Name: 워터젯 기술을 통한 돼지 지방 조직 유래 스트로마 세포 주입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 배우세요 돼지 지방 조직 유래 스트로마 세포의 워터젯 주입 기술을 통해 세포 치료의 정밀한 전달 방법을 탐구하세요. 이 기술은 요실금 치료와 근육 조직 재생에 활용됩니다.

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우리는 그들의 도움과 지원에 대한 원래 출판물의 공동 저자에 감사드립니다.

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저자 J.K., M.D, T.A., A.S., W.K. A.는 공개할 것이 없습니다. 저자 W.L.과 M.D.E.는 ERBEJet2 및 WJ 프로토 타입의 생산자 인 ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen의 직원입니다.

본 연구에서, 우리는 WJ 세포 전달 절차에 대한 단계별 접근법을 입증하고 제시했으며, 세포 특성에 대한 WJ 전달의 효과를 평가하기 위해 정량적 조사의 후유증을 채택했다 : 세포 생존력 및 생체 역학적 특징 (즉, EM). WJ 주사 후, 수확된 세포의 85.9%가 생존 가능하였다. WN 주사의 관점에서, 세포의 97.2 %는 주사 후 생존력을 유지했다. 따라서, WJ 접근법은 임상 구현을 위한 절대적 요건을 충족시킨다: 전달 후 80% 이상의 생존 가능한 세포(18). 표준화되고 재현 가능한 프로토콜이 WJ 접근법으로 달성되는 반면, 바늘 주입 전달의 결과는 주사기 및 바늘의 크기 및 노즐, 압력, 유속 및 주사 자체를 수행하는 의사(19)에 크게 의존한다.
살아있는 동물 모델에서 WJ 세포 전달을 채용한 연구는 다양한 토출 압력에 의해, 침투 깊이가 표적 조직에 적응될 수 있고, 그와 같이...

요실금 (UI)은 유럽 인구 1에서 1.8 - 30.5 %의 유병률을 가진 광범위한 장애이며 주로 요도 괄약근의 오작동이 특징입니다. 임상 적 관점에서 볼 때, 외과 적 치료는 종종 보존 적 치료법이나 물리 치료가 새로운 증상을 해결하고 완화시키지 못할 때 환자에게 제공됩니다.
괄약근 복합체 오작동의 잠재적인 재생 복구를 위한 세포 요법은 UI 병리학 2,3의 치료를 위한 아방가르드 접근법으로서 부각되고 있다. 주요 목표는 손상된 조직의 생물학적 기능을 대체, 복구 및 복원하는 것입니다. UI에 대한 동물 모델에서, 줄기 세포 이식은 비뇨 기역학적 결과 2,4,5에서 유망한 결과를 보여주었다. 줄기 세포는 자기 재생 및 분화 능력을 가질 수있는 능력을 가지고 있기 때문에 최적의 세포 후보로 발생하므로 영향을받는 조직 재생을 돕습니다6. 다가오는 재생 잠재력에도 불구하고, 세포의 최소 침습적 전달이 여전히 주사 정밀도 및 표적의 커버리지에 관한 몇 가지 도전에 직면함에 따라 세포 요법의 실질적인 사용은 여전히 방해 받고 있습니다. 세포 전달에 사용되는 현재의 접근법이 바늘 주사기 시스템(7)을 통한 주사임에도 불구하고, 일반적으로 생존 가능한 세포의 전반적인 결핍을 초래하며, 이식 후 1%-31%만큼 낮은 생존율을 보고하였다8. 또한, 바늘 주입을 통한 세포 전달은 또한 표적 조직 내로의 이식된 세포의 배치, 보유 속도 뿐만 아니라 분포에 영향을 미치는 것으로 나타났다(9,10,11). 상기 언급된 한계를 극복하는 실현 가능하고 새로운 접근법은 워터젯 기술을 통한 무바늘 세포 전달이다.
워터젯 (WJ) 기술은 요도 괄약근12,13에서 시각적 제어하에 방광경에 의한 세포의 높은 처리량 전달을 가능하게하는 새로운 접근법으로 부상하고 있습니다. WJ는 E5에서 E8013 범위의 다양한 압력 (E = 효과 바)에서 셀 전달을 가능하게합니다. 첫 번째 단계에서, (조직 침투 단계) 등장성 용액은 표적화된 조직을 둘러싸고 있는 세포외 매트릭스를 느슨하게 하기 위해 고압 (즉, E60 또는 E80)으로 적용되고 작은 상호연결 마이크로락쿠내를 개방한다. 두 번째 단계 (주입 단계)에서, 압력은 세포를 표적화 된 조직 내로 부드럽게 전달하기 위해 밀리 초 이내에 (즉, E10까지) 낮아진다. 이 두 단계-상 적용에 이어서, 세포는 분출될 때 조직에 대해 추가적인 압력을 받지 않지만, 액체-충전된 동굴 영역(13) 내로 저압 스트림으로 부유된다. 줄기 세포가 WJ를 통해 사체 요도 조직으로 주입되는 생체외 모델 설정에서, 생존 가능한 세포는 나중에 흡인 및 조직으로부터 회수되고 시험관내13에서 더욱 확장될 수 있었다. Weber et al.의 2020 년 연구에서 발자국이없는 심근 세포를 심근14에 전달하는 WJ의 실현 가능성과 적용 가능성을 입증했지만 WJ 기술은 여전히 프로토 타입 단계에 있음을 명심해야합니다.
다음 프로토콜은 돼지 지방조직 유래 기질 세포(pADSC)를 준비하고 라벨링하는 방법과 WJ 기술 및 윌리엄스 방광내시경 바늘(WN)을 통해 포획액 및 사체 조직으로 전달하는 방법을 설명합니다. 세포 주사 후, 원자력 현미경 (AFM)을 통해 세포 활력과 탄력성이 평가됩니다. 단계별 지침을 통해 프로토콜은 신뢰할 수있는 데이터를 얻기 위해 명확하고 간결한 접근 방식을 제공합니다. 토론 섹션에서는 기술의 주요 장점, 한계 및 향후 관점을 제시하고 설명합니다. 여기에 보고된 후유증 후 분석뿐만 아니라 세포의 WJ 전달은 표준 바늘 주입을 대체하고 표적 조직의 재생 치유를 위한 고체 세포 전달 프레임워크를 제공한다. 우리의 최근 연구에서 우리는 WJ가 바늘 주사15,16과 비교할 때 세포를보다 정확하고 적어도 비슷한 생존력으로 전달했다는 증거를 제공했습니다.

<table><tbody><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>Greiner BioOne</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>1 mL BD Luer-LokTM 주사기</td><td>BD Plastik Inc</td><td>n.a.100</td><td></td></tr> <tr><td>&micro; m cell sieve</td><td>Greiner BioOne</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>Greiner BioOne</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 조직 배양 플라스크</td><td>Corning Incorporated</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>AFM 헤드</td><td>(CellHesion 200) JPK</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>AFM 처리 소프트웨어</td><td>Bruker</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>AFM 소프트웨어</td><td>Bruker</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>AFM 시스템 Cell Hesion 200</td><td>Bruker</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>All-In-One-Al 캔틸레버</td><td>예산 센서</td><td>AIO-10</td><td>tip A, Conatct 모드, 모양: Beam Force 상수: 0.2 N/m(0.04 - 0.7 N/m) 공진 주파수: 15 kHz (10 - 20 kHz) 길이: 500 & 마이크로; m (490 - 510 &마이크로; m) 폭 : 30 & m (35 - 45 &마이크로; m) 두께 : 2.7 & 마이크로; m (1.7 - 3.7 &마이크로; m)</td></tr> <tr><td>암포 테리신 B 용액</td><td>시그마</td><td>A2942</td><td>250 &마이크로; g/ml</td></tr><tr><td>원자력 현미경 (AFM)</td><td>CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany</td><td>JPK00518</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 18G</td><td>BD</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Gibco</td><td>A10008-01</td><td></td></tr><tr><td>칸틸레버</td><td>&nbsp; All-In-One-AleTl, 예산 센서, 소피아, 불가리아</td><td>AIO-TL-10</td><td>팁 A, k &frac14; 0.2 N/m</td></tr><tr><td>C-칩 일회용 혈구계</td><td>NanoEnTek</td><td>631-1098</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기: Rotina 420R</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type I, 분말</td><td>Gibco</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 매체 - 저포도</td>당 <td>Sigma</td><td>D5546</td><td></td></tr><tr><td>깃털 일회용 메스 (No. 10)</td><td>깃털</td><td>02.001.30.010</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 나트륨 염 용액 (1M)</td><td>Sigma</td><td>H3662</td><td></td></tr><tr><td>반전 위상차 현미경 (AFM과 통합)</td><td>AxioObserver D1, Carl Zeiss 현미경, 예나, 독일</td><td>L201306_ 03</td><td></td></tr><tr><td>실험실 백</td><td>브랜드</td><td>759705</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민이 없는 Leibovitz의 L-15 배지</td><td>Merck</td><td>F1315</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민이 없는 Leibovitz의 L-15 배지</td><td>(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)</td><td>F1315</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Lonza</td><td>BE 17-605C1</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>이 키트에는 Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td>Calcein AM 및 EthD-1</td>의 Invitrogen이 사용됩니다.</tr><tr><td>현미경 소프트웨어: Zen 2.6</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경: AxioVertA.1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nelaton-Catheter 여성</td><td>Bicakcilar</td><td>19512051</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>10000 U/ml Penicillin 10000 &micro; g/ml</td></tr><tr>AFM <td>Bruker</td><td>T-05-0117</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM</td><td>JPK Instruments AG, Berlin, Germany</td><td>T-05-0117</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>와</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 관련된 Streptomycin 페트리 식기 히터 <tr><td>- CellStar</td><td>Greiner BioOne</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시</td><td>TPP AG</td><td>TPP93040</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시</td><td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland</td><td>TPP93040</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 솔루션</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>워터젯: ERBEJET2 장치</td><td>Erbe Elektromedizin GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Williams 방광경 주사 바늘</td><td>쿡 메디컬</td><td>G14220</td><td>23G, 5.0 Fr, 35 cm</td></tr></tbody></table>

워터젯 기술을 통한 돼지 지방 조직 유래 스트로마 세포 주입

Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stroma Cells via Waterjet Technology

요실금 (UI)은 요도 괄약근 근육의 결핍을 특징으로하는 매우 보편적 인 상태입니다. 재생 의학 분야, 특히 세포 요법은 요도 괄약근 기능을 향상시키고 회복시키는 새로운 접근법입니다. 활성 기능성 세포의 주사가 바늘 및 주사기에 의해 임상 환경에서 일상적으로 수행되지만, 이러한 접근법은 상당한 단점과 한계를 가지고 있습니다. 이러한 맥락에서, 무바늘 워터젯 (WJ) 기술은 요도 괄약근에 시각적 인 안내 방광 내시경 검사로 생존 가능한 세포를 주입 할 수있는 실현 가능하고 혁신적인 방법입니다. 본 연구에서, 우리는 WJ를 사용하여 돼지 지방 조직 유래 기질 세포 (pADSCs)를 사체 요도 조직으로 전달하고 WJ 전달이 세포 수율 및 생존력에 미치는 영향을 조사했습니다. 우리는 또한 원자력 현미경 (AFM) 측정에 의해 생체 역학적 특징 (즉, 탄력성)을 평가했습니다. 우리는 WJ가 전달한 pADSC가 세포 탄력성에서 현저하게 감소한다는 것을 보여주었다. 생존력은 대조군에 비해 현저히 낮았지만 여전히 80% 이상이다.

두 가지 접근법을 통한 세포 전달 후, WN을 통해 전달된 세포의 생존율(97.2± 2%, n=10, p&lt;0.002)은 E60-10 설정(85.9 ± 0.16%, n=12)을 사용하는 WJ에 의한 주사제와 비교했을 때 더 높았다(그림 2). 생체역학적 평가 결과는 다음과 같다는 것을 보여주었다: 포획 유체에서 세포의 WN 주사는 대조군과 비교했을 때 탄성 모듈리 (EM; 0.992 kPa)에 대하여 유의한 차이를 나타내지 않았다 (1.176 kPa; 도 3A), 반면 WJ 주사는 세포 EM의 현저한 감소를 촉발시켰다 (0.440 kPa, p&lt;0.001, 도 3B). WJ 주사 후 EM의 40 - 50 %의 감소가 주목되었다. 비록 사체 요도 조직에서의 WN 주사는 세포 EM에서 유의한 차이를 산출하지 못하였지만(도 4A</...

우리는 세포 생존력, 증식 및 탄력성 측정 측면에서 배달 후 조사의 후유증과 결합 된 바늘이없는 워터젯 기술을 통한 세포 주입 방법을 제시합니다.

Urinary incontinence (UI) is a highly prevalent condition characterized by the deficiency of the urethral sphincter muscle. Regenerative medicine ...

액체, 나노입자, 미세입자, 캡슐화된 약물, 또는 심지어 살아있는 세포와 같은 활성 성분의 워터젯 주사는 표적화된 상이한 조직에서의 바늘 주사와 비교할 때 훨씬 더 정밀하게 적용될 수 있다. 최소 침습적 접근법은 주사 압력을 미리 선택하여 표적 조직의 미리 결정된 층에서 약물의 정확한 국소화를 필요로 한다. 우리의 현재 초점은 요실금에 대한 세포 요법입니다.그러나, 이 기술은 이미 심각한 심장 발작 후에 감염된 근육 조직의 재생으로 확장되었다. 현재이 기술은 전임상 연구에서 숙련 된 연구자 또는 면허가있는 의사 만 적용 할 수 있습니다. 그것은 미래의 임상 목적을 위해 개발 된 일상적인 실험실 절차에서 사용하기위한 것이 아닙니다.시작하려면 성인 여성 육상 돼지에서 해부 된 연결 방광이있는 요도를 하부 골반 바닥의 탄력성을 모방 한 스폰지에 놓습니다. 그런 다음 방광을 사용하여 요도의 방향을 결정하십시오. 이것은 복부와 골반강의 방광을 고정시키는 요관과 세 인대의 국소화로 인해 가능합니다.요도를 올바르게 방향을 잡은 후 카테터의 도움으로 등쪽에서 세로로 열어 자릅니다. 돼지 지방조직 유래 기질 세포의 세포 밀도를 밀리리터당 여섯 번째 세포에 2.4배 10배로 조정한 후, 세포를 녹색 형광막 투과성 살아있는 세포 염색으로 표지한 다음, 주사기로 세포 현탁액을 흡인하고 윌리엄스 세포스코픽 주사 바늘을 적용한다. 다음으로, 바늘을 15 밀리리터 원심분리 튜브에 두 밀리리터의 성장 배지 바로 위에 고정하거나 바늘을 열린 요도 조직에 삽입하십시오.두 경우 모두 수동으로 250 마이크로 리터의 세포 현탁액을 주입하십시오. 세포는 주입 돔에서 사체 요도에 주입. 원심분리를 통해 배지에 직접 주입된 세포를 수집한다.사체 요도에 주입 된 세포의 경우, 주사기에 18 게이지 바늘을 적용하여 주사 돔에서 흡인하십시오. 흡인된 세포를 원심분리 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 펠릿화한다. 두 세포 펠릿을 네 밀리리터의 성장 배지에 재현탁시킨다.세포 수율과 생존력을 결정하려면, 세포 현탁액 20개를 20마이크로리터의 트리판 블루와 완전히 섞는다. 그런 다음이 혼합물 10 마이크로 리터를 혈구계의 각 챔버에 채 웁니다. 현미경으로 네 모서리 사각형 모두에서 세포를 계산합니다.염색되지 않은 백색 세포를 생존 가능한 세포로, 파란색으로 염색 된 세포를 죽은 세포로 계산 한 다음 밀리리터 당 세포 수를 계산하십시오. 워터젯을 통한 주사의 경우,

injection-porcine-adipose-tissue-derived-stroma-cells-via-waterjet

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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여기, 우리는 일련의 유화 및 여러 centrifugations를 포함 하는 기계적인 프로세스를 통해 지방 조직에서 stromal 혈관 분수를 얻기 위해 프로토콜 제시.

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기계적으로 분리된 Stromal Vascular Fraction과 Fibrin Hydrogel의 조합: 처리 프로토콜

여기에서는 지방 유래 줄기 세포(ADSC) 배양을 위한 3차원(3D) 세포 배양 프레임워크로 하이드로겔을 사용하는 방법을 시연하고 3D 배양 환경 내에서 ADSC의 증식을 향상시키기 위해 광생물 조절(PBM)을 도입하는 프로토콜을 제시합니다.

광생물조절 증강을 이용한 하이드로겔 내 지방 유래 줄기세포의 3차원 세포 배양

여기에서는 자가 지방 조직을 서로 다른 물리화학적 특성과 기능을 가진 다양한 지방 구성 물질로 변환할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

지방을 특수 성분으로 전환하기 위한 혁신적인 지방 조직 분획

여기서는 처리 시간이 &gt;90% 감소하고, 세포 생존율이 높으며, 광범위한 호환성을 특징으로 지방유래 줄기세포와 지방세포를 효율적으로 분리하는 표준 방법을 제시합니다.

돼지 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포와 지방세포의 효율적인 분리

배우세요 돼지 지방 조직 유래 스트로마 세포의 워터젯 주입 기술을 통해 세포 치료의 정밀한 전달 방법을 탐구하세요. 이 기술은 요실금 치료와 근육 조직 재생에 활용됩니다.

워터젯 기술을 통한 돼지 지방 조직 유래 스트로마 세포 주입

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