Name: 인간 유도 만능 줄기 세포와 그 신경 및 신경교 유도체에서 여러 미토콘드리아 파라미터의 유세포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 학습하세요 인간 유도 만능 줄기 세포와 신경 및 신경교 유도체에서 유세포 분석을 이용한 미토콘드리아 기능 평가 방법을. 이 기법은 신경퇴행성 질환의 미토콘드리아 기능 장애 연구와 치료제 선별에 활용됩니다.

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노르웨이 베르겐 대학교의 분자 이미징 센터와 유세포 분석 핵심 시설에 감사드립니다. 이 연구는 노르웨이 연구위원회 (보조금 번호 : 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat 및 중국 장학위원회 (프로젝트 번호 : 201906220275)의 자금으로 지원되었습니다.

<ol><li>Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+the+potential+countermeasure%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neuroscience+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure.</a> CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).</li>
<li>Chen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+riboside+and+metformin+ameliorate+mitophagy+defect+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocytes+with+POLG+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304(2021).</li>
<li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+phenotypes+in+iPSC-derived+neural+stem+cells+with+POLG+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations.</a> EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146(2020).</li>
<li>Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics--fusion%2C+fission%2C+movement%2C+and+mitophagy--in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases.</a> Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).</li>
<li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li>
<li>Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%3A+A+key+modulator+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases.</a> Molecules. 24 (8), Basel, Switzerland. 1583(2019).</li>
<li>Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interplay+between+cristae+biogenesis%2C+mitochondrial+dynamics+and+mitochondrial+DNA+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311(2019).</li>
<li>Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+human+disease+using+stem+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Investigating human disease using stem cell models.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).</li>
<li>Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell+models+of+disease+and+the+prognosis+of+academic+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine.</a> Nature Medicine. 26 (4), 449(2020).</li>
<li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylcysteine+amide+ameliorates+mitochondrial+dysfunction+and+reduces+oxidative+stress+in+hiPSC-derived+dopaminergic+neurons+with+POLG+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation.</a> Experimental Neurology. , 337(2021).</li>
<li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-derived+dopaminergic+neurons+function+in+a+primate+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.</a> Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).</li>
<li>Juopperi, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+generated+from+patient+induced+pluripotent+stem+cells+recapitulate+features+of+Huntington%27s+disease+patient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells.</a> Molecular Brain. 5, 17(2012).</li>
<li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+derived+astrocytes+with+POLG+mutations+and+mitochondrial+dysfunction+including+abnormal+NAD%2B+metabolism+is+toxic+for+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+ESCs+and+induced+pluripotent+stem+cells%3A+induction%2C+maintenance%2C+and+differentiation+into+functional+schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).</li>
<li>Hong, Y. J., Do, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+lineage+differentiation+from+pluripotent+stem+cells+to+mimic+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400(2019).</li>
<li>Lundin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS-derived+astroglia+from+a+stable+neural+precursor+state+show+improved+functionality+compared+with+conventional+astrocytic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).</li>
<li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylcysteine+amide+ameliorates+mitochondrial+dysfunction+and+reduces+oxidative+stress+in+hiPSC-derived+dopaminergic+neurons+with+POLG+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation.</a> Experimental Neurology. 337, 113536(2021).</li>
<li>Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+MitoTracker+Green%E2%84%A2+and+CMXrosamine+to+measure+changes+in+mitochondrial+membrane+potentials+in+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues.</a> Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).</li>
<li>Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+mitochondrial+membranes+with+10-nonyl+acridine+orange%2C+MitoFluor+Green%2C+and+MitoTracker+Green+is+affected+by+mitochondrial+membrane+potential+altering+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs.</a> Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).</li>
<li>Buckman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MitoTracker+labeling+in+primary+neuronal+and+astrocytic+cultures%3A+influence+of+mitochondrial+membrane+potential+and+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants.</a> Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).</li>
<li>Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-density-dependent+changes+in+mitochondrial+membrane+potential+and+reactive+oxygen+species+production+in+human+skin+cells+post+sunlight+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Photodermatology%2C+Photoimmunology+%26+Photomedicine%22%5BJournal%5D)">Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure.</a> Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

본원에는 iPSC 유래 뉴런 및 성상세포를 생성하고 유세포분석을 사용하여 미토콘드리아 기능의 여러 측면을 평가하기 위한 프로토콜이 있습니다. 이러한 프로토콜을 통해 인간 iPSC를 뉴런과 신경교 성상 세포로 효율적으로 변환하고 대부분 살아있는 세포에서 미토콘드리아 기능을 자세히 특성화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 살아있는 세포의 부피, MMP 및 미토콘드리아 ROS 수준과 고정 세포의 MRC 복합체 및 TFAM을 포함한 여러 미토콘드리아 기능을 획득하고 분석하기 위한 공동 염색 유세포분석 기반 전략을 제공합니다. 특히, 이러한 프로토콜은 미토콘드리아 부피 당 전체 및 특정 수준의 추정을 허용합니다. 이 전략은 DA 뉴런 및 성상 세포에서 알려진 미토콘드리아 질환 (POLG)에서 미토콘드리아 기능 장애를 감지하지만 이러한 기술은 모든 유형의 세포 및 질병에 적용 할 수 있습니다. 또한 프로토콜은 강력하고 재현 가능합니다. 이전의 여러 연구에서는 섬유 아세포, iPSC, NSC, DA 뉴런 및 성상 세포<sup class="...

미토콘드리아는 거의 모든 진핵 세포에 존재하는 필수 세포 기관입니다. 미토콘드리아는 산화적 인산화를 통해 아데노신 삼인산(ATP)을 생성하여 에너지 공급을 담당하고 생합성 및 대사를 위한 대사 매개체 역할을 합니다. 미토콘드리아는 ROS 생성, 세포 사멸 및 세포 내Ca2+ 조절과 같은 다른 많은 중요한 세포 과정에 깊이 관여합니다. 미토콘드리아 기능 장애는 파킨슨병(PD), 알츠하이머병(AD), 헌팅턴병(HD), 프리드라이히 운동실조증(FRDA) 및 근위축성 측삭 경화증(ALS)1을 비롯한 다양한 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다. 증가된 미토콘드리아 기능 장애 및 mtDNA 이상도 인간의 노화에 기여하는 것으로 생각됩니다 2,3.
다양한 유형의 미토콘드리아 기능 장애가 신경 퇴행성 질환에서 발생하며 미토콘드리아 부피의 변화, MMP 탈분극, ROS 생성 및 mtDNA 복제 수의 변화가 일반적입니다 4,5,6,7. 따라서 이러한 기능 및 기타 미토콘드리아 기능을 측정하는 능력은 질병 메커니즘을 연구하고 잠재적 인 치료제를 테스트 할 때 매우 중요합니다. 더욱이, 인간 신경퇴행성 질환을 충실하게 복제하는 동물 모델의 부족을 고려할 때, 뇌 세포에서 인간 질병을 요약하는 적절한 시험관내 모델 시스템을 확립하는 것은 이러한 질병에 대한 더 큰 이해와 새로운 치료법의 개발을 향한 중요한 단계입니다 2,3,8,9.
인간 iPSC는 뉴런 및 비뉴런 세포(즉, 신경교 세포)를 비롯한 다양한 뇌 세포를 생성하는데 사용될 수 있으며, 신경퇴행성 질환과 관련된 미토콘드리아 손상은 두 세포 유형 3,10,11,12,13 모두에서 발견되었다. 신경 및 신경교 계통으로의 iPSC 분화를 위한 적절한 방법이 이용가능하다14,15,16. 이 세포는 시험관 내 질병 모델링 및 약물 스크리닝을 위한 고유한 인간/환자 플랫폼을 제공합니다. 또한 환자에서 파생되기 때문에 iPSC 유래 뉴런과 신경교 세포는 인간에서 일어나는 일을보다 정확하게 반영하는 질병 모델을 제공합니다.
현재까지 iPSC, 특히 살아있는 뉴런과 신경교 세포에서 여러 미토콘드리아 기능 파라미터를 측정하는 편리하고 신뢰할 수 있는 방법은 거의 없습니다. 유세포 분석의 사용은 과학자에게 단일 세포에서 미토콘드리아 기능을 포함한 생물학적 매개 변수를 측정하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 이 프로토콜은 iPSC의 신경 줄기 세포(NSC), 뉴런 및 신경교 성상세포를 포함한 다양한 유형의 뇌 세포 생성에 대한 세부 정보와 iPSC 및 iPSC 유래 신경 및 신경교 세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 여러 미토콘드리아 매개변수를 측정하는 새로운 유세포 분석 기반 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 유세포분석을 사용하여 미토콘드리아 부피, MMP, 미토콘드리아 ROS 수준, MRC 복합체 및 TFAM을 측정하기 위한 공동염색 전략을 제공합니다. 미토콘드리아 부피 또는 질량의 측정을 통합함으로써, 이러한 프로토콜은 또한 미토콘드리아 단위 당 총 수준과 특정 수준의 측정을 허용합니다.

<table><tbody><tr><td>anti-Oct4</td><td>Abcam</td><td>ab19857, RRID:AB_445175</td><td>일차 항체; 1:100, 10 &mu로 사용; L in 1000 &mu; L 염색 용액; Alexa Fluor &reg를 사용하십시오. 488 염소 안티 토끼 IgG&nbsp; (1:400, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # A-11008)를 2차 항체로 사용합니다.</td></tr><tr><td>anti-SSEA4</td><td>Abcam</td><td>ab16287, RRID:AB_778073</td><td>일차 항체; 1:100, 10 &mu로 사용; L in 1000 &mu; L 염색 용액; Alexa Fluor &reg를 사용하십시오. 2차 항체로 594 염소 항-마우스 IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # A-11005).</td></tr><tr><td>anti-Sox2</td><td>Abcam</td><td>ab97959, RRID:AB_2341193</td><td>일차 항체; 1:100, 10 &mu로 사용; L in 1000 &mu; L 염색 용액; Alexa Fluor &reg를 사용하십시오. 488 염소 안티 토끼 IgG&nbsp; (1:400, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # A-11008)를 2차 항체로 사용합니다.</td></tr><tr><td>anti-Pax6</td><td>Abcam</td><td>ab5790, RRID:AB_305110</td><td>일차 항체; 1:100, 10 &mu로 사용; L in 1000 &mu; L 염색 용액; Alexa Fluor &reg를 사용하십시오. 488 염소 안티 토끼 IgG&nbsp; (1:400, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # A-11008)를 2차 항체로 사용합니다.</td></tr><tr><td>anti-Nestin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927, RRID:AB_627994</td><td>일차 항체; 1:50, 20 &mu로 사용; L in 1000 &mu; L 염색 용액; Alexa Fluor &reg를 사용하십시오. 2차 항체로 594 염소 항-마우스 IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # A-11005).</td></tr><tr><td>anti-GFAP</td><td>Abcam</td><td>ab4674, RRID:AB_304558</td><td>일차 항체; 1:100, 10 &mu로 사용; L in 1000 &mu; L 염색 용액; &nbsp; Alexa Fluor &reg를 사용하십시오. 594 염소 항닭 IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # A-11042)를 2차 항체로 사용합니다.</td></tr><tr><td>안티 S100&베타; &nbsp; Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab196442, RRID:AB_2722596</td> 1차 항체와 결합<td>; 1:400, 2.5 &mu로 사용; L in 1000 &mu; L 염색 용액;</td></tr><tr><td>anti-TH</td><td>Abcam</td><td>ab75875, RRID:AB_1310786</td><td>일차 항체; 1:100, 10 &mu로 사용; L in 1000 &mu; L 염색 용액; Alexa Fluor &reg를 사용하십시오. 488 염소 안티 토끼 IgG&nbsp; (1:400, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # A-11008)를 2차 항체로 사용합니다.</td></tr><tr><td>anti-Tuj 1</td><td>Abcam</td><td>ab78078, RRID:AB_2256751</td><td>일차 항체; 1:1000, 1 &mu로 사용; L in 1000 &mu; L 염색 용액; Alexa Fluor &reg를 사용하십시오. 2차 항체로 594 염소 항-마우스 IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # A-11005).</td></tr><tr><td>anti-Synaptophysin</td><td>Abcam</td><td>ab32127, RRID:AB_2286949</td><td>1차 항체; 1:100, 10 &mu로 사용; L in 1000 &mu; L 염색 용액; Alexa Fluor &reg를 사용하십시오. 488 염소 안티 토끼 IgG&nbsp; (1:400, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # A-11008)를 2차 항체로 사용합니다.</td></tr><tr><td>anti-PSD-95</td><td>Abcam</td><td>ab2723, RRID:AB_303248</td><td>일차 항체; 1:100, 10 &mu로 사용; L in 1000 &mu; L 염색 용액; &nbsp; Alexa Fluor &reg를 사용하십시오. 594 염소 항닭 IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # A-11042)를 2차 항체로 사용합니다.</td></tr><tr>Alexa Fluor 488 <td>Abcam</td><td>ab198308</td> 1차 항체<td>와 접합된 anti-TFAM</td><td>; 1:400, 2.5 &mu로 사용; L in 1000 &mu; L 염색 용액; 마우스 단클론 IgG2b&nbsp를 사용하십시오. 알렉사 플루오&reg; 488을 isotype control로 사용합니다.</td></tr><tr><td>anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Cat# sc-17764 RRID:AB_628381</td><td>Primary 항체; 1:400, 2.5 &mu로 사용; L in 1000 &mu; L 염색 용액; 마우스 단클론 IgG2a 사용&nbsp; 알렉사 플루오&reg; 488을 isotype control로 사용합니다.</td></tr><tr><td>anti-NDUFB10</td><td>Abcam</td><td>ab196019</td><td>일차 항체; 1:1000, 1 &mu로 사용; L in 1000 &mu; L 염색 용액; Alexa Fluor &reg를 사용하십시오. 488 염소 안티 토끼 IgG&nbsp; (1:400, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # A-11008)를 2차 항체로; 토끼 단클론 IgG를 동형 대조군으로 사용합니다.</td></tr><tr><td>anti-SDHA</td><td>Abcam</td><td>ab137040</td><td>일차 항체; 1:1000, 1 &mu로 사용; L in 1000 &mu; L 염색 용액; &nbsp; Alexa Fluor &reg를 사용하십시오. 488 염소 안티 토끼 IgG&nbsp; (1:400, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # A-11008)를 2차 항체로; 토끼 단클론 IgG를 동형 대조군으로 사용합니다.</td></tr><tr><td>anti-COX IV</td><td>Abcam</td><td>ab14744, RRID:AB_301443</td><td>일차 항체; 1:1000, 1 &mu로 사용; L in 1000 &mu; L 염색 용액; 사용&nbsp; 알렉사 플루어 &reg; 488 염소 안티 마우스 IgG&nbsp; (1:400, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # A-11001)를 2차 항체로; 마우스 단클론 IgG를 동형 대조군으로 사용합니다.</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>PeproTech</td><td>120-14E</td><td>성상세포 분화 배지 성분</td></tr><tr><td>ABM 기초 배지</td><td>Lonza</td><td>CC-3187</td><td>성상세포 배양을 위한 기초 배지</td></tr><tr><td>AGM SingleQuots Supplement Pack</td><td>Lonza</td><td>CC-4123</td><td>성상세포 배양을 위한 보충제</td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>CDM 성분</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634010</td><td>묽은 Geltrex</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Europa Bioproducts</td><td>EQBAH62-1000</td><td>면역염색 분석에서 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위한 차단제 및 CDM 성분</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-02</td><td>DA 뉴런 배지 성분</td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>성상세포 분화 배지 성분</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Plus 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>화학적으로 정의된 지질 농축액</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11905031</td><td>CDM 성분</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104019</td><td>인간 iPSC의 부드러운 해리를 위한 시약</td></tr><tr><td>CCD 현미경 카메라 Leica DFC3000 G</td><td>Leica Microsystems, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 비처리 배양 접시</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430589</td><td>현탁 배양</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td>다양한 세포 배양에 사용</td></tr><tr><td>세척 DMEM/F-12, GlutaMAX 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10565018</td><td>성상세포 분화 기저 매체</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher </td><td></td><td>인간 iPSC의 부드러운 해리를 위한 과학 15575020 시약</td></tr><tr><td>필수 8 기초 배지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>A1516901 iPSC 배양을 위한 기초 배지</td></tr><tr><td>필수 8 보충제 (50X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517101</td><td>iPSC 배양을 위한</td></tr><tr><td>보충제 EGF 재조합 인간 단백질</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0314</td><td>NSC 배양을 위한 보충제</td></tr><tr><td>FGF-베이직 (AA 10&ndash; 155) NSC 배양을 위한 재조합 인간 단백질</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0024</td><td>보충제</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12103C</td><td>Medium ingredient</td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Abcam</td><td>ab120081</td><td>Eliminate mitochondrial membrane potential and TMRE staining</td></tr><tr><td>유체 흡인 시스템 BVC 제어</td><td>Vacuubrand, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드(PFA) 16%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>세포 고정</td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td>인간 iPSC의 부착 및 유지 관리에 사용</td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>NSC 배양</td></tr><tr><td>GDNF</td>용 보충제<td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>DA 뉴런 매체 성분</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td>완충액 차단에 사용</td></tr><tr><td>Ham's F-12 영양 혼합물</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31765027</td><td>CDM용 기초 배지</td></tr><tr><td>Heregulin beta-1 human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP3055</td><td>Astrocyte 분화 매체</td></tr><tr><td>성분 Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1399</td><td>컨포칼 이미지용 핵 염색</td></tr><tr><td>Heracell 150i CO2 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21980032</td><td>CDM용 기저 배지</td></tr><tr>인<td>슐린</td><td>Roche</td><td>1376497</td><td>CDM 성분</td></tr><tr><td>InSolution AMPK 억제제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>171261</td><td>신경 유도 배지 성분</td></tr><tr><td>인슐린 유사 성장 인자-I 인간</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3769</td><td>성상세포 분화 배지 성분</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12 배지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12660012</td><td>NSC 배양을 위한 기초 배지</td></tr><tr><td>라미닌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>신경 세포의 부착 및 성장 촉진 in vitro</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 STED 컨포칼 현미경</td><td>Leica Microsystems, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>모노티오글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>CDM 성분</td></tr><tr><td>MitoTracker Green FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M7514</td><td>미토콘드리아 부피 표시기에 사용</td></tr><tr><td>MitoSox Red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M36008</td><td>미토콘드리아 ROS 표시기에 사용</td></tr><tr><td>N-아세틸-L-시스테인</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td>신경 유도 배지 성분</td></tr><tr><td>N-2 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td>Astrocyte 분화 매체 성분</td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td>완충액</td></tr><tr><td>오비탈 셰이커 차단에 사용 - SSM1</td><td>Stuart Equipment, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>체외 신경 세포의 부착 및 성장 촉진</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine 하이드로브로마이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7405</td><td>체외 신경 세포의 부착 및 성장 촉진</td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72204</td><td>DA 뉴런 분화 촉진</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>컨포칼 이미지</td></tr><tr><td>용 커버슬립 장착PBS 1x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td>다양한 세척</td></tr><tr><td>재조합 인간/마우스 FGF-8b 단백질</td><td>R&에 사용됩니다. D Systems</td><td>423-F8-025/CF</td><td>DA 뉴런 분화 촉진</td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>TB1614-GMP</td><td>신경 유도 배지 성분</td></tr><tr><td>StemPro 신경 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10508-01</td><td>NSC 배양을 위한 보충제</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td>세포 <td>해리 시약</td></tr><tr><td>트랜스페린</td><td>Roche</td><td>652202</td><td>CDM 성분</td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>VWR International</td><td>9002-93-1</td><td>면역 염색 분석에서 세포 투과화에 사용</td></tr><tr><td>TMRE</td><td>Abcam</td><td>ab113852</td><td>미토콘드리아 막 전위 염색에 사용</td></tr><tr><td>수조 Jb Academy Basic Jba5 JBA5 그랜트 기기</td><td>그랜트 기기, 미국</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간 유도 만능 줄기 세포와 그 신경 및 신경교 유도체에서 여러 미토콘드리아 파라미터의 유세포 분석

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

미토콘드리아는 많은 신경 퇴행성 질환의 병태생리학에서 중요하다. 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 막 전위 (MMP), 활성 산소 종 (ROS)의 미토콘드리아 생산 및 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 복제 수의 변화는 종종 이러한 과정의 특징입니다. 이 보고서는 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 및 iPSC 유래 신경 및 신경교 세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 여러 미토콘드리아 매개변수를 측정하기 위한 새로운 유세포 분석 기반 접근 방식을 자세히 설명합니다. 이 흐름 기반 전략은 살아있는 세포를 사용하여 미토콘드리아 부피, MMP 및 ROS 수준을 측정하고 고정 세포를 사용하여 미토콘드리아 호흡 사슬(MRC) 및 미토콘드리아 전사 인자 A(TFAM)와 같은 mtDNA 관련 단백질의 구성 요소를 추정합니다. 
MitoTracker Green(MTG), 테트라메틸로다민 에틸 에스테르(TMRE) 및 MitoSox Red를 포함한 형광 리포터와의 공동 염색을 통해 미토콘드리아 부피, MMP 및 미토콘드리아 ROS의 변화를 정량화하고 미토콘드리아 함량과 관련시킬 수 있습니다. MRC 복합체 서브유닛 및 외부 미토콘드리아 막 20(TOMM20)의 트랜스로카제에 대한 항체를 이용한 이중 염색은 MRC 서브유닛 발현의 평가를 허용한다. TFAM의 양은 mtDNA 복제 수에 비례하므로 TOMM20 당 TFAM의 측정은 미토콘드리아 부피 당 mtDNA의 간접적 인 측정을 제공합니다. 전체 프로토콜은 2-3 시간 내에 수행 할 수 있습니다. 중요하게도, 이러한 프로토콜은 유세포 분석을 사용하여 미토콘드리아 부피 당 전체 수준과 특정 수준 모두에서 미토콘드리아 매개 변수를 측정 할 수 있습니다.

분화 방법 및 유세포 분석 전략에 대한 개략적인 설명이 그림 3에 나와 있습니다. 인간 iPSC는 신경 로제트로 분화된 다음 신경 영역으로 분화하기 위해 서스펜션 배양으로 들어 올려집니다. 신경 영역은 DA 뉴런으로 더욱 분화되고 성숙됩니다. 신경 구체는 단일 세포로 해리되어 신경교 성상 세포를 생성하고 NSC로 단층으로 재 도금 된 다음 성상 세포로 분화됩니다. 이 프로토콜은 MMP, 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 ROS 수준, MRC 복합체 서브유닛의 발현 수준 및 TFAM(상대적 mtDNA 복제 수의 간접 측정)을 측정하기 위해 유세포분석으로 샘플을 획득하고 분석하는 데 필요한 전략을 제공합니다. 구체적으로, 형광 리포터, TMRE 및 MTG와의 동시 염색을 사용하여 MMP 및 미토콘드리아 부피의 변화를 검출하고 정량화했습니다. MitoSox Red 및 MTG와의 동시 염색을 통해 살아있는 세포에서 미토콘드리아 ROS 생성을 측정할 수 있습니다. TOMM20과 함께 M...

이 연구는 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 막 전위, 활성 산소 종 수준, 미토콘드리아 호흡 사슬 조성 및 미토콘드리아 DNA의 변화를 감지하기 위해 두 개의 형광 리포터 또는 항체를 사용한 유세포 분석 및 이중 염색을 기반으로 여러 미토콘드리아 기능 매개 변수를 측정하는 새로운 접근 방식을보고합니다.

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...

우리의 프로토콜은 과학자에게 인간 IPS와 신경 및 투명 유도체의 단일 세포 수준에서 여러 마이크로 매개 변수를 결합하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 이 프로토콜은 유세포 분석을 사용하여 미토콘드리아 부피 당 전체 수준과 특정 수준 모두에서 미토콘드리아 매개 변수의 즐거움을 허용합니다. 이 기술은 다른 신경 퇴행성 질환의 세포 유형을 포함한 여러 세포 유형에 적용될 수 있습니다.따라서 이러한 질병 유형의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 잠재적으로 치료 스크리닝에 도움이 될 수 있습니다. 시작하려면 세포를 6웰 플레이트의 4웰에 별도로 시드하고 50-60%의 컨플루언시가 달성될 때까지 세포를 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 배양 배지, FCCP, TMRE, MTG 및 미토 양말 스프레드의 다양한 조합을 포함하는 5개의 개별 염색 용액을 준비합니다.그것들을 각각의 웰에 첨가하고, 원고에 기술된대로 세포를 배양한다. 다음으로 모든 우물에서 배지를 흡입하고 PBS로 씻으십시오. 세포 분리를 위해 섭씨 37도에서 5 분 동안 세포 해리 시약 1 밀리리터로 세포를 배양하십시오.10% FBS가 보충된 DMEM 1밀리리터로 세포 해리 시약을 중화합니다. 그런 다음 15 밀리리터 크로니클 튜브에 우물 내용물을 모으십시오. 원통화에 의해 세포를 펠릿화하고 PBS로 세포 펠릿을 한두 번 세척한다.모든 상청액을 흡인하여 튜브에 약 100 마이크로 리터를 남깁니다. 세포 펠릿을 300 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮긴 후 튜브를 실온의 어두운 곳에 보관하십시오.텍스트 원고에 설명된 대역 통과 필터 설정이 있는 유세포분석기를 사용하여 세포를 분석합니다. 세포 해리 시약을 사용하여 약 100만 개의 세포를 분리하고 이전에 입증된 대로 세포를 펠릿 다운합니다. DMEM과 10%FBS로 세포 현탁액을 중화하고 15밀리리터 튜브에 현탁액을 수집합니다.실온에서 1.6 % 파라 포름 알데히드 1 밀리리터로 세포를 10 분 동안 고정하십시오. 섭씨 영하 20도에서 20 분 동안 얼음처럼 차가운 90 % 메탄올 1 밀리리터로 세포를 투과시킵니다. 이어서 샘플을 1 밀리리터의 블로킹 완충액으로 차단하고, 입증된 바와 같이 PBS로 원심분리하여 세포를 세척한다.상이한 미토콘드리아 복합체 및 서브유닛을 검출하기 위해, 텍스트 원고에 기술된 각각의 1차 항체와 함께 세포를 30분 동안 배양한다. 세포를 PBS로 1회 세척한 후, 세포를 2차 항체와 함께 30분 동안 배양한다. 인큐베이션의 끝에, 입증된 바와 같이 세포 및 PBS를 세척하고 재현탁시킨다.세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기고 얼음 위의 어둠 속에 보관합니다. 다음으로, 유세포분석기에서 세포를 분석하고 신호를 검출한 후 5 30/30 대역 통과 필터를 사용하여 세포를 필터링합니다. 각 세포 부분모집단에 대해 히스토그램 플롯을 선택하고 서로 다른 필터 채널의 중앙값 형광 강도 또는 MFI를 분석합니다.TMRE 수준, MMP ROS 복합 서브유닛 및 TFAM에 대한 특정 값을 텍스트 원고에 설명된 대로 계산한다. 유세포분석기 및 살아있는 세포를 MMP 미토콘드리아 부피 및 ROS 수준을 조사하기 위해 사용하였다. POLG DA 뉴런에서, 더 낮은 특이적 MMP 및 더 높은 특이적 ROS가 관찰된 반면, 미토콘드리아 부피, 총 MMP 및 ROS에는 변화가 없었다.POLG 성상교세포는 MMP를 감소시켰지만, 미토콘드리아 부피 및 ROS에는 변화가 없었다. 유동 세포분석 및 고정 세포는 MRC 복합체 서브유닛 및 TFAM의 수준을 조사하기 위해 사용되었다. DA 뉴런은 대조군에 비해 증가된 복합체 1 및 TFAM을 나타냈지만, 복합체 2 수준에서는 변화가 없었다.POLG 성상교세포는 복합체 14 및 특이적 TFAM의 감소를 나타내었다. 세포 밀도가 또한 MMP 및 MTG와 MMP 형광 사이의 관계에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 이것은 세포 특이적이다. 이 프로토콜을 다른 세포 유형에 적용하려면 최적화가 필요할 수 있습니다. 이 절차에 따라 미토콘드리아 구조에 대한 추가 세부 정보를 제공하는 공초점 현미경과 같은 현미경 기반 asis를 수행할 수 있습니다.따라서이 전략은 알려진 미토콘드리아 질환에서 DA 뉴런과 성상 세포에서 미토콘드리아 기능 장애를 감지하지만 이러한 기술은 모든 유형의 세포 및 질병에서 미토콘드리아 기능을 탐색하는 데에도 적용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 동영상은 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체, 미토콘드리아 DNA 관련 단백질 및 미토콘드리아 외막 단백질에 대한 항체로 신경 세포를 라벨링한 후 유세포 분석을 통해 그 수준을 정량화하는 방법을 보여줍니다.

유세포분석을 사용한 뉴런의 다중 미토콘드리아 파라미터 측정

이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 약물 및 화학 스크리닝 및 신경 독성을 포함한 독성 시험을위한 새로운 시험 관내 모델 개발을위한 강력한 도구로 간주됩니다. 여기, hiPSCs의 뉴런과 glia 로의 차별화에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

인간 독성 Pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 Glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜

우리는 마우스 두뇌 또는 척수에서 검색된 동시에 다른 세포 모형을 확인하기 위하여 교류 세포측정 방법을 제시합니다. 이 방법은 신경 퇴행성 질환에서 순수 한 세포 집단을 분리하거나 특성화하거나 바이러스 벡터 또는 나노 입자의 생체 내 투여 시 세포 표적화의 정도를 정량화하기 위해 악용 될 수 있습니다.

다른 균질화 방법을 통해 마우스 뇌 / 척수에서 검색 된 여러 세포 유형의 동시 유량 세포 측정 특성 분석

여기서 우리는 생체배양조 조혈줄기세포 및 T세포에서 미토콘드리아 질량 및 막 전위를 측정하는 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다.

유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

손상된 미토콘드리아 수송 및 형태는 각종 신경 퇴행성 질환에 관여합니다. 제시된 프로토콜은 유전 경직 성 하반신 마비에서 미토콘드리아 수송 및 형태를 평가하기 위해 유도 된 다능성 줄기 세포 유래 전뇌 뉴런을 사용합니다. 이 프로토콜은 축축을 따라 미토콘드리아 인신 매매의 특성화와 신경 퇴행성 질환의 연구를 용이하게하는 형태학의 분석을 허용합니다.

유전 경직 성 하반신 마비에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 미토콘드리아 수송 및 형태 분석

우리는 자동화된 화상 진찰 및 분석과 호환되는 인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC) 배양 및 신경 분화의 자동화를 보여줍니다.

통합 된 라이브 셀 모니터링을 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 및 도파민 뉴런의 자동화 된 생산

우리는 인간 유도된 다능성 줄기 세포 유래 두뇌 organoids의 생성을 위한 상세한 프로토콜및 미토콘드리아 질병을 모델링에 그들의 사용을 기술합니다.

미토콘드리아 질환 모델링을 위한 인간 뇌 오르가노이드 생성

현재 비디오는 개발 zebrafish의 forebrain에서 개별 신경 전구 세포에 대한 라이브 영상을 수행할 수 electroporation과 공촛점 현미경의 조합을 활용하는 방법을 보여줍니다.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

학습하세요 인간 유도 만능 줄기 세포와 신경 및 신경교 유도체에서 유세포 분석을 이용한 미토콘드리아 기능 평가 방법을. 이 기법은 신경퇴행성 질환의 미토콘드리아 기능 장애 연구와 치료제 선별에 활용됩니다.

인간 유도 만능 줄기 세포와 그 신경 및 신경교 유도체에서 여러 미토콘드리아 파라미터의 유세포 분석

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