포획 분석기를 사용하여 바이러스와 같은 입자(VLP) 기반 백신에 표시되는 항원에서 중화에 민감한 에피토프 검출

내 실험실에서, 우리는 바이러스 벡터 및 바이러스 와 같은 입자, 또는 VLP 기지를 둔 백신을 위한 생산 시스템을 개발합니다. VLP 포획 분석법은 VLP에 표시되는 표적 항원의 매우 민감한 검출을 허용합니다. 이 분석에서, 우리는 VLP 표면에 이 전형의 노출을 증명하기 위하여 중화 에피토프에 대하여 지시된 광범위하게 중화항체를 이용합니다.

이것은 중화에 민감한 에피토프를 표시하는 VLP만이 백신에서 중화 항체 반응을 유도할 수 있기 때문에 백신 응시자에게 중요한 품질 평가입니다. 먼저 위아래로 파이프를 쓰거나 50 RPM에서 회전기에서 50RPM을 5분 이상 혼합하여 자기 구슬을 중단합니다. 한편, bNAB를 함유하는 항체 용액을 준비한다.

반응당 항체 결합 및 세척 버퍼의 200 마이크로 리터에 각 bNAB의 10 마이크로 그램을 사용합니다. 각 반응에 대해 자기 비드 용액 50마이크로리터를 1.5밀리리터 반응 튜브로 옮은 다음 자기 분리 랙에 튜브를 놓습니다. 구슬이 튜브 볼에 모일 때까지 기다렸다가 모든 구슬이 수집되었는지 확인하고 상부체를 제거하십시오.

자석을 제거하고 이전에 준비된 bNAB 용액의 200 마이크로리터에서 구슬을 일시 중단합니다. 실온에서 50 RPM에서 회전기에서 혼합하는 동안 30 분에서 3 시간 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후 반응 튜브를 자기 분리 랙에 놓고 기다렸다가 상체를 제거합니다.

자석에서 튜브를 제거하고 항체 결합 및 세척 버퍼의 200 마이크로 리터에서 다시 중단하여 구슬을 세척합니다. 항체 결합 및 세척 버퍼로 세척을 반복하여 완료되면 가능한 한 많은 세척 버퍼를 제거하십시오. 비드 바인딩 bNAB에 샘플을 추가합니다.

추가된 샘플 볼륨이 1밀리리터 미만인 경우 PBS를 추가하여 샘플 볼륨을 1밀리리터로 조정한 다음 부드럽게 파이펫팅하여 구슬을 다시 일시 중단합니다. 실온에서 회전기에 2.5시간 동안 시료와 구슬을 배양하여 비즈가 서스펜션에 머무르고 잠복하는 동안 용액이 철저히 혼합되도록 합니다. 자석에 튜브를 놓고 상체를 제거 한 다음 200 마이크로 리터의 세척 버퍼에서 중단하여 자기 구슬을 씻으십시오.

100 마이크로리터의 세척 완충제에서 구슬을 중단하고 서스펜션을 깨끗하고 내열성 반응 튜브로 옮기습니다. 자기 분리 랙에 튜브를 놓고 상체를 완전히 제거합니다. 변성 된 STS-PAGE 샘플을 준비하기 위해, 라엠리 버퍼의 20 ~ 80 마이크로 리터에서 구슬을 중단하고 5 분 동안 섭씨 95도에서 배양하십시오.

SDS-PAGE로 직접 진행하여 튜브를 자기 랙에 배치하여 구슬을 용액과 분리합니다. 또는 샘플을 섭씨 영하 20도에 보관하십시오. BNAB를 사용하여 세포없는 세포 배양 상류체 및 VLP 펠릿에서 처음 포착된 VLP의 대표적인 결과는 바이러스 성 코어 단백질을 검출하기 위해 서양 블롯 분석을 실시하였으며, 여기에 도시된다.

포획 분석에 사용되는 구슬은 네거티브 컨트롤로 사용되는 봉투 당단백질 및 동위원소 항체의 중화 에피토프에 대한 3가지 다른 bNABs로 코팅되었다. 동위원소 항체 코팅 구슬을 사용하여 대머리 VLP, 즉 Env-negative VLP 또는 Env 표시 VLP를 포함하는 VLP 샘플에서 개그 단백질을 검출할 수 없었으며, VLP의 특이하지 않은 결합이 인간 항체로 코팅된 비드에 대한 특이한 결합이 VLP 캡처를 중재하지 않았음을 입증하였다. 대머리 VLP는 또한 bNABs 코팅 구슬에 의해 구속되지 않았고, 결과적으로, 서양 얼룩 분석에서 어떤 개그 단백질도 검출되지 않았습니다.

대조적으로, 3개의 bNAB는 모두 Env 단백질을 표시하는 VLP를 붙잡아, 따라서, 개그 단백질은 VLP에 전시된 Env-glycoproteins에 있는 중화 에피토프의 존재를 보여주기 쉽게 검출되었습니다: 항체 코팅 구슬과 VLP의 철저한 혼합에 결정적인. 이는 회전 중인 500마이크로리터보다 큰 볼륨을 사용하여 가장 잘 달성됩니다.

또는 캡처된 VLP는 감소가 없는 조건에서 발출될 수 있습니다. 이를 통해 면역 전자 현미경 검사법을 사용하는 VLP의 분석 또는 네이티브 PAGE를 사용하여 표시된 항원의 조사를 가능하게 한다.