Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer를 사용하여 Osteoblast Bioenergetics 모니터링

실시간 세포 대사 플럭스 분석은 pH 및 산소 센서를 사용하여 미토콘드리아 및 해당작용 아데노신 삼인산 생성에 해당하는 산소 소비율과 세포 외 산성화 속도를 측정합니다. 이 원고는 조골세포의 에너지 상태를 이해하는 방법과 세포 생체 에너지 상태의 특성화 및 해석을 설명합니다.

이 방법은 ATP 생산 속도와 같은 세포 에너지를 측정하고 특정 대사 산물에 대한 세포 선호도를 실시간으로 결정하는 데 유용합니다. 먼저 200마이크로리터의 XF 캘리브rant를 추가하고 분석 전에 최소 1시간 동안 유틸리티 플레이트를 배양합니다. 보충된 XF DMEM을 사용하여 80ml의 XF 분석 배지를 준비합니다.

올리고마이신 A, 로테논, 안티마이신 A를 얼음 위에서 해동합니다. 사용하기 전에 화합물을 위아래로 피펫팅하여 가용화시킵니다. A와 B로 표시된 3 밀리리터의 준비된 분석 배지를 각 튜브에 추가합니다.26.4 마이크로 리터의 2.5 밀리 몰 올리고마이신 A를 튜브 A에 추가하고 3.1 마이크로 리터의 12.67 밀리 몰 로테논, 4.1 마이크로 리터의 9.4 밀리 몰 안티마이신 A 및 30 마이크로 리터의 후크 염색을 튜브 B에 추가합니다. 해당 주입 포트에 이러한 억제제의 10 배 농도를 적재합니다.

마지막으로, 20마이크로리터의 이러한 화합물이 200마이크로리터의 분석 매체를 통해 세포에 적재됩니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 세포 배양 마이크로플레이트를 제거하고 현미경으로 세포를 관찰합니다. 수조에서 분석 매체를 제거합니다.

200마이크로리터의 예열된 분석 배지로 세포를 두 번 부드럽게 세척하고 웰당 200마이크로리터의 분석 매체를 추가합니다. 현미경으로 세포를 검사하여 세포가 웰에 부착된 상태로 남아 있는지 확인합니다. D5 및 E8 웰의 셀이 일관된 단층으로 부착되어 있고 세척 단계에서 씻겨 나가지 않았는지 확인합니다.

세포 이미징 소프트웨어는 자동 초점과 자동 노출을 설정하기 위해 이 두 웰을 사용합니다. 장비 옆에 있는 컴퓨터에서 데스크톱 소프트웨어를 엽니다. 컨트롤러 소프트웨어의 왼쪽 하단 모서리에서 연결 상태를 확인합니다.

템플릿으로 이동하여 XF ATP rate assay template 또는 적절한 assay template을 선택합니다. 화면 맨 위에서 Group Definitions(그룹 정의)를 선택하고 그룹을 정의합니다. Plate Map Layout을 선택하고 정의된 그룹에 따라 Well을 할당합니다.

기기 프로토콜을 확인합니다. 추가된 화합물이 올바르게 나열되었는지 확인하고 나중에 참조할 수 있도록 프로젝트 정보를 포함합니다. Run Assay(어세이 실행)를 클릭합니다.

그러면 결과 파일 저장 위치를 선택하라는 메시지가 표시됩니다. 결과 파일을 저장할 위치를 선택합니다. 분석 날짜와 함께 파일을 저장하고 실행 시작을 클릭합니다.

센서 카트리지와 유틸리티 플레이트를 트레이에 놓고 I'm Ready(준비 완료)를 클릭하여 보정을 시작합니다. 컴퓨터에서 세포 이미징 소프트웨어를 엽니다. 마이크로플레이트 이미저가 켜져 있고 포트가 컴퓨터에 연결되어 있는지 확인하십시오.

화면 왼쪽 아래에 있는 상태 표시줄을 확인하여 온도가 섭씨 37도로 설정되어 있고 연결 상태가 준비됨으로 녹색으로 강조 표시되어야 합니다. 플레이트 바코드를 스캔하여 이미징 프로세스를 시작합니다. 셀 플레이트에 이름을 입력하고 저장을 누르십시오.

명시야 및 형광 이미지가 여기에 저장됩니다. Perform Brightfield Scan(명시야 스캔 수행)을 클릭하면 다음 화면에서 Plate 및 Scan Menu(스캔 메뉴)에 이미징 옵션이 표시됩니다. 분석 전에 Brightfield Scan 시작을 선택합니다.

세포 배양 마이크로플레이트와 플레이트 커버를 트레이 홀더에 놓고 A1을 A1 표시에 잘 맞춥니다. Close Tray(트레이 닫기)를 클릭합니다. 명시야 이미지 획득은 플레이트 맵과 함께 다음 화면에 나타납니다.

Scan All Wells(모든 웰 스캔)를 클릭하고 30-35분 동안 스캔합니다. 교정이 완료되면 소프트웨어는 로드 셀 플레이트(Load Cell Plate) 대화 상자를 표시합니다. 그런 다음 Open Tray(트레이 열기)를 클릭하여 유틸리티 트레이를 세포 배양 마이크로플레이트로 교체합니다.

세포 배양 플레이트는 마이크로플레이트 이미저에 있습니다. 스캔 후 세포 배양 마이크로플레이트를 제거하고 분석기에 넣어 분석을 수행합니다. 그런 다음 Load Cell Plate를 클릭하여 분석을 시작합니다.

분석이 시작될 때까지 기다렸다가 예상 완료 시간을 표시합니다. 분석이 완료되면 Unload Sensor Cartridge and Cell Plate 대화 상자가 표시됩니다. Eject를 클릭하고 분석기에서 세포 배양 마이크로플레이트를 제거합니다.

센서 카트리지를 조심스럽게 제거하고 셀 플레이트 덮개를 교체합니다. Assay Complete(어세이 완료) 대화 상자가 나타납니다. 그런 다음 결과 보기를 클릭하여 분석 결과 파일을 열거나 데이터를 정규화합니다.

분석이 완료되면 휴대용 바코드 리더기로 플레이트 바코드를 스캔합니다. 플레이트가 이미 이미징된 경우 새 이름이 필요하지 않습니다. Fluorescence(형광)와 Cell Count(세포 수)를 선택합니다.

셀 플레이트를 트레이 홀더에 놓고 트레이 닫기를 클릭합니다. 이미지 획득 창에서 Scan All Wells를 선택하여 이미징을 시작합니다. 이미징 및 세포 이미징 응용 프로그램에서 몇 개의 웰을 무작위로 클릭하여 형광 이미지와 세포 수를 검토합니다.

형광 이미징이 완료되면 추가 참조를 위해 이미지를 내보냅니다. 이미징 및 세포 수가 완료되면 결과 파일을 열고 Normalize를 클릭합니다. Import(가져오기)를 클릭하고 Apply for the desktop software(데스크톱 소프트웨어)를 선택하여 세포 수로 분석을 자동으로 정규화합니다.

올리고마이신 A와 FCCP 스트레스 요인 혼합물 주사는 대조군의 기준선 활성을 증가시켰다. 스트레스 요인은 대조군과 치료군에서 상당히 높은 에너지 수준을 보였다. 반면에, 치료 2는 기준선 활성이 비교적 낮았고, 세포는 더 호기성이 되었습니다.

이 그림은 대조군 세포와 실험 세포 모두 ATP 생성을 위해 해당작용과 미토콘드리아 산화 인산화를 사용한다는 것을 나타냅니다. 실험 그룹은 해당과정을 통한 ATP 생성의 감소와 미토콘드리아 호흡의 증가를 보여줍니다. 치료군의 기저호흡수는 대조군보다 상대적으로 낮다.

두 그룹 모두에서 호흡 및 ATP 생성 속도가 감소하며, 양성자 누출 후 올리고마이신 A 주사가 뒤따릅니다. 세포의 호흡 수는 FCCP 주입 후 최대 호흡으로 다시 상승합니다. 로테논과 항마이신 A의 최종 주입은 OCR을 다시 감소시킵니다.

세 번째 주사 후, 미토콘드리아 호흡은 로테논과 항마이신 A의 조합에 의해 차단됩니다.대조군에 비해 치료 그룹의 기저 및 최대 호흡은 상대적으로 변화가 없습니다. 그림은 대조군이 포도당 경로에 크게 의존하는 반면, 글루타민 산화는 대조군에서 효율적임을 보여줍니다. 지방산 경로는 치료가 세포의 전반적인 용량을 증가시켰음을 보여줍니다.

산판에 여러 개의 주입 포트가 있어 단일 시점에서 세포 에너지에 대한 여러 약물의 효과를 결정하는 데 도움이 됩니다.