을 확인하는데 이용될 수 있다.
농부, 정치인 및 의사 결정권자는 살충제의 과도한 사용과 관련된 위험에 대한 철저한 이해가 시급히 필요합니다. 따라서 살충제에 대한 유기체의 잠재적 민감성을 드러내는 생물 정보학 도구와 다양한 환경에서 수행되는 잘 복제되고 무작위화되고 현장 현실적인 실험 연구가 필요합니다. 글리포세이트에 대한 유기체의 민감성을 조사하기 위해 고안된 제시된 생물 정보학 방법은 다른 살충제에 대해 조절 될 수 있습니다. 마찬가지로, 실험 생태학의 방법은 관련된 생태 학적 질문을 연구하기 위해 적용될 수 있습니다. 함께이 방법을 사용하여 현장 관찰, 게놈 데이터 및 살충제 사용 사이의 사상자를 입증 할 수 있습니다. 제시된 모든 방법은 위험 평가에서 매우 중요합니다. 생물정보학적 방법은 예를 들어, 농약에 대한 미생물 적응을 모니터링하고, 농약에 대한 병원균의 내성의 증가, 통합 해충 관리(IPM)에서 생물학적 조절제로서 사용되는 미생물에 대한 부정적인 영향, 및 박테리아의 항생제 내성과 같은 잠재적인 다른 관련 위험을 시험하기 위한 정량적 방법을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

현대 농업에서 살충제의 과도한 사용은 분명히 생물 다양성의 쇠퇴에 주요 기여를합니다1. 이 논문은 글리포세이트 기반 제품 (GBPs)이 효율성과 저렴한 가격 2,3으로 인해 전 세계적으로 가장 널리 사용되는 살충제가되기 때문에 글리포세이트에 중점을 둡니다. 농업 분야에서 잡초를 죽이는 것 외에도 GBP는 일반적으로 실비 컬쳐, 도시 환경 및 가정 정원에서 사용됩니다. 또한, 그들은 제조업체의 지침에 따라 사용되는 경우 비 표적 유기체에 대해 무독성으로 선언되었습니다. 그러나, 점점 더 많은 최근의 연구들이 글리포세이트의 잔류물 및 그의 분해 생성물이 토양에서 유지되고 수송될 수 있고, 그럼으로써 비표적 유기체에 계단식 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다4,5,6,7,8. 글리포세이트의 효과는 식물에만 국한되지 않으며, 시키메이트 경로는 많은 진균 및 원핵생물에도 존재한다. 글리포세이트는 aroA9로도 알려진 시키메이트 경로에서 효소 5-올피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소(EPSPS)를 표적으로 한다. 이 효소는 세 가지 필수 방향족 아미노산 (페닐알라닌, 티로신 및 트립토판)의 합성에서 시키메이트 경로의 중심에 있으며 대부분의 원핵생물, 식물 및 곰팡이10,11에 존재합니다. 일부 미생물 종은 EPSPS 서열의 돌연변이를 포함한 몇 가지 메카니즘을 통해 글리포세이트에 대한 부분적 또는 절대적 내성을 발전시켰다. 따라서, GBPs의 사용은 인간 장내 미생물12,13,14를 포함하는 식물 및 동물 마이크로바이옴에 직접적인 영향을 미칠 수 있다는 것이 제안되었다. 그럼에도 불구하고 GBP의 사용은 미생물 및 미생물 촉진 과정에 의존하는 거의 모든 생태계 기능 및 서비스에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 결과적으로 위협은 생화학 적 토양 과정, 수분 생물학 및 동물 및 인간 복지와 관련 될 수 있습니다. 이것은 글리포세이트가 시키메이트 경로에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 보다 포괄적인 이해와 글리포세이트에 대한 미생물의 민감성을 평가하는 방법을 요구한다.
이 프로토콜에서는 현장 실험에서 생물 정보학 분석에 이르기까지 글리포세이트와 GBP가 미생물에 미치는 영향을 테스트하기위한 파이프 라인을 제시합니다. 우리는 글리포세이트12에 대한 유기체의 잠재적 감수성을 결정하는데 사용될 수 있는 최근에 발표된 생물정보학 방법을 상세히 기술한다. 연구원의 지식에 따르면, 이것은 GBP의 활성 성분에 대한 효소 EPSPS의 고유 감도를 평가하는 최초의 생물 정보학 도구입니다. 이러한 생물정보학 방법은 글리포세이트 표적 효소(EPSPS)12에서 공지된 아미노산 마커의 검출에 기초한다. 파이프라인은 다섯 가지 주요 작업 단계(그림 1)로 나뉩니다: 1) GBP의 효과를 테스트하기 위한 두 가지 현장 실험에 대한 간략한 소개, 2) 마이크로바이옴 분석(16S rRNA, ITS 및 EPSPS 유전자)에 대한 간략한 요약, 3) 공용 저장소에서 EPSPS 서열 수집, 4) 글리포세이트에 대한 유기체의 잠재적 민감도 결정, 5) 범용 미생물 마커(16S rRNA 및 ITS)로부터 EPSPS 클래스 평가.

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939B</td> PCR 산물 dNTP mix(각 10mM)<td>의 농도 및 품질을 확인하려면</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0192</td><td>PCR 반응용</td></tr><tr><td>GoTaq G2 DNA 중합효소 키트</td><td>Promega</td><td>M7848</td><td>PCR 완충액 및 PCR 증폭용 DNA 중합효소</td></tr><tr><td>Invisorb Spin Plant Mini Kit</td><td>INVITEK Molecular</td><td>1037100300</td><td>식물 조직에서 게놈 DNA 추출</td></tr><tr><td>Ion Chip Minifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4479672</td><td>미생물 PCR 산물의 표적 염기서열분석용</td></tr><tr><td>Ion PGM System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4462921</td><td>미생물 PCR 산물의 표적 염기서열분석용</td></tr><tr><td>Ion PGM Torrent Server</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4483643</td><td>미생물 PCR 산물의 표적 염기서열분석용</td></tr><tr><td>Pippinprep</td><td>SageScience</td><td>PIP0001</td><td>PCR 앰플리콘의 크기 분획용</td></tr><tr><td>압력 탱크</td><td>Berthoud</td><td>102140</td><td>현장의 스프레이 글리포세이트 기반 제품용</td></tr><tr><td>프라이머</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PCR</td><td>증폭을 위한</td></tr><tr><td>맞춤형 로터리 틸러</td><td>Grillo</td><td>984511</td><td>실험 플롯의 토양 경작용</td></tr><tr><td>S1000 ThermalCycler</td><td>PCR 증폭을 위한</td> <td>BIO-RAD</td><td>1852196</td></tr></tbody></table>

글리포세이트 기반 제품이 마이크로바이옴에 미치는 잠재적 영향의 정량화

Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes

글리포세이트 기반 제품(GBP)은 전 세계적으로 가장 일반적인 광범위한 스펙트럼 제초제입니다. 글리포세이트의 표적은 시키메이트 경로에서 효소 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소(EPSPS)이며, 이는 식물에서 거의 보편적이다. 효소의 억제는 세 가지 필수 아미노산의 생산을 중지: 페닐알라닌, 티로신, 트립토판. EPSPS는 또한 진균 및 원핵생물, 예컨대 고세균 및 박테리아에 존재하고; 따라서, GBP의 사용은 토양, 식물, 초식 동물 및 이차 소비자의 미생물 조성에 영향을 미칠 수 있다. 이 기사는 현장 실험에서 생물 정보학 분석에 이르기까지 미생물에 대한 GBP의 영향을 평가하고 몇 가지 테스트 가능한 가설을 제공하기위한 일반적인 지침을 제시하는 것을 목표로합니다. 비표적 유기체에 대한 GBP를 시험하기 위해 두 가지 현장 실험이 제시된다. 첫째, 10개의 복제된 대조군으로부터의 식물 관련 미생물 및 작물 재배를 시뮬레이션하는 GBP 처리 플롯이 샘플링되고 분석된다. 두 번째 실험에서, 글리포세이트 잔류물을 함유하는 가금류 분뇨 또는 처리되지 않은 대조군 분뇨에 의해 수정된 실험 플롯으로부터의 샘플이 수득되었다. EPSPS 단백질 서열의 생물정보학 분석은 글리포세이트에 대한 미생물의 잠재적 감수성을 결정하는데 이용된다. 미생물에 대한 GBP의 효과를 추정하는 첫 번째 단계는 표적 효소 (EPSPS)에 대한 잠재적 인 민감성을 결정하는 것입니다. 미생물 서열은 공개 저장소로부터 또는 PCR 증폭을 통해 수득될 수 있다. 그러나, 대부분의 현장 연구에서, 마이크로바이옴 조성은 16S rRNA 및 내부 전사된 스페이서(ITS)와 같은 범용 DNA 마커에 기초하여 결정되었다. 이러한 경우, 글리포세이트에 대한 민감성은 밀접하게 관련된 종을 사용하는 EPSPS 서열의 확률적 분석을 통해서만 추정될 수 있다. EPSPS 효소를 기반으로 글리포세이트에 대한 유기체의 잠재적 감수성의 정량화는 표적 및 비표적 내성 메카니즘을 연구하기 위한 추가 실험을 위한 강력한 접근법을 제공한다.

이 프로토콜의 목적은 현장 실험에서 생물 정보학 분석에 이르기까지 제초제 글리포세이트에 대한 유기체의 잠재적 민감도를 정량화하는 일반적인 파이프 라인을 제공하는 것입니다. 실험 2에서 메추라기 사료의 평균 글리포세이트 농도는 164mg/kg이었고, 배설물 시료(소변과 분변 물질이 합쳐진)의 평균 글리포세이트 농도는 199mg/kg이었다. GBP로 오염 된 사료를 먹인 메추라기에서 수집 된 침구는 평균 158 mg / kg이었고 0.17 mg / kg의 글리포세이트를 측정하는 대조 침구를 가졌습니다 (표 3). 현장 실험에서 식물 종은 토양의 글리포세이트 잔류 물에 다르게 반응했습니다 (섹션 1). 귀리와 순무 강간의 바이오 매스는 GBP 처리 토양에 비해 통제 토양에서 더 컸다. 그러나 파바 콩과 감자는 성장기15 시즌이 끝날 때 GBP 처리로 이익을 얻는 것으로 나타났습니다. 가금류 분뇨의 글리포세이트는 잔디 (Festuca pratensis)와 딸기 (Fragaria x vescana) (섹션 1)의 식물 성장을 감소시켰다. 현장 실험의 미생물 분석은 아직 완전히 분석되지 않았으며 여기에 제시되지 않았습니다 (섹션 2). 이 프로토콜의 결과는 직접 (섹션 3 및 4에 표시된대로) 또는 간접적으로 (섹션 5) 읽을 때 데이터 세트에서 글리포세이트에 대한 잠재적으로 민감하고 내성이 강한 유기체의 비율을 측정합니다 (그림 9). 이 방법의 사용은 공공 저장소12로부터 수득된 코어 인간 장내 미생물 미생물의 미생물 종으로부터의 EPSPS 단백질 서열의 수집으로 시험되었다. 이 연구에서, 가장 풍부한 박테리아 종 101 종 중 890 균주를 EPSPSClass 방법으로 분석하여 민감하고 내성 박테리아의 비율을 정량화했습니다. 결과는 핵심 인간 장내 미생물 군집의 종의 54 %가 글리포세이트12에 잠재적으로 민감하다는 것을 보여주었습니다. 이러한 경향은 또한 원핵 세계의 대부분에서 관찰된다; 또한, 진핵 생물 (주로 식물과 곰팡이)에서 잠재적으로 민감한 종의 비율은 훨씬 더 높습니다12. 또한, 우리는 이 방법을 이용하여 미진화 수준에서 EPSPS 단백질의 민감도 변화를 정량화하였다(도 10)14. 분석한 원핵생물의 32개 그룹 중 12개에서 민감도 상태의 변화를 확인했다(표 4)14. 따라서, GBPs의 지속적인 사용은 식물, 동물 및 토양 미생물에서 미생물 dysbiosis (즉, 민감하고 내성인 박테리아 종의 불균형)를 생성할 수 있다. 더욱이, 글리포세이트 내성 박테리아의 증가는 다제내성 미생물 14,41,42를 촉진시킬 수 있다는 가설이 제기되었다. 따라서, 이 프로토콜은 EPSPS 분류 방법이 글리포세이트에 대한 마이크로바이옴의 내재적 감수성의 직접적인 추정치를 제공하기 때문에 이러한 모든 시나리오의 해석에 대해 조명한다. 글리포세이트에 대한 EPSPS 단백질의 내재적 민감성으로 인해 계통유전학적으로 보존되고(14), 기존 데이터세트로부터의 결과를 알려지지 않은 마이크로바이옴으로 추정할 수 있다(도 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig01.jpg"> 그림 1 : 일반 파이프 라인 현장 실험에서 생물 정보학 분석에 이르기까지 GBP에 대한 민감도를 분석하는 일반적인 파이프 라인입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig02.jpg"> 도 2: 작물 식물 관련 미생물에 대한 GBP 잔류물의 효과를 시험하기 위한 현장 실험 1. 실험 필드는 플롯 사이에 1.5m 버퍼 스트립이있는 10 개의 대조군 플롯과 10 GBP 처리 플롯 (23 m x 1.5 m)을 번갈아 가며 구성됩니다. 2014년 이후 1년에 2회, GBP 플롯을 상용 GBP(글리포세이트 농도 450 g L-1, 플롯 당 수돗물 5 L에서 적용 속도 6.4 L ha-1)와 글리포세이트가 없는 동일한 양의 수돗물로 대조군 플롯으로 처리하였다. 처리는 GBP가 처리 플롯 외부로 확산되는 것을 방지하기 위해 스프링클러 팁의 플라스틱 후드를 사용하여 손으로 작동하는 압력 탱크로 적용되었습니다. GBP 적용 후 두 주간의 안전 기간 후, 귀리 (Avena sativa), faba 콩 (Vicia faba) 및 순무 강간 (Brassica rapa subsp. oleifera)이 뿌려졌고 감자 (Solanum tuberosum)가 플롯에 심어졌습니다. 연구된 작물 식물, 잎 및 뿌리로부터의 Microbiota 샘플은 2014년 실험 개시 이후 여러 번 수집되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig03.jpg"> 그림 3: 현장 실험 2는 두 개의 다년생 작물과 관련 미생물에 대한 분뇨 비료의 GBP 잔류 물의 결과를 테스트했습니다. 12개월간의 조류 실험에서 채취한 침구류를 대조군 또는 GBP로 오염된 사료를 공급한 일본 메추라기를 이용한 실험에서 분뇨 비료로 사용하였다. 실험 분야는 6 x 6 체스 보드 그리드에 배열 된 18 개의 컨트롤과 18 GBP 플롯 (1m x 1m)으로 구성되었습니다. 침구는 2018 년 8 월과 2019 년 5 월 (25 L / 플롯)에 두 번 실험 현장에 퍼졌습니다. 대조구는 통제 사료를 먹인 메추라기에서 수집 된 침구와 GBP로 오염 된 사료를 먹인 메추라기에서 침구가있는 GBP 플롯으로 수정되었습니다. 대조군 침구의 글리포세이트 잔류물은 글리포세이트의 0.17 mg/kg이었고, GBP 침구에서, 그 양은 글리포세이트의 158 mg/kg이었다. 두 개의 내피 공생 (E +), 두 개의 내피가없는 (E-) Festuca pratensis, 그리고 두 개의 Fragaria x vescana 가 첫 번째 침구가 퍼진 지 약 한 달 후인 2018 년 9 월에 플롯 당 심어졌습니다. 식물 성능 및 체력의 측정뿐만 아니라 뿌리 및 잎 관련 미생물에 대한 샘플링은 두 번의 연속 성장기 (2019 &amp; 2020) 동안 수행되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig04.jpg"> 도 4: EPSPS 유전자를 이용한 16S rRNA 유전자/ITS 영역 및 글리포세이트에 대한 마이크로바이옴의 민감도를 이용한 미생물 탁사 분석. (A) 미생물 탁사를 확인하기 위한 16S rRNA 또는 ITS 서열의 분석. (B) 글리포세이트(GS-글리포세이트 민감성/GR-글리포세이트 내성)에 대한 미생물의 민감도를 확인하기 위한 EPSPS 서열 분석<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig04large.jpg" target="_blank">, 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig05.jpg"> 도 5: EPSPS 단백질 서열의 부류를 동정하는 알고리즘. 입력은 FASTA 포맷의 EPSPS 단백질 서열이다. 이 알고리즘은 글리포세이트에 대한 잠재적 감수성을 결정하는 참조 단백질 서열에서 공지된 아미노산 마커와 비교를 수행한다. 이 알고리즘은 자유롭게 액세스 가능한 웹 서버 EPSPSClass29에서 구현되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig06.jpg"> 그림 6: EPSPSClass 웹 서버의 기본 입력 및 출력 (a) 입력: FASTA 포맷의 EPSPS 단백질 서열. (b) 출력 1 - 동일성: 질의 서열 (클래스 I-IV) 및 모티프 (클래스 III)에 존재하는 아미노산 마커의 분획. (C) 출력 2 - 동일성 : 쿼리 및 참조 시퀀스의 정렬. (D) 출력 3 - 질의 및 참조 시퀀스의 쌍 정렬. (e) 참조 EPSPS 서열: 비브리오 콜레라 (vcEPSPS, 클래스 I), 콕시엘라 버네티 (cbEPSPS, 클래스 II), 브레분디모나스 수포성 (bvEPSPS, 클래스 III), 스트렙토마이세스 다바웬시스 (sdEPSPS, 클래스 IV). (F) 추가 blastp 검색 및 보존된 도메인의 식별을 수행하기 위한 링크 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig07.jpg"> 그림 7: EPSPS 시퀀스의 미리 계산된 데이터 세트에 대한 액세스 그림의 표시에 따라 EPSPS 시퀀스의 미리 계산된 데이터 세트에 액세스합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig08.jpg"> 도 8: EPSPS 서열이 없는 마이크로바이옴 프로젝트에서 잠재적 감수성을 추정하는 방법의 예. 이 예제에서는 원핵 종의 서열을 포함하는 정렬 가능한 타이트 게놈 클러스터(30)의 데이터베이스의 값을 사용합니다. 마이크로바이옴 프로젝트의 가설 종은 스타필로코커스 아우레우스, 코리네박테리움 디프테리아, 캄필로박터 제주니, 클라미디아 시타치 및 설폴로버스 섬감기이다. 글리포세이트에 대한 민감도 점수는 Number_Sensitive_Sequences/Total_Number_Of_Sequences로 계산됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig09.jpg"> 그림 9 : 이 프로토콜과 가상의 진화 시나리오의 결과 해석 계획. (A) 미생물에서 잠재적 인 감도 (녹색)와 저항 (빨간색) 박테리아의 비율은 약 50:50입니다. 검은 점들은 분류되지 않은 미생물 종을 나타내고; 따라서, 글리포세이트에 대한 그들의 민감성은 알려져 있지 않다. 일부 미생물에서, 민감한 박테리아의 비율은 인간 장내 미생물12에서와 같이 약간 더 높다. (b) 시간이 지남에 따라, 글리포세이트의 사용은 미생물 dysbiosis (즉, 민감하고 내성 박테리아의 비율의 불균형)로 이어질 수 있으며, 이는 상이한 가설적 시나리오로 이어진다. (C) 가설적인 사례 1 (선택 없음) : 글리포세이트의 사용은 미생물에 영향을 미치지 않는다; 따라서 민감하고 내성이 강한 박테리아의 비율은 일정하게 유지됩니다. (D) 가상의 경우 2: 글리포세이트의 사용은 글리포세이트에 민감한 박테리아를 집단으로부터 제거한다. 우리는이 시나리오가 복용량에 따라 다를 수 있다고 추측합니다. (E) 가설적인 사례 3: 글리포세이트의 사용으로부터의 선택 압력은 박테리아의 민감성 상태를 변화시키는 EPSPS 유전자의 돌연변이를 강화시킨다. 따라서, 전체 미생물 집단은 글리포세이트에 내성을 갖게 된다. 또한,이 시나리오에서는 다제 내성 박테리아가 증가 할 수 있습니다. (F) 가상의 경우 4 : 글리포세이트의 사용은 특정 박테리아 종의 구성을 변경시켜 내성 박테리아에 대한 불균형을 일으키는 반면, 일부 박테리아 종은 유출 펌프와 같은 추가적인 내성 메커니즘 또는 EPSPS 유전자13의 과발현으로 인해 변경되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이 시나리오는 또한 글리포세이트 내성 박테리아의 증가뿐만 아니라 추가 항생제에 대한 박테리아 내성의 증가로 이어질 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig09large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig10v2.jpg"> 그림 10: 종 트리에 걸친 글리포세이트에 대한 예측된 민감도의 분포. 원형 차트는 글리포세이트에 대해 추정적으로 민감한(녹색) 또는 내성(빨간색) 종과 분류되지 않은(검정) 종의 비율을 나타냅니다. 이 수치는 Rainio et al.14의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig10largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig10.jpg"> 그림 11: 사용자 자신의 참조 시퀀스를 테스트하기 위한 EPSPSClass 웹 서버의 입력 및 출력. (A) 입력 1: 쿼리 시퀀스. (B) 입력 2: 참조 시퀀스. (c) 입력 3: 참조 서열의 아미노산 마커. (d) 출력: 동일성: 질의 서열에서 아미노산 마커의 분획 (클래스 I-IV 및 사용자 자신의 참조 서열). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 마이크로바이옴 분석에서 16S rRNA 유전자 및 ITS 영역의 PCR 증폭을 위한 프라이머 목록은 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%201-63109R2.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 2: 다른 데이터베이스에서 효소 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소(EPSPS)의 코드는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%202_63109R2.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 3: 평균 글리포세이트 농도 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%203-63109R2.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 4: 글리포세이트에 민감한/내성인 종의 백분율에 대한 요약 표. 이 테이블은 Rainio et al.14의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%204-63109R2.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 5: 참조 서열에서 아미노산 마커의 위치는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%205-63109R2.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

글리포세이트 기반 제품(GBP)은 전 세계적으로 가장 일반적인 광범위한 스펙트럼 제초제입니다. 이 기사에서는 현장 실험에서 생물 정보학 분석에 이르기까지 GBP가 미생물에 미치는 영향을 정량화하기위한 일반적인 지침을 소개합니다.

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme ...

여기에서, 우리는 글리포세이트가 마이크로바이옴에 미치는 영향을 평가하기 위한 실험을 수행하기 위한 최상의 생물정보학 방법을 포함하는 워크플로우를 제공한다. 가장 큰 장점은 미래의 현장 및 실험실 실험을위한 강력한 테스트 가능한 가설을 제공한다는 것입니다. 설명된 방법론은 식물, 동물 및 미생물을 포함하는 다양한 시스템에 적용될 수 있다.방법론의 각 부분은 매우 간단합니다. 아마도 가장 어려운 부분은 작업의 다른 부분을 수행 할 수있는 여러 분야의 팀을 통합하는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구원 인 Suni Matthew가 될 것입니다.시작하려면 실험 필드를 플롯 사이에 식물의 버퍼 스트립으로 대조군과 GBP 처리의 10 번의 반복실험으로 나눠서 실험을 시작하십시오. 대조군 플롯을 수돗물로 처리하고 GBP 플롯을 상업용 GBP로 처리하여 농업 관행에서 허용되는 최대 글리포세이트 복용량을 모방하십시오. 실험 식물에서 미생물을 샘플링하십시오.현장에서 식물 샘플의 10 반복본을 수집하여 즉시 얼음 위에 놓고 추가 처리를 위해 실험실로 가져 오십시오. 두 번째 실험의 경우, 12 개월 조류 실험에서 GBP로 오염 된 메추라기에서 나무 부스러기, 대변 및 일부 엎질러 진 사료를 포함한 침구를 수집하십시오. 침구 샘플을 확산 후 직접 글리포세이트 농도 측정을 위해 공인 실험실로 보내십시오.다년생 풀과 딸기 식물을 각 플롯에 심어 뿌리와 잎 미생물을 연구하십시오. 식물 샘플을 세척 및 멸균하여 내피 미생물을 확인하고 제거하십시오. 샘플이 멸균되면 제조업체의 프로토콜에 따라 시판되는 식물 DNA 추출 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다.중첩된 접근법을 사용하여, 16S rRNA 유전자의 가변 영역 V6 내지 V8을 증폭시키고, 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 필요한 수의 샘플에 대해 PCR 마스터 믹스를 만든다. PCR의 첫 번째 라운드에서는 프라이머 799 포워드와 1492 역전을 사용하십시오. 35 사이클 동안 열순환기에서 증폭 프로파일을 설정하십시오.증폭을 확인하기 위해 5 마이크로 리터의 증폭 된 생성물을 사용하여 전기 영동을 수행 한 다음 나머지 25 마이크로 리터의 PCR 산물을 오토클레이브 초순수에 1 ~ 10의 비율로 희석하십시오. 범용 프라이머(1062)를 정방향 및 역방향(1390)을 사용하여, 25 사이클의 증폭의 두 번째 라운드를 수행한다. 생성된 PCR 산물을 오토클레이브된 초순수에 동일한 비율로 희석한다.여덟 번의 주기로 세 번째 증폭 라운드를 수행하여 제품에 바코드 및 P1 어댑터 시퀀스를 태그합니다. 바이오분석기 상에서 PCR 산물의 품질 농도를 검증하고, 각 샘플의 DNA의 30나노그램을 구성하는 부피를 1.5밀리리터 튜브에 풀링하여 등몰 라이브러리를 제조하였다. 아가로스 겔 카세트에서 자동화된 DNA 크기 선택 시스템을 사용하여 크기 분별에 의해 크기 350 내지 550 염기쌍의 앰플리콘을 선택하십시오.지정된 크기의 앰플리콘을 포함하는 용출액을 카세트에 바이알에 넣고 수집하여 정제된 16S rRNA 유전자 라이브러리를 생성한다. 수집 된 용리액을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 바이오 분석기의 순도 및 농도를 확인합니다. 오토클레이브된 초순수를 사용하여 DNA 라이브러리를 최종 농도 26 피코몰로 희석한다.ITS 영역을 증폭시키기 위해, ITS 프라이머로 반응을 설정한 후, 열순환기 상에 증폭 프로파일을 설정한다. 그런 다음 증폭 된 생성물의 5 마이크로 리터를 1.5 % 아가로스 겔에서 분석하고 오토클레이브 된 초순수를 사용하여 나머지 25 마이크로 리터의 생성물을 1 ~ 10의 비율로 희석하십시오. 바코드 태그가 지정된 정방향 프라이머 및 P1 어댑터 태그가 지정된 역방향 프라이머를 사용하여 필요한 수의 샘플에 대해 PCR 마스터 믹스를 만듭니다.희석된 PCR 산물을 주형으로 사용하여, 증폭의 두 번째 라운드를 실시한다. 16S rRNA 유전자에 대한 라이브러리 제제와 유사하게, 정제된 ITS 영역에 대한 라이브러리를 준비한다. EPSPS 단백질 서열의 생물정보학 분석을 개시한다.서버 제공 출력으로부터 글리포세이트에 대한 질의 서열의 잠재적 민감도를 평가하고, 여기서 출력은 질의 서열에 존재하는 아미노산 마커의 분획 및 모티프의 수를 나타낸다. 출력 두 개는 마커 잔기에 기초한 질의 및 참조 서열의 정렬을 나타낸다. 출력 세 개는 쿼리 및 참조 시퀀스의 전체 쌍 단위 정렬을 보여 줍니다.출력 네 개는 Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis 및 Streptomyces davawensis의 EPSPS 참조 서열을 보여줍니다. 출력 페이지의 끝에서 BLASTp 및 보존된 도메인과 같은 외부 도구에 대한 링크를 찾아 쿼리 EPSPS 시퀀스를 추가로 분석합니다. 공용 저장소에서 EPSPS 시퀀스를 식별한 후 분류 정보가 포함된 EPSPS 클래스 서버의 기본 페이지와 50,000개 이상의 시퀀스의 EPSPS 클래스에서 이러한 데이터 세트에 액세스합니다.필드 시즌이 끝날 때 식물의 지상 바이오 매스를 계량하여 GBP와 대조군 플롯에서 식물의 성장을 비교하십시오. 스프레드시트에서 마이크로바이옴 실험을 위한 박테리아 OTU를 미리 계산된 데이터 세트에 매핑합니다. 그리고 확률적 점수에 기초하여, 글리포세이트에 대한 내재적 민감도를 계산한다.이 방법은 EPSPS 단백질의 민감도 변화를 미세진화 수준에서 정량화하는데 사용되었다. 우리는 분석 된 원핵 생물의 밀접하게 관련된 32 그룹 중 12 개에서 민감도 상태의 변화를 확인했습니다. 따라서, 글리포세이트계 제품의 지속적인 사용은 식물, 동물 및 토양 미생물에서 미생물 이형성을 생성할 수 있다.최적의 앰플리콘 라이브러리를 얻기 위해 PCR 전후 절차의 품질을 보장하십시오. 또한 소프트웨어를 사용하기 전에 EPSPS 단백질 서열이 부분적이지 않은지 확인하십시오. 현장 실험에서 글리포세이트로 컨트롤의 오염을 방지해야 합니다.

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Research

연구

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Environment

환경

범블 비 하이브 내 미생물 컨소시엄 풍부 하 고 꽃가루 꿀벌 애벌레에 대 한 유지. 살 균 제 잔류물 꽃가루 미생물, 및 궁극적으로 식민지로 이어지는 식민지 인구 통계를 변경 하는 가설을 테스트 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다이 원고 실험실 및 필드 기반 실험 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 손실입니다.

실험, Metagenomic, 및 계산 기법 밝히는 어떤 균 타협 꿀벌 건강 메커니즘

필드에서 식물 뿌리의 발굴 뿐만 아니라 endosphere, rhizosphere, 및 토양 샘플의 처리는 DNA 추출 및 데이터 분석 방법 등 자세하게에서 설명 되어 있습니다. 이 문서는 토양, endosphere, rhizosphere microbiomes의 연구에 대 한 이러한 기법을 사용 하 여 다른 실험실을 사용 하도록 설계 되었습니다.

절연 및 토양, Rhizosphere, 및 다년생 잔디 실험에 뿌리에서 미생물 커뮤니티의 분석

여기 우리가 제공 자세한 프로토콜 항생제의 구강 관리에 대 한 쥐, 배설물 샘플, DNA 추출 및 배설물 박테리아의 정량화를 정량 하 여.

구두 항생제 치료 후 Murine 장 Microbiota의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응-기반 분석

이 프로토콜은 인체 배설물 미생물의 체외 배치 배양 발효 시스템을 설명하며, 이눌린(잘 알려진 프리바이오틱 및 가장 널리 연구된 미생물 변조기 중 하나)을 사용하여 특정 한 효과의 효과를 추정하는 데 이 시스템의 사용을 입증합니다. 대변 미생물 구성 및 대사 활동에 대한 개입.

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뿌리 삼출물의 분비는 일반적으로 스트레스 조건에서 식물에 대한 외부 해독 전략입니다. 이 프로토콜은 비표적 대사체 분석을 통해 알팔파에 대한 생체이물의 영향을 평가하는 방법을 설명합니다.

디(2-에틸헥실) 프탈레이트가 대사 산물 생산에 미치는 영향을 연구하기 위한 알팔파 뿌리 삼출물 수집

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 은 숙주-마이크로바이옴 상호작용을 유도하는 분자 결정 요인을 조사할 수 있는 강력한 모델입니다. 우리는 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 생리학의 주요 측면과 함께 장내 마이크로바이옴 집락화의 단일 동물 수준을 프로파일링하는 고처리량 파이프라인을 제시합니다.

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여기에 제시된 것은 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS-MS)을 사용하여 수경 조건 하에서 밀에서 이미다클로프리드의 흡수, 전위 및 분포를 측정하기 위한 프로토콜입니다. 결과는 이미다클로프리드가 밀에 흡수될 수 있고 이미다클로프리드가 밀 뿌리와 잎 모두에서 검출된다는 것을 보여주었습니다.

밀에서 imidacloprid의 흡수, 전위 및 분포 측정

본 프로토콜은 식물에서 2,4-디브로모페놀 대사산물을 식별하기 위한 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다.

식물에서 2,4-dibromophenol의 대사 해명

이 프로토콜은 식물에서 트리아졸 살충제의 대사 산물의 통합 세포 독성을 평가하는 새로운 방법을 설명합니다.

식물에서 전형적인 Triazole 살충제의 대사 산물의 세포 독성 평가

토양 세포 외 효소 활성의 잠재적 인 속도를 측정하기 위해 형광 염료에 바인딩 된 합성 기판은 토양 샘플에 추가됩니다. 형광 염료는 높은 형광 이상의 기판을 나타내는 분해 효소 - 촉매 반응에 의해 기판으로부터 방출 될 때 효소 활성을 측정한다.

잠재적 인 토양 세포 외 효소 활동의 높은 처리량 형광 측정 측정

배우세요 글리포세이트 기반 제품이 식물, 동물, 토양 미생물군집에 미치는 영향을 정량화하는 생물정보학 방법론입니다. 이 워크플로우는 미생물 생태학 연구에 활용 가능한 강력한 실험 설계를 제공합니다.

글리포세이트 기반 제품이 마이크로바이옴에 미치는 잠재적 영향의 정량화

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