Name: 일차 환자 특이적 대동맥 평활근 세포 및 체외에서 반정량적 실시간 수축 측정의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 배우세요 대동맥 평활근 세포 및 진피 섬유아세포를 분리하여 실시간 수축을 측정하는 방법을. 환자 특이적 세포 행동을 분석하고 혈관 질환의 새로운 바이오마커를 발견할 수 있습니다.

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우리는 Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, PAREL-AAA 팀 및 암스테르담 UMC, Zaans Medisch Centrum 및 Dijklander 병원의 모든 혈관 외과 의사가이 연구에 대한 자료와 지원을 제공 한 것에 대해 감사하게 생각합니다.

참고 : 대동맥 생검은 암스테르담 대학 의료 센터, VU 대학 의료 센터, 암스테르담, Zaans Medisch Centrum, Zaandam 및 Dijklander 병원, Hoorn, 네덜란드에서 열린 동맥류 수리 중에 얻어졌습니다. 대조군 대동맥 조직은 신장 이식을 위해 수확된 신장 동맥에 부착된 대동맥의 조각으로부터 수득되었다. 18 세 이상의 환자 만 포함되었으며 모든 환자는 연구에 참여하기 위해 정보에 입각 한 동의를했습니다. 모든 자료는 헬싱키 WMA 선언의 규정과 VU 의료 센터의 의료 윤리위원회의 제도적 지침에 따라 수집되었습니다. 모든 실험 및 실험 프로토콜은 제도적 지침에 따라 수행되었으며 VU 의료 센터의 의료 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 사용된 대조군 및 환자 세포주에 대한 완전한 정보는 8을 참조한다.
1. 대동맥 생검에서 일차 인간 SMC를 분리하는 것
참고: 멸균 조직 배양 층류 후드 아래에서 다음 단계를 수행하십시오. 인간의 혈액과 인간 조직 샘플을 취급 할 때 장갑을 착용하고 표준 무균 기술을 사용하십시오. SMC는 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 SMC 배지로 불리는 평활근 성장 보충제가 보충된 231 인간 혈관 평활근 세포 기초 배지에서 배양됩니다.
<ol><li>두 쌍의 외과 용 포셉과 메스를 70 % 에탄올에 담근 다음 닦아서 멸균하십시오.</li>
	<li>조직 해부가 수행될 페트리 접시에 SMC 배지 2 mL를 피펫한다.</li>
	<li>SMC 배지 2.5 mL를 두 개의 T25 플라스크에 피펫한다. 작은 양의 매체가 전체 표면을 덮을 수 있도록 플라스크를 소용돌이 치십시오.</li>
	<li>수확 된 인간 대동맥벽 생검을 수술실에서 얼음 위의 실험실로 차가운 멸균 조직 전달 용액 ( 재료 표 참조) 또는 0.9 % NaCl로 멸균 플라스틱 튜브로 운반하십시오.</li>
	<li>조직 배양 후드 내부의 조직이있는 튜브를 엽니 다. 멸균된 포셉을 사용하여 튜브 밖으로 생검을 꺼내 페트리 접시에 넣습니다(그림 1A).</li>
	<li>생검을 육안으로 검사하여 세 개의 대동맥 층, tunica intima (내부), 미디어 (중간) 및 출현 (외부 층)을 확인합니다. 층을 구별하기 위해 내막 쪽에는 죽상 경화성 플라크가 있고 모험 쪽에는 칙칙한 결합 조직이 있는지 확인합니다 (그림 1B).</li>
	<li>미디어에서 SMC를 분리하려면 다른 두 레이어를 제거합니다. 내막 플라크 쪽이 있는 조직을 먼저 위로 놓습니다(그림 1B). 고체 플라크를 포셉으로 조직에서 떼어내어 제거하고 다른 한 쌍의 포셉으로 조직을 밀어 내립니다. 분홍색의 균일 한 내측 층이 보일 때까지 플라크의 후속 층을 제거하십시오.</li>
	<li>조직을 대칭 이동합니다(그림 1C). 모험 레이어를 당겨 1.7단계와 동일한 절차를 반복합니다(그림 1D). 이 레이어가 미디어에서 쉽게 분리되지 않으므로 필요한 만큼 많은 시도에서 보이는 모든 부분을 제거해야 합니다. 참고 : 가능한 한 깨끗한 SMC 인구를 얻기 위해 내막 및 모험 층을 적절하게 제거하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>내측 층이 분리되면 조직을 약 1mm x 1mm x 1mm의 큐브로 자릅니다. 포셉으로 미디어를 아래로 누르고 메스를 사용하여 조직을 한 방향으로 자릅니다. 앞뒤로 자르지 마십시오. 손상을 최소화하기 위해 깨끗하고 단방향 절단을하십시오. 생검의 크기를 감안할 때 가능한 한 많은 큐브를 만들어보십시오(그림 1E).</li>
	<li>조직 조각을 포셉을 사용하여 T25 플라스크의 상부 분기에 놓습니다. 재료의 양이 허용하는 경우 플라스크 당 10-20 큐브를 놓습니다 (그림 1F). 참고 : 부드러운 포셉을 사용하여 포셉의 갈비뼈에 대한 조직의 접착을 최소화하고 조직을 플라스크에 쉽게 분리하십시오.</li>
	<li>조직 큐브를 인큐베이터에서 37°C의 5% CO2에서 대략 10일 동안T25 플라스크에서 인큐베이션한다. 참고 : 첫 번째 세포 유출은 그 무렵에 예상됩니다. 처음에 마이그레이션하는 셀은 일반 SMC보다 작게 보일 수 있습니다.</li>
	<li>세포 성장이 관찰되면 플라스크에 배지 2.5mL를 넣고 조직 조각에 피펫을 넣어 분리되지 않도록하십시오.</li>
	<li>대략 5일 후에 조직 조각 주위에 세포의 군집이 관찰되면 배양 배지를 변경한다. 조직 조각이 분리되면 다시 부착되지 않으므로 제거하십시오.</li>
	<li>세포가 80-90 % 합류하면 T75 플라스크로 옮기고이 형식으로 배양을 계속하십시오. 참고: 1:2 또는 1:3 분할 비율을 사용하는 것이 좋습니다. 초기 통과시 세포의 백업을 동결하십시오. 세포는 일반적으로 10 계대까지 그들의 특성을 유지한다; 나중에 구절은 실험에 사용되어서는 안됩니다.</li>
</ol>2. 피부 생검에서 원발성 진피 섬유아세포를 분리하는 것
참고: 멸균 조직 배양 층류 후드 아래에서 다음 단계를 수행하십시오. 인간의 혈액과 인간 조직 샘플을 취급 할 때 장갑을 착용하고 표준 무균 기술을 사용하십시오. 섬유아세포는 섬유아세포 배지로 지칭되는 10% 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 Basal 배지에서 배양 됩니다.
<ol><li>두 쌍의 외과 용 포셉과 메스를 70 % 에탄올에 담근 다음 닦아서 멸균하십시오.</li>
	<li>조직 해부가 수행될 페트리 접시에 섬유아세포 배지 2 mL를 피펫한다.</li>
	<li>섬유아세포 배지 2.5 mL를 피펫 두 개의 T25 플라스크에 넣었다. 작은 양의 매체가 전체 표면을 덮을 수 있도록 플라스크를 소용돌이 치십시오.</li>
	<li>수확 된 피부 생검을 수술실에서 차가운 멸균 조직 전달 용액 ( 재료 표 참조) 또는 멸균 플라스틱 튜브의 0.9 % NaCl의 얼음 위에서 실험실로 운반하십시오.</li>
	<li>조직 배양 후드 내부의 조직이있는 튜브를 엽니 다. 멸균된 포셉을 사용하여 튜브 밖으로 생검을 꺼내 페트리 접시에 넣습니다(그림 2A).</li>
	<li>생검을 육안으로 검사하여 세 가지 피부 층, 표피, 진피 및 피하 지방을 확인합니다. 표피를 식별하기 위해 때로는 머리카락이있는 인식 가능한 피부 표면을 찾으십시오. 반대편에서 종종 노랗고 칙칙한 피하 지방을 찾으십시오. 표피와 피하 지방 사이의 층을 진피-생존 가능한 섬유아세포의 공급원으로서 확인한다(도 2B).</li>
	<li>진피에서 섬유아세포를 분리하려면 다른 두 층을 제거하고 세 층 모두가 보이도록 조직을 옆으로 놓습니다. 참고 : 대동맥 조직과 달리 피부 층은 서로 분리 될 수 없습니다. 따라서 그들은 잘려야합니다. 조직은 또한 고무질이있어 절단하기가 더 어렵습니다. 날카로운 메스를 사용하십시오.</li>
	<li>포셉으로 조직을 잡으십시오. 표피와 진피 사이의 경계에 평행하게 자릅니다. 표피 전체를 잘라냅니다. 하나의 깨끗한 라인으로 자르고 조직 손상을 피하기 위해 앞뒤로 움직이지 마십시오.</li>
	<li>조직을 뒤집습니다. 2.8단계와 동일한 절차를 반복합니다. 이번에는 피하 지방과의 경계에 평행한 진피 내에서 절단하십시오.</li>
	<li>진피가 분리되면 조직을 약 1 x 1 x 1 mm3의 큐브로 자릅니다. 포셉으로 조직을 누르고 메스를 사용하여 조직을 한 방향으로 자릅니다. 앞뒤로 자르지 마십시오. 손상을 최소화하기 위해 깨끗하고 단방향 절단을하십시오. 생검의 크기를 감안할 때 가능한 한 많은 큐브를 만들어보십시오 (그림 2C).</li>
	<li>조직 조각을 포셉을 사용하여 T25 플라스크의 상부 분기에 놓습니다. 재료의 양이 허용하는 경우 플라스크 당 10-20 큐브를 놓습니다 (그림 2D). 참고 : 부드러운 포셉을 사용하여 포셉의 갈비뼈에 대한 조직의 접착을 최소화하고 조직을 플라스크에 쉽게 분리하십시오.</li>
	<li>조직 큐브를 인큐베이터에서 37°C의 5% CO2에서 대략 10일 동안T25 플라스크에서 인큐베이션한다. 참고 : 첫 번째 세포 유출은 그 무렵에 예상됩니다. 처음에 이동하는 세포는 정상적인 섬유 아세포보다 작게 보일 수 있습니다.</li>
	<li>세포 성장이 관찰되면 플라스크에 배지 2.5mL를 넣고 조직 조각에 피펫을 넣어 분리되지 않도록하십시오.</li>
	<li>대략 5일 후에 조직 조각 주위에 세포의 군집이 관찰될 수 있을 때, 배양 배지를 변경한다. 조직 조각이 분리되면 다시 부착되지 않으므로 제거하십시오.</li>
	<li>세포가 80-90 % 합류하면 T75 플라스크로 옮기고이 형식으로 배양을 계속하십시오. 참고: 1:2 또는 1:3 분할 비율을 사용하는 것이 좋습니다. 초기 통과시 세포의 백업을 동결하십시오. 세포는 일반적으로 10 계대까지 그들의 특성을 유지한다; 나중에 구절은 실험에 사용되어서는 안됩니다.</li>
</ol>3. 수축 측정(예: SMC)
<ol><li>96w10e ECIS 어레이를 준비한다(확대된 전극 및 전극 상에 시딩된 셀이 있는 어레이의 대표적인 이미지는 도 3A 참조). 참고: 멸균 조직 배양 층류 후드 아래에서 다음 단계를 수행하십시오.<ol>
<li>멸균된 96w10e 어레이를 웰 당 200 μL의 10 mM L-시스테인으로 실온에서 30분 동안 코팅한다.</li>
		<li>멸균수로 접시를 두 번 씻으십시오. 뚜껑을 약간 열어 조직 배양 후드에서 플레이트를 밤새 말리십시오. 참고: 플레이트를 L-시스테인으로 코팅하는 것은 플레이트를 처음 사용할 때만 필요합니다.</li>
		<li>다음날, 30 분 동안 플레이트와 뚜껑을 UV로 살균하십시오. 뚜껑을 위쪽으로 돌려 내부가 살균되도록 합니다. 플레이트가 멸균되면 플로우 후드 외부에서 플레이트를 열지 마십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>ECIS 어레이의 셀 시드<ol>
<li>1 % 멸균 젤라틴 용액을 수조에서 30 분 동안 미리 따뜻하게하십시오. 참고 : 용액은 냉장고에 보관되어 응고 될 수 있으므로 피펫이 어려워집니다.</li>
		<li>이어서, 웰을 웰 당 1% 젤라틴 용액 100 μL로 코팅하고, 플레이트를 적어도 1시간 동안 37°C에서 인큐베이션한다.</li>
		<li>우물에서 젤라틴을 흡인하십시오.</li>
		<li>자동화 된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 SMC 배지의 200 μL에 30,000 세포 / 웰의 시딩 밀도로 삼중으로 SMC를 시드하십시오.</li>
		<li>SMCs가 있는 플레이트를 ECIS 96-웰 홀더에 넣고 세포 배양 인큐베이터에 넣는다. ECIS 응용 생물물리학 소프트웨어를 두 번 클릭하여 프로그램을 열고 설정 단추를 누릅니다.</li>
		<li>모든 전극이 오른쪽 구성이라고 표시된 왼쪽 하단 패널의 홀더(녹색, 연결되지 않은 경우 빨간색)와 접촉하는지 확인합니다. 전극이 제대로 연결되지 않은 경우 측정을 시작하기 전에 홀더의 플레이트를 조정하십시오.</li>
		<li>배열 유형을 클릭하여 동일한 패널에서 플레이트 유형(96웰 배열)을 선택합니다.</li>
		<li>오른쪽 상단 패널 데이터 수집 설정에서 단일 주파수 를 클릭하고 임피던스 값을 4000Hz 로, 간격을 8초로 변경합니다.</li>
		<li>시작 단추를 클릭하여 측정을 시작합니다. ECIS 파일을 저장할 수 있는 새 패널이 열릴 때까지 기다립니다.</li>
		<li>세포가 부착되도록 허용하고 48 시간 동안 단층을 확립하십시오. 참고: 전극에 셀을 부착하고 확산하면 기준 저항 값이 생성됩니다(그림 3B).</li>
	</ol></li>
	<li>수축을 유도하는 세포의 자극<ol>
<li>10 μg/mL의 칼슘 이오노포어, 이오노마이신으로 세포를 자극하여 SMC 수축을 유도한다. 참고: 이오노마이신은 세포외Ca2+의 유입을 유도하여 수축성 캐스케이드를 활성화시킵니다. 자극되지 않고 자극된 수축된 세포의 대표적인 이미지에 대해서는 도 4A 를 참조한다.</li>
		<li>이오노마이신 분말 1mg을 디메틸설폭사이드 100μL에 희석하여 10mg/mL의 원액을 만들고 -20°C에서 10μL 분취량을 저장한다. 사용 전에, 이오노마이신 용액을 SMC 배지에 1:10으로 희석하여 세포에 첨가될 작업 용액을 제조하였다.</li>
		<li>어레이가 세포 배양 인큐베이터 내부의 어레이 홀더에 여전히 있고 전극이 시스템에 부착되어 있는 동안 세포 자극을 수행하십시오.<ol>
<li>세포를 자극하려면 뚜껑을 제거하고 인큐베이터 내부의 멸균 표면에 놓습니다. 2 μL 및 150 μL로 설정된 두 개의 피펫을 준비하십시오.</li>
			<li>자극을 시작하기 전에 소프트웨어에서 Mark 를 누르고 주석을 달으십시오. 참고: 이렇게 하면 데이터를 분석할 때 자극의 정확한 타이밍을 쉽게 찾을 수 있습니다.</li>
			<li>2 μL의 이오노마이신 작업 용액을 가능한 한 빨리 각 웰에 피펫한다. 일단 모든 세포가 자극되면, 두 번째 피펫을 사용하여 웰에 배지를 혼합한다. 참고 : 빠른 효과로 인해 다른 세포주와 조건 사이의 팁을 변경할 필요가 없습니다. 이오노마이신이 급성 효과를 갖기 때문에 자극하고 혼합하면서 빠르게 작업하십시오. 전체 플레이트를 자극 할 때 한 번에 최대 3 개의 열을 자극하십시오. 모든 자극 후에, 다음 자극이 세포가 인큐베이터 도어의 개방에 의해 야기된 온도 및CO2 변화로부터 회복되게 할 때까지 적어도 30분 동안 기다린다.</li>
			<li>자극이 완료된 직후, Mark 를 다시 눌러 자극이 완료되었다는 주석을 추가합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>자극 실험 완료<ol>
<li>이오노마이신 자극 후 약 5분 동안 임피던스 값을 기록한다. 마침을 눌러 녹음을 마칩니다.</li>
			<li>ECIS 어레이를 최대 3회 재사용: 웰을 멸균수로 두 번 세척하고, 플레이트를 트립신 또는 유사한 시약으로 2-3시간 동안 37°C에서 인큐베이션한다. 3.1.2단계와 3.1.3단계를 반복합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>데이터 내보내기<ol>
<li>데이터를 내보내려면 파일 | | 데이터 내보내기 엑셀로(선택됨). 파일을 저장할 폴더를 선택합니다.</li>
		<li>프로그램에서 시트를 결합하거나 분리 하도록 요청하면 분리를 클릭합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>수축 출력 분석<ol>
<li>수축 반응을 계산하기 위해, 다음 수학식 1을 사용하여, 여기서 C는 수축(기준선과 비교하여 변화의 %로 나타냄)을 나타내고, 프리자극(PrS)은 이오노마이신 자극 직전의 저항값(Ω으로 표현됨)을 나타내고, 자극 후 2분 후에 저항(Ω으로 표시됨)을 나타낸다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63122/63122eq01.jpg"> (1) 참고: 수학식 1과 같이, 부착된 세포가 없는 배지로 채워진 웰의 임피던스 값(290 Ω의 값)은 최종 계산의 모든 결과에서 뺍니다. 각 실험에서 삼중으로 수축 반응을 측정하고 실험 간 및 실험 내 변이를 설명하기 위해 동일한 세포주로 세 가지 독립적 인 실험을 수행하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>세 가지 독립적인 실험이 수행되면, 표준 편차(SD)를 포함하는 세 가지 측정치의 평균을 계산하여 데이터를 함께 그룹화합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>서로 다른 그룹 비교<ol>
<li>정상 수축의 범위를 정의하고 후속 특정 연구 질문을 조사하려면 대조군을 사용하여 "정상 수축"을 정의하고 환자 또는 치료 그룹의 수축 반응과 비교하십시오.</li>
		<li>단계 3.5.2에 기재된 바와 같이, 전체 대조군, 즉 모든 세포주에 대한 최종 값의 평균 및 SD를 계산한다.</li>
		<li>평균 ± 2SD의 범위를 사용하여 이 범위를 벗어나는 다른 그룹의 세포를 식별하여 변경된 수축 반응이 있음을 나타냅니다. 참고 : 변경된 수축 반응의 메커니즘은 특정 연구 질문의 대상이되며 세포 및 상태에 따라 다르며이 프로토콜에서는 논의되지 않습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. SMC 특정 마커의 존재 감지
<ol><li>RNA 분리<ol>
<li>수축 측정에 사용된 동일한 환자 특이적 세포주를 6-웰 플레이트에 시딩하고, 세포주 당 하나의 웰에 시딩한다. 자동화 된 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산하고 SMC 배지에서 200,000 세포 / 웰의 시딩 밀도로 세포를 시드하고 밤새 부착 할 수 있도록하십시오.</li>
		<li>세포를 멸균 PBS로 한 번 세척한다.</li>
		<li>세포를 용해시키고 제조업체의 지시에 따라 세포를 분리하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>cDNA 합성<ol>
<li>역전사 반응 혼합물의 20 μL에서 cDNA 합성을 수행한다. 제조업체가 제공 한 지침에 따라 분리 된 총 RNA의 농도를 희석하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>qPCR<ol>
<li>SMC 마커 유전자, 예를 들어, ACTA2, CNN1, SMTN 및 TAGLN 의 유전자 발현을 측정하여 단리된 세포가 실제로 SMCs임을 확인하고 SMC 마커를 검출한다. 결과와 수축 출력의 상관 관계를 확인하십시오.</li>
		<li>데이터를 정상화하기 위해 적어도 두 개의 하우스 키핑 유전자를 사용하십시오 (예 : YWHAZ 및 TBP). 참고: qPCR 실행 및 분석은 실험실에서 사용 가능하고 최적화된 제품에 따라 다른 PCR 기계 및 호환 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다. 프라이머 서열에 대해서는 보충표 S1 을 참조한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

이 논문은 임피던스 및 표면 점유의 변화를 기반으로 시험관 내에서 SMC 수축을 측정하는 방법을 제시합니다. 먼저, 환자 특이적 일차 인간 SMC 및 피부 섬유아세포의 단리, 배양 및 확장이 설명되고, 이어서 수축 측정에 이를 사용하는 방법이 설명된다. 
연구의 한계는 explant 프로토콜을 통해 세포를 얻는 것과 관련이 있습니다. 생검에서 증식하는 세포는 생체 내에서 원래 조직과 다른 특성을 가질 수 있습니다. 또한, 여기에 제시된 explant 프로토콜은 혁신적이지는 않지만,이 경우 환자 별 대동맥류 물질에서 수축 측정에 이르기까지 완전한 워크 플로우를 제시하기 위해 포함됩니다. 시험관 내에서 세포를 배양하는 것은 또한 전신 인자의 부족 및 상이한 기질 강성으로 인해 그들의 특성의 일부에 영향을 미칠 수 있다. 이는 SMC 마커 표현식의 변동성을 설명할 수 있습니다. 신뢰할 수있는 섬유 아세포 마커의 부재로 인해, 섬유 아세포...

평활근 세포 (SMCs)는 대동맥의 가장 두꺼운 층인 대동맥 내측 층에서 우세한 세포 유형이다. 벽 내에서, 그들은 방사상 지향적이며 다른 기능들 중에서도 혈관 수축 및 혈관 확장에 관여합니다1. SMC 수축 기계는 세포외 매트릭스(2)와의 기능적 링크를 통해 대동맥에서의 힘의 전달에 관여한다. 평활근 미오신 중쇄 (MYH11) 및 평활근 액틴 (ACTA2)과 같은 SMC 수축 장치의 단백질을 암호화하는 유전자의 돌연변이는 가족 흉부 대동맥류의 경우와 관련이 있으며, 대동맥의 구조적 및 기능적 완전성을 유지하는 데 SMC 수축의 관련성을 강조합니다 1,2 . 또한, TGFβ 신호전달 경로의 돌연변이는 대동맥류와도 관련이 있으며, 대동맥류에서의 병태생리학에서의 그 효과는 피부 섬유아세포3에서도 연구될 수 있다.
시험관 내에서 SMC 수축의 높은 처리량 측정은 도전적입니다. SMC 수축성은 인간에서 생체 내에서 측정 될 수 없기 때문에 인간 세포에 대한 시험관 내 분석은 실현 가능한 대안을 제시합니다. 더욱이, 동물 모델에서의 복부 대동맥류(AAA) 발달은 예를 들어, 엘라스타제 관류에 의해 화학적으로 유도되거나, 또는 특정 돌연변이에 의해 유발된다. 따라서 동물 데이터는 흡연, 연령 및 / 또는 죽상 동맥 경화증과 같은 다각적 인 원인을 가진 인간의 AAA 발달과 비교할 수 없습니다. 시험관내 SMC 수축성은 지금까지 주로 견인력 현미경4,5, Fura-2 형광 세포내 칼슘 플럭스6의 정량화 및 콜라겐 주름 분석7에 의해 측정되었다. 견인력 현미경 검사는 단일 세포에 의해 생성 된 힘에 대한 귀중한 숫자 통찰력을 제공하지만 복잡한 수학적 데이터 처리 및 한 번에 하나의 세포 분석으로 인해 높은 처리량 스크리닝에는 적합하지 않으므로 기증자 당 대표적인 세포 수를 측정하는 데 매우 많은 시간이 소요됩니다. Fura-2 염료 및 콜라겐 주름 분석은 수축의 피상적 인 결정을 허용하고 정확한 수치 출력을 제공하지 않으므로 환자 별 차이를 구별하는 데 적합하지 않습니다. 복부 대동맥류 환자의 대동맥류로부터 유래된 세포에서 손상된 SMC 수축은 시험관내8에서 SMC 수축을 측정하기 위한 새로운 방법을 최적화함으로써 처음으로 입증되었다. 이는 전기 셀-기판 임피던스 감지(ECIS) 방법을 용도 변경함으로써 수행되었다. ECIS는 상처 치유 및 이동 분석(12,13,14)에서 SMC 성장 및 거동과 같은 부착성 세포 거동 및 수축 9,10,11의 정량화를 위한 실시간 중간 처리량 분석법이다. 정확한 방법은 프로토콜 섹션에 설명되어 있습니다. 이러한 최적화된 방식으로, ECIS는 또한 유사한 크기 및 형태학으로 인해 섬유아세포 수축을 연구하는데 사용될 수 있다.
이 논문의 목적은 ECIS8을 사용하여 시험관 내에서 SMC 수축을 측정하고 대조군과 환자 SMC 간의 수축을 비교하는 방법에 대한 단계적 설명을 제공하는 것입니다. 첫째, 대조군 및 환자 대동맥 생검으로부터 일차 SMCs의 분리 및 배양이 설명되며, 이는 수축 측정에 사용될 수 있다. 둘째, 수축 측정 및 분석, SMC 마커 발현의 검증이 설명된다. 또한,이 논문은 동일한 방법론을 사용하여 수축을 측정 할 수있는 환자 특정 진피 섬유 아세포의 분리 방법을 설명합니다. 이들 세포는 대동맥류 또는 다른 심혈관 병리(15)에 초점을 맞춘 환자 특이적 연구 또는 동맥류 수술 전에 수축 측정을 허용하는 전분화 프로토콜을 이용한 예후 연구(16)에 사용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>96-well Array</td><td>Applied Biophysics</td><td>96W10idf</td><td>ECIS 설정에서 수축을 측정하는 데 사용되는 PET Array</td></tr><tr><td>Custodiol</td><td>Dr. Franz H&ouml; hler Chemie GmbH</td><td>RVG 12801</td><td>수술실에서 실험실로 조직을 옮기는 데 사용되는 용액</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>ionomycin</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>26140079</td>를 희석하는 데 사용되는 용액 <td>세포 배양 배지에 추가</td></tr><tr><td>Ham's F-10 Nutrient Mix</td><td>Gibco</td><td>11550043</td><td>피부 섬유아세포를</td></tr> <tr><td>배양하는 데 사용되는 배지Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'')</td><td>Gibco</td><td>M231500</td><td>Medium Use to culture 평활근 세포</td></tr><tr><td>Invitrogen countess II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>Automated cell counter</td></tr><tr><td>Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634-1MG</td> Compound used for congation Shrinkion <td>stimulation</td></tr><tr><td>NaCl 0.9% </td><td>Fresenius Kabi</td><td>B230561</td><td>수술실에서 실험실로 조직을 옮기는 데 사용되는 용액</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>세포 배양 배지에 사용되는 항생제</td></tr><tr><td>Phospathe 완충 식염수</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>세포 세척에 사용</td></tr><tr><td>Quick-RNA Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1055</td><td>Kit RNA 분리</td></tr><tr><td>에 사용되는 키트평활근 성장 보조제(SMGS)</td><td>Gibco</td><td>S00725</td><td>평활근 세포 배양 배지에 첨가되는 보충제</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA 합성 키트</td><td>cDNA 합성에 사용되는</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11754250</td> 키트</tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309155</td><td>qPCR 용 시약</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>트립신화에 사용 세포</td></tr><tr><td>ZTheta</td><td>Applied Biophysics</td> 수축 측정에 사용되는 <td>ZTheta</td><td>ECIS 기기</td></tr></tbody></table>

일차 환자 특이적 대동맥 평활근 세포 및 체외에서 반정량적 실시간 수축 측정의 분리

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

평활근 세포 (SMCs)는 대동맥 매질에서 우세한 세포 유형이다. 그들의 수축 기계는 대동맥에서 힘의 전달에 중요하며 혈관 수축과 혈관 확장을 조절합니다. SMC 수축 장치 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이는 대동맥류, 예컨대 흉부 대동맥류와 관련이 있다. 시험관 내에서 SMC 수축을 측정하는 것은 특히 환자 물질 스크리닝에 필수적인 높은 처리량 방식으로 도전적입니다. 현재 사용 가능한 방법은 이러한 목적에 적합하지 않습니다. 이 논문은 전기 셀 기판 임피던스 감지 (ECIS)에 기반한 새로운 방법을 제시합니다. 먼저, 대동맥류의 연구를 위해 대동맥류 연구를 위해 환자 특이적 인간 원발성 SMCs를 대동맥류 생검 및 환자 특이적 인간 원발성 진피 섬유아세포로부터 분리하기 위한 explant 프로토콜이 기술된다. 다음으로, 이들 세포의 수축 반응을 측정하기 위한 새로운 수축 방법에 대한 상세한 설명이 주어지며, 상이한 집단을 비교하기 위한 후속 분석 및 제안을 포함한다. 이 방법은 번역 (심혈관) 연구 및 환자 및 약물 스크리닝 연구의 맥락에서 부착성 세포의 수축을 연구하는데 사용될 수 있다.

이 방법의 재현성을 테스트하기 위해 이 방법은 먼저 제어 SMC만 사용하여 검증되었습니다. 실험간 측정 재현성을 결정하기 위해, 포함된 모든 대조군 및 환자 세포주에 대한 두 개의 독립적인 측정값을 Bland-Altman 플롯으로 플롯팅하였다(도 3B). 플롯은 이 방법이 하나의 이상치 세포주를 제외하고는 신뢰 구간 밖의 가변성을 나타내지 않는다는 것을 입증하였다. 또한, 이러한 결과는 동일한 실험 내에서 시딩되고 동시에 자극된 두 웰이 실질적으로 동일한 수축 반응 곡선을 나타낸다는 것을 입증하였다(도 4C). 표시된 반응이 이오노마이신 자극으로 인한 삼투압 스트레스가 아닌 수축인지 여부를 검증하기 위해, 자극 후 배지를 교체하고, 세포의 거동을 기록하였다. 이것은 자극된 세포가 다시 전극 위로 퍼지기 시작했음을 보여준다(도 4D).
<p class="jove_c...

이 논문은 원발성, 환자 특이적 인간 대동맥 평활근 세포 및 진피 섬유아세포의 분리 및 배양을 위한 explant 배양 기반 방법을 기술한다. 또한, 세포 수축 및 후속 분석을 측정하기위한 새로운 방법이 제시되며, 이는 이들 세포의 환자 별 차이를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...

이 방법을 통해 연구원은 여러 환자 세포주의 세포 수축을 동시에 연구 할 수 있습니다. 그것은 우리가 질병을 더 빠르고 효율적으로 연구 할 수있게 해줍니다. 이 기술을 통해 실시간으로 세포 수축을 정량화 할 수 있습니다.한 시간 안에 수십 개의 세포의 수축 값을 얻을 수 있습니다. 우리는 대동맥류 환자 그룹에서 근육 세포 수축이 감소한다는 것을 처음으로 시연했습니다. 이는 의학적 치료를 위한 새로운 바이오마커 또는 표적일 수 있다.두 쌍의 외과 용 포셉과 메스를 70 % 에탄올에 담그고 건조시켜 멸균하십시오. 그런 다음 조직 해부가 수행 될 페트리 접시에 SMC 배지 두 밀리리터를 피펫하십시오. 다음 피펫 2.5 밀리리터의 SMC 배지를 두 개의 T-25 플라스크에 넣습니다.작은 양의 매체가 전체 표면을 덮을 수 있도록 플라스크를 소용돌이 치십시오. 육안으로 생검을 검사하고, 내막 측에 죽상 경화성 플라크가 존재하고 모험적인 쪽에 칙칙한 결합 조직이 존재하여 세 개의 대동맥 층을 식별하여 층을 구별합니다. SMC를 배지에서 분리하려면 먼저 내막 플라크가있는 조직을 위쪽으로 올려 다른 두 층을 제거한 다음 분홍색의 균일 한 내측 층이 보일 때까지 두 번째 포셉으로 조직을 아래로 밀면서 포셉으로 조직에서 당겨서 고체 플라크를 제거하십시오.이제 조직을 뒤집고 모험 층을 당겨서 동일한 절차를 반복하고,이 레이어가 미디어에서 쉽게 분리되지 않도록하기 위해 필요한만큼 많은 시도에서 보이는 모든 부분을 제거해야합니다. 미디어 층이 분리되면 포셉으로 미디어를 아래로 누르고 메스를 사용하여 조직을 한 방향으로 절단하여 손상을 최소화하기 위해 깨끗한 단방향 절단을 만들어 조직을 큐브로 자릅니다. 포셉을 사용하여 T-25 플랙의 상부 분기에 10-20개의 이들 조직 조각을 배치한다.앞서 기술한 바와 같이 두 쌍의 외과 포셉과 메스를 멸균한 후, 조직 해부가 수행될 페트리 접시에 두 밀리리터의 섬유아세포 배지를 피펫팅한다. 그런 다음 2.5 밀리리터의 섬유 아세포 배지를 두 개의 T-25 플라스크에 피펫하고 플라스크를 소용돌이 치며 작은 양의 배지가 전체 표면을 덮습니다. 눈에 보이는 머리카락이있는 표피를 인식 할 수있는 피부 표면으로 표피를 확인하기 위해 생검을 육안으로 검사 한 다음 반대쪽에서 노란색과 칙칙한 피하 지방을 찾으십시오.표피와 피하 지방 사이의 층은 생존 가능한 섬유 아세포의 원천 인 진피입니다. 진피에서 섬유아세포를 분리하려면 진피 쪽에 조직을 배치하여 다른 두 층을 제거하여 세 층 모두를 볼 수 있도록 합니다. 그런 다음 포셉으로 조직을 잡고 조직을 손상시키지 않고 하나의 깨끗한 선으로 전체 표피를 잘라냅니다.이제 조직을 뒤집고 피하 지방과의 경계와 평행한 진피 내에서 절단하여 동일한 절차를 반복하십시오. 진피가 분리되면 조직을 큐브로 자르고 포셉으로 조직을 누르고 메스를 사용하여 조직을 한 방향으로 자릅니다. 그런 다음 포셉을 사용하여 T-25 플라스크의 상부 분기에 10 내지 20개의 이들 조직 조각을 배치한다.자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고, 젤라틴 코팅된 ECIS 플레이트 내의 200 마이크로리터의 SMC 배지에서 웰 당 30, 000 세포의 시딩 밀도로 삼중으로 SMCs를 시드한다. SMCs가 있는 플레이트를 ECIS의 96-웰 홀더에 넣고 세포 배양 인큐베이터에 넣는다. ECIS Applied BioPhysics 소프트웨어를 두 번 클릭하여 프로그램을 열고 설정 버튼을 누릅니다.모든 전극이 오른쪽 구성이라고 표시된 왼쪽 하단 패널의 홀더와 접촉했는지 확인합니다. 전극이 제대로 연결되지 않은 경우 측정을 시작하기 전에 홀더의 플레이트를 조정하십시오. 이제 배열 유형을 클릭하여 동일한 패널에서 플레이트 유형을 선택하십시오.다음으로, 두 마이크로 리터 및 150 마이크로 리터 부피로 설정된 두 개의 피펫을 준비하십시오. 자극을 시작하기 전에 소프트웨어에서 Mark를 누르고 주석을 달으십시오. 세포를 자극하려면 뚜껑을 제거하고 인큐베이터 내부의 멸균 표면에 놓습니다.그런 다음 이오노마이신 작업 용액의 두 마이크로리터를 가능한 한 빨리 각 웰로 피펫팅하여 SMC 수축을 유도한다. 일단 모든 세포가 자극되면, 두 번째 피펫을 사용하여 웰에 배지를 혼합한다. 실험간 측정 재현성을 결정하기 위해, 포함된 모든 대조군 및 환자 세포주에 대한 두 개의 독립적인 측정값을 Bland-Altman 플롯으로 플롯팅하여, 이 방법이 하나의 이상치 세포주를 제외하고는 신뢰 구간 밖의 가변성을 나타내지 않았음을 입증하였다.동일한 실험으로 시딩되고 동시에 자극 된 두 개의 웰은 실질적으로 동일한 계약 반응 곡선을 보였다. 표시된 반응이 이오노마이신 자극으로 인해 삼투압 스트레스가 아닌 수축인지 여부를 검증하기 위해, 자극 후 배지를 교체하고 세포의 거동을 기록하였으며, 이는 자극된 세포가 다시 전극 위로 퍼지기 시작했음을 보여주었다. 건강하고 확장되지 않은 대동맥류에서 유래된 SMCs의 수축 반응은 복부 대동맥류 환자로부터의 52%의 중간 반응과 비교하여 61%의 중간 반응을 보였다.대조군의 평균 수축 반응은 정상 값보다 수축 값이 낮은 네 명의 환자를 확인하기 위해 사용되었다. 웨스턴 블롯 분석 및 후속 정량화는 세포가 SMC 마커를 발현한다는 것을 확인하였다. SMC의 증식 능력을 결정하기 위해, Ki67에 대해 qPCR을 수행하였다.Ki67 발현은 모든 세포에서 검출가능했지만, 수축성 출력과 상관관계가 없었다. 수축을 위해 세포를 자극 할 때, 동시에 너무 많은 우물을 피펫하지 말고 가능한 한 빨리 피펫을 시도했는지 기억하십시오. 이 절차에는 몇 가지 연습이 필요할 수 있습니다.이 방법을 사용하여 우리는 수축에 따라 환자를 나누고 정상 수축을 낮추어 이러한 환자와 흡연과 같은 임상 적 특성과의 연관성을 조사 할 수있었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 전기 세포-기질 임피던스 감지(ECIS)를 사용하여 대동맥 평활근 세포(SMC) 수축을 측정하는 방법을 설명합니다. ECIS는 세포의 이동을 측정하며 수축을 측정하는 신뢰할 수 있는 방법입니다.

체외 SMC 수축 측정: 전기 세포 기질 임피던스 감지를 사용하여 평활근 세포 수축을 평가하는 비침습적 방법

우리는 따라서 신생아 평활근 세포의 수축과 이완에 관련된 신호 전달 경로의 더 나은 연구를 허용, 소설과 P7 등의 어린 쥐에서 폐 혈관 평활근 세포의 일차 배양 (PASMC)를 분리하는 재생 기술을 개발했습니다.

신생아 쥐의 폐 동맥 평활근 세포의 분리

대동맥의 병리학은 심각한 이환율과 사망률을 유발할 수 있으므로 질병 진행 및 잠재적 치료법에 대한 연구가 필요합니다. 여기에서는 심혈관 질환에 대한 연구자의 연구를 돕기 위해 쥐 대동맥을 분리하고 절제하는 프로토콜을 제시합니다.

분리 및 설치류 대동맥 절제; 심혈관 질환의 연구에 다목적 기술

혈관 내피 세포는 많은 중요한 심혈관 질환에서 중요한 역할을 합니다. 이 기사에서는 특별한 장비를 사용하지 않고 쥐 대동맥에서 내피 세포를 분리하고 확장하는 간단한 방법을 설명합니다. 당사의 프로토콜은 내피 세포 생리병리학에서 메커니즘을 식별하는 효과적인 수단을 제공합니다.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

이 프로토콜의 목적은 관상 동맥에서 뮤린 주 혈관 평활근 세포의 분리 및 배양 방법 (혈관 평활근 세포)을 보여주는 것이다. 혈관 평활근 세포가 분리되고 나면, 이들은 많은 표준 배양 기술에 사용될 수있다.

쥐 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 분리

배아와 perinatal murine 대동맥 여기 vivo에서 클론 분석 및 운명 매핑, 대동맥 explants 및 격리 된 부드러운 근육 세포 상세를 사용 하 여 공부에 대 한 프로토콜. 이러한 다양 한 접근의 정상적인 발전에서 배아 및 perinatal 대동맥 및 질병의 병 인 morphogenesis 조사를 촉진 한다.

Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여

Microvascular 내 피 세포 골격 근육 (MMEC)의 근육 모세 혈관의 안 벽을 형성 하 고 둘 다 조절 근육 조직과 혈액 사이 (면역) 세포의 마이그레이션 및 체액/분자의 교환. 기본 murine MMEC의 격리, 여기에 설명 된 대로 "myovascular 단위"의 종합 체 외 조사 수 있습니다.

기본 Murine 골격 근육 Microvascular 내 피 세포의 고립

이 프로토콜은 피부 심장 근구를 사용하여 심장 기능의 추출 및 평가 기술을 단계별로 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론은 마우스에서 남성에 이르기까지 다른 심장 위치에서 수집 할 수있는 작은 냉동 생검을 사용하여 myofilament 기능의 측정 및 급성 변조를 허용합니다.

피부 심근세포를 이용한 심장 기능의 체외 평가

이 프로토콜은 외과적 대동맥 판막 치환술 중 또는 사체 조직에서 추출한 인간 대동맥 판막의 수집과 환자 특이적 일차 판막 내피 및 간질 세포의 후속 분리, 확장 및 특성화를 설명합니다. 세포 생존율 및 표현형 특이성을 보장하는 데 필요한 프로세스에 대한 중요한 세부 정보가 포함되어 있습니다.

체외 질병 모델링을 위한 인간 일차 판막 세포의 분리

본 프로토콜은 전기생리학적 연구에 적합한 성체, 청소년, 유충 및 배아 제브라피쉬(Danio rerio)로부터 생존가능한 심장 및 혈관 평활근 세포의 급성 단리를 기술한다.

전기 생리 학적 연구를위한 성체, 청소년, 애벌레 및 배아 제브라 피쉬에서 심장 및 혈관 평활근 세포 분리

여기에서는 인간 대동맥 벽에서 평활근 세포의 생체 내 생체 역학적 변형을 복제하기 위해 인간 대동맥 평활근 세포 장기 온 칩 모델을 개발했습니다.

대동맥 벽의 생체 역학적 변형을 요약하기 위한 인간 대동맥 평활근 세포 장기 온 칩 모델 구축

배우세요 대동맥 평활근 세포 및 진피 섬유아세포를 분리하여 실시간 수축을 측정하는 방법을. 환자 특이적 세포 행동을 분석하고 혈관 질환의 새로운 바이오마커를 발견할 수 있습니다.

일차 환자 특이적 대동맥 평활근 세포 및 체외에서 반정량적 실시간 수축 측정의 분리

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