비증식 및 증식 망막증을 가진 마우스의 전체 산 망막에 있는 혈관 매개변수의 정량화

망막병증에서 혈관 변경은 임상의에 의해 검출되는 첫번째 표시입니다. 그(것)들은 질병의 진행을 따르고, 그(것)들은 이 변경에 따라 처리를 선택합니다. 여러 동물 모델은 병리학의 다른 단계를 연구하기 위해 개발되었습니다.

이 작품에서, 우리는 다른 혈관 변경을 측정하는 방법을 보여 줄 것입니다. 이를 위해, 우리는 두 개의 동물 모델을 고용 할 것입니다. 이들 중 하나는 미숙아의 망막병증과 증식 당뇨병 성 망막증의 일부 측면을 재현하는 산소 유도 망막병증 마우스 모델입니다.

여기서 우리는 혈관 지역, 난바혈관 지역, 동맥의 팽창과 불법성을 측정할 것입니다. 우리의 실험실에서는, 비증식 망막증을 유도하는 신진 대사 증후군 마우스 모형이 개발되었습니다. 이 작업에서 혈관 밀도 및 분기를 평가하였다.

마우스 희생시, 가위로 방출한다. 실온에서 1시간 동안 갓 준비된 파라포름알데히드로 에뉴클레오드 눈을 고정합니다. 해부 현미경에서, 림부를 따라 절단하여 가위로 각막을 제거하고 전체 망막을 해부.

눈의 전방 세그먼트를 버리고 망막을 RPE-choroid에서 분리합니다. 망막을 200 마이크로리터 튜브에 놓습니다. 그런 다음 5%의 소 세럼 알부민 트리톤이 함유된 100마이크로리터의 망막을 4도에서 4도에서 쉐이커에서 부드럽게 교반합니다.

그런 다음 튜브를 반전하여 망막을 컵에 넣고 파이펫으로 차단 용액을 제거합니다. 이솔록틴을 함유한 100마이크로리터 용액을 추가합니다. 알루미늄 호일로 튜브를 감싸서 샘플을 빛으로부터 보호합니다.

레티나에 레티나를 4도에서 4도에서 배양하고 셰이커에 부드러운 동요를 가린다. 100 마이크로리터의 TBS-트리톤으로 망막을 20분간 씻어 내며 쉐이커에 부드러운 교반을 합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.

망막을 슬라이드에 넣고 PBS 한 방울을 추가합니다. 해부 현미경에서, 시신경을 향해 망막의 가장자리에서 4 개의 동등하게 먼 상처를 수행. 망막의 꽃잎을 펼치려면 집게 또는 작은 필터 용지를 사용하십시오.

광수용체 측이 아래로 향하고 있는지 확인합니다. 필터 용지로 슬라이드에서 나머지 PBS를 제거합니다. 그런 다음 마운팅 중앙분리대와 커버슬립을 추가합니다.

실온에서 1시간 동안 건조시키세요. 조명으로부터 보호된 4도에 슬라이드를 저장합니다. 공초점 현미경에서 슬라이드를 아래로 향하게 놓습니다.

망막 혈관의 우수한 신경총에 초점을 맞추고 이미지 수집을 시작하는 영역을 선택합니다. 소프트웨어에서 일반 레이저 매개 변수를 설정합니다. 좌표를 X, Y 및 Z 축으로 설정합니다.

스캔을 초기화합니다. 검색 프로세스가 완료되면 이미지를 열고 선호하는 확장으로 저장합니다. ImageJ FIJI 소프트웨어에서 메뉴 표시줄로 이동하여 파일을 클릭하고 엽니다.

처리할 이미지를 선택합니다. 바이오 포맷 가져오기 옵션 창에서 OME-XML 메타데이터 표시를 선택하고 OME 메타데이터 창 OK.In 클릭하여 픽셀 크기 정보를 검색합니다. 이 데이터를 복사합니다.

이미지 보정을 위해 메뉴 모음으로 이동하여 이미지 속성을 선택합니다. 정보를 복사하고 확인을 클릭합니다. 이미지에 선호하는 루트를 할당합니다. 단일 이미지에서 모든 스택을 시각화하려면 메뉴 모음으로 이동하여 이미지, 스택, Z 프로젝트를 선택합니다.

표시된 투영 창에서 용기가 시각화되는 모든 스택을 선택합니다. 프로젝션 유형에서 평균 강도를 선택하고 확인을 클릭합니다. 메뉴 표시줄, 이미지, 조정, 밝기/대비로 이동합니다. 적용을 클릭하고 변경 내용을 저장합니다.

밝기 및 대비를 위해 선택한 매개 변수를 복사합니다. 모든 이미지에 대해 동일해야 합니다. 메뉴 모음에서 지팡이 도구를 선택합니다.

형성된 혈관이 부족한 망막 영역을 선택합니다. 키보드에서 T를 눌러 ROI 관리자의 선택 영역을 기록합니다. ROI 관리자에서 측정값을 클릭하여 변색 영역 정보를 얻습니다.

망막의 총 면적을 측정하기 위해 이러한 단계를 반복합니다. 메뉴 모음에서 지팡이 도구를 선택합니다. 이미지를 확대하여 네오카를 더 잘 시각화합니다.

지팡이 도구를 사용하여 네오카를 하나씩 선택합니다. 키보드의 T 문자를 눌러 ROI 관리자에서 선택한 영역을 기록합니다. ROI 관리자에서 측정값을 클릭하여 영역 데이터를 가져옵니다.

메뉴 표시줄에서 직선 도구를 선택합니다. 이미지를 확대하여 용기 벽을 더 잘 시각화합니다. 첫 번째 분기 전에 주 선박에 세 개의 횡단 선을 수행합니다.

키보드에서 T를 눌러 ROI 관리자에서 선택한 영역을 기록합니다. ROI 관리자에서 측정값을 클릭하여 거리 데이터를 가져옵니다. 메뉴 표시줄에서 마우스의 오른쪽 버튼이 있는 직선 도구 아이콘을 클릭하고 분할된 선을 선택합니다.

혈관 모양에 따라 첫 번째 용기파급까지 시신경에서 용기 내부의 선을 그립니다. 키보드의 T 문자를 눌러 ROI 관리자에서 선택한 영역을 기록합니다. 메뉴 표시줄에서 직선 도구를 선택합니다.

시신경에서 첫 번째 용기파급효과까지 선을 그립니다. 키보드의 T 문자를 눌러 ROI 관리자에서 선택한 영역을 기록합니다. ROI 관리자를 측정하여 거리 데이터를 가져옵니다.

메뉴 모음의 타원형 도구를 사용하여 모든 실험 조건에 동일하게 적용된 영역을 정의합니다. 선택한 영역은 시신경 주위에 그려진 동심 원이어야 합니다. 키보드의 T 문자를 눌러 ROI 관리자에서 선택한 영역을 기록합니다.

수동으로 선택 영역 내부의 주요 선박에서 발생하는 기본 분기 수를 계산합니다. 이미지를 8비트 모드로 변환합니다. 메뉴 표시줄의 플러그인으로 이동하여 선박 분석, 혈관 밀도를 선택합니다.

선박 밀도를 측정하려는 메뉴 모음의 사각형 도구를 사용하여 영역을 정의합니다. 확인을 클릭합니다. 프로그램에 필요한 정보가 있는 새 창이 표시됩니다. 첫 번째 실험 예에서, 산소 유도 망막병증 마우스 모델이 사용되었다.

인트라비탈 주사는 항 혈관 신생약물로서의 약물의 효과를 결정하기 위해 산후 12일째에 수행되었다. 차량에 주입된 마우스는 제어로 사용되었습니다. 변기 부위는 망막 혈관이 결여된 영역으로 정의됩니다.

획득한 이미지로부터, 혈관이 없는 영역의 합으로 혈관영역을 정량화할 수 있다. 기계적 손상이 있는 영역도 선박의 부재를 보여줍니다. 손상된 부위를 식별하려면 Hoechst 얼룩으로 신경 층의 무결성을 분석하십시오.

네오선박은 우수한 혈관 신경발의 기존 선박에서 유래하는 작은 구경 혈관입니다. 우리는 망막의 총 면적에 의해 점유된 망막의 신생 혈관 영역을 정량화하여 신혈관의 터프가 점유하는 지역을 계산했습니다. 네오선박의 모양과 크기가 가변적이기 때문에 때때로 파편과 유물과 비슷하게 보일 수 있습니다.

네오선박을 구별하려면, 터프트가 성숙한 용기에서 자라는지 확인한다. 팽창의 분석을 위해, 우리는 첫 번째 분기 전에 세 높이에서 주요 선박 직경을 측정했다. 연구원은 결과 중 가변성을 감소시키기 위하여 선박 직경을 측정하기 위하여 미리 정해진 거리를 정의해야 합니다.

이상적으로, 시신경에서 가장 먼 지점은 약 300 마이크로 미터이어야한다. 우리는 조건 당 적어도 6 개의 동물의 분석, 그리고 나중에 평균을 수행하는 것이 좋습니다. 고문에 관해서는, 우리는 시신경과 제 1 분기 지점 사이의 직선 거리에 대하여, 그 모양에 따라 주요 선박에 의해 이동 거리를 측정합니다.

우리가 이미지에서 볼 수 있듯이, 주요 선박의 부추도에 이질성이있다. 대표적인 결과를 얻으려면 조건당 6개 미만의 마우스를 정량화해야 합니다. 최신 파라미터, 혈관 분진 및 밀도는 비증식 망막증을 나타내는 대사 증후군 모델에서 분석되었다.

혈관 분지의 측정을 위해 동심원을 그려 정량화 영역을 정의한 다음, 중앙 선박에서 발생하는 기본 분기를 하나씩 계산했습니다. 획득한 이미지에서 혈관 밀도는 각 마이크로사진의 상이한 장소에 위치한 ROI 의 영역으로 나뉘어진 용기에 의해 점유된 영역으로 정량화되었다. 기계적 손상으로 영역을 정량화하지 마십시오.

펑크가 있는 두 개 이상의 영역이 있는 경우 망막은 폐기해야 합니다. 요약하자면, 이 기사에서는 임상 실습에서 가장 관련성이 있는 매개 변수를 정량화하기 위해 고전적으로 확립된 재현 가능한 기술을 보여주었습니다.