Name: 세포 분류 없이 스냅 동결 이종 조직 샘플에서 세포 유형 특이적 RNA 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 학습하세요 NuTRAP 마우스 모델과 GLP 풀다운을 이용한 세포 유형 특이적 리보솜 결합 RNA 분리 방법입니다. EGFP 발현 세포에서 고품질 RNA를 추출하여 고환의 Leydig 세포와 Sertoli 세포에서 유전자 발현을 연구할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작업은 NIH R00HD082686에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 우리는 HSZ에 내분비 학회 여름 연구 펠로우십에 감사드립니다. 우리는 또한 마우스 식민지를 번식시키고 유지 한 Yuan Kang 박사에게 감사드립니다.

수행 된 모든 동물 실험은 Auburn University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 승인 한 프로토콜을 따랐습니다.
참고: 다음 프로토콜은 Gli1-CreERT2의 P28에서 하나의 고환(약 100mg)을 사용합니다. NuTRAP 마우스 (무스 근육). 시약의 부피는 샘플 유형과 조직 수에 따라 조정해야 할 수도 있습니다.
1. 조직 수집
<ol><li>CO2 챔버를 사용하여 마우스를 안락사시키고, 복부 표면을 70% 에탄올로 살균한다.</li>
	<li>가위로 하복부를 열고 고환을 제거하십시오. 액체 질소 (LN2)를 사용하여 고환을 즉시 스냅 동결하십시오.</li>
	<li>사용할 때까지 LN2 의 증기상에 샘플을 보관하십시오.</li>
</ol>2. 시약 및 비드 준비
<ol><li>균질화 원액 준비: 50 mM 트리스(pH 7.4), 12 mMMgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 및 1 mg/mL 헤파린을 추가합니다. 사용할 때까지 (최대 1 개월) 4 ° C에서 용액을 보관하십시오.</li>
	<li>사용하기 전에 원액(단계 2.1)에서 균질화 작업 완충액을 새로 준비합니다: DTT(최종 농도: 1mM), 시클로헥시미드(최종 농도: 100μg/mL), 재조합 리보뉴클레아제(최종 농도: 200단위/mL) 및 프로테아제 억제제 칵테일(최종 농도: 1x)을 균질화 원액에 추가하여 필요한 양의 균질화 작업 완충액을 만듭니다. 사용할 때까지 새로 준비한 작업 버퍼를 얼음에 보관하십시오.</li>
	<li>저염 및 고염 세척액을 준비하십시오.<ol><li>저염 세척 완충액을 제조하여 50 mM 트리스(pH 7.4), 12 mMMgCl2, 100 mM KCl, 및 1% NP-40을 혼합하였다. 사용하기 전에 DTT(최종 농도: 1mM)와 사이클로헥시미드(최종 농도: 100μg/mL)를 추가합니다.</li>
		<li>고염 세척 완충액을 제조하여 50 mM 트리스(pH 7.4), 12 mMMgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40을 혼합하였다. 사용하기 전에 DTT(최종 농도: 2mM)와 사이클로헥시미드(최종 농도: 100μg/mL)를 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>단백질 G 비드 준비 (재료 표) :<ol><li>각 샘플에는 50μL의 단백질 G 비드가 필요합니다. 필요한 양의 비드를 1.5mL 원심분리 튜브에 넣고 튜브를 랙에 30-60초 동안 그대로 두어 마그네틱 랙을 사용하여 비드를 용액에서 분리합니다.</li>
		<li>피펫팅으로 상청액을 제거합니다. 매번 얼음처럼 차가운 저염 세척 완충액 1mL로 구슬을 세 번 씻습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 조직 용해 및 균질화
<ol><li>2mL의 얼음처럼 차가운 균질화 작업 완충액(2.2단계에서 새로 준비)을 유리 티슈 그라인더 세트에 추가합니다. 냉동 샘플을 분쇄기에 빠르게 넣고 느슨한 유봉을 사용하여 얼음 위에서 30 스트로크로 조직을 균질화하십시오.</li>
	<li>균질액을 2mL 둥근 바닥 튜브에 옮기고 12,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상청액을 새 2mL 튜브로 옮깁니다. 1.5mL 튜브에 100μL를 "입력"으로 저장합니다.</li>
	<li>상청액을 항-GFP 항체(5μg/mL; 1:400)와 함께 2mL 튜브에서 엔드 오버엔드 회전기(24rpm)에서 4°C에서 밤새 배양합니다.</li>
</ol>4. 면역침전
<ol><li>균질액/항체 혼합물을 단계 2.4에서 세척된 단백질 G 비드를 포함하는 새로운 2mL 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 엔드 오버 엔드 로테이터(24rpm)에서 4°C에서 2시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>자석 랙을 사용하여 상청액으로부터 자성 비드를 분리한다. 상청액을 "음수 분획"으로 저장하십시오. 음성 분획에는 (1) EGFP 음성 세포의 RNA와 (2) 리보솜에 결합하지 않은 EGFP 양성 세포의 RNA가 포함됩니다.</li>
	<li>비드에 고염 세척 버퍼 1mL를 추가하고 튜브를 잠시 와류하여 비드를 세척합니다. 튜브를 자석 랙에 놓습니다.</li>
	<li>세척 버퍼를 제거합니다. 세척 단계를 두 번 더 반복하십시오. 비드는 이제 EGFP 양성 세포의 비드-리보솜-RNA 복합체를 포함합니다.</li>
</ol>5. RNA 추출
참고: 다음 단계는 RNA 분리 키트(재료 표)에서 채택된 것입니다. 각 분획(즉, 입력, 양성 및 음성)을 독립적인 샘플로 처리하고 RNA를 독립적으로 분리합니다.
<ol><li>단계 4.4의 비드를 50μL의 추출 버퍼(RNA 분리 키트에서)와 함께 써모믹서(42°C, 500rpm)에서 30분 동안 인큐베이션하여 비드에서 RNA를 방출합니다.</li>
	<li>자석 랙으로 비드를 분리하고 비드-리보솜-RNA 복합체가 포함된 상청액을 1.5mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>튜브를 3000 x g 에서 2분 동안 원심분리한 다음 상층액을 새 1.5mL 튜브에 피펫팅합니다. 이 튜브에는 TRAP 단계의 "양의 분획"이 포함되어 있습니다. 참고: 입력 및 음성 분획의 경우 1mL의 추출 버퍼를 사용하여 25μL의 샘플에서 RNA를 추출합니다. 써모믹서(42°C, 500 rpm)에서 30분 동안 배양한다.</li>
	<li>RNA 정제 컬럼의 사전 컨디셔닝: 250μL의 컨디셔닝 버퍼를 정제 컬럼에 피펫팅합니다. 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다. 컬럼을 16,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>피펫 동량의 70% EtOH를 단계 5.3으로부터의 상청액 내로 넣는다(약 50 μL의 70% EtOH 양성 분획 및 1 mL의 70% EtOH 및 1 mL의 70% EtOH 및 음성 분획). 위아래로 피펫팅하여 잘 섞는다.</li>
	<li>혼합물을 5.4단계의 컬럼에 피펫팅합니다.</li>
	<li>컬럼의 멤브레인에 RNA가 결합할 수 있도록 컬럼을 100 x g에서 2분 동안 원심분리한 다음 즉시 16,000 x g 에서 30초 동안 원심분리를 계속합니다. 플로우 스루를 폐기합니다. 참고: 입력 및 음수 분획의 경우 매번 250μL의 혼합물을 컬럼에 추가합니다. 모든 혼합물이 사용될 때까지 5.6단계와 5.7단계를 반복합니다.</li>
	<li>컬럼에 100μL의 세척 버퍼 1(W1)을 피펫팅하고 8,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.</li>
	<li>피펫 75 μL의 DNase 용액을 정제 컬럼 멤브레인에 직접 혼합합니다. RT에서 15 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>컬럼에 W1 40μL를 피펫팅하고 8,000 x g 에서 30초 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.</li>
	<li>100 μL의 세척 완충액 2(W2)를 컬럼에 피펫팅하고 8,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.</li>
	<li>100 μL의 W2를 컬럼에 피펫팅하고 16,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다. 동일한 컬럼을 16,000 x g 에서 1분 동안 다시 원심분리하여 용리 단계 전에 세척 버퍼의 모든 흔적을 제거합니다.</li>
	<li>컬럼을 새 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>RNase가 없는 물 12μL를 정제 컬럼의 멤브레인에 직접 피펫팅합니다. 피펫 팁이 멤브레인에 닿지 않아야합니다. RT에서 1 분 동안 배양하고 1000 x g 에서 1 분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 16,000 x g 에서 1분 동안 원심분리를 계속하여 RNA를 용리합니다.</li>
</ol>6. RNA 농도 및 품질
<ol><li>추출된 RNA10의 품질과 양을 평가하기 위해 바이오분석기를 사용한다.</li>
</ol>7. 저장 및 추가 분석
<ol><li>추가 분석(예: 마이크로어레이, 정량적 PCR(qPCR) 및 RNA-seq 등)이 있을 때까지 RNA를 -80°C(최대 1년)에서 저장합니다. 참고: cDNA 합성을 포함한 qPCR 분석에 대한 자세한 내용은 Lyu et al.11을 참조하십시오. qPCR용 프라이머는 재료표에 나열되어 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li>
<li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li>
<li>Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAP-rc%2C+translating+ribosome+affinity+purification+from+rare+cell+populations+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985(2015).</li>
<li>Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+ribosome+affinity+purification+%28trap%29+to+investigate+Arabidopsis+thaliana+root+development+at+a+cell+type-specific+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919(2020).</li>
<li>Moran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29+for+RNA+isolation+from+endothelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624(2019).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Varjosalo, M., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog%3A+functions+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog: functions and mechanisms.</a> Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).</li>
<li>Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+number+%28RIN%29-standardization+of+RNA+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Technologies%22%5BJournal%5D)">RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control.</a> Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).</li>
<li>Lyu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+reveals+sub-zones+in+mouse+adrenal+zona+fasciculata+and+the+sexually+dimorphic+responses+to+thyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone.</a> Endocrinology. 161 (9), (2020).</li>
<li>King, P., Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh+signaling+regulates+adrenocortical+development+and+identifies+progenitors+of+steroidogenic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).</li>
<li>Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+expansion+and+organ+size+of+mouse+adrenal+is+regulated+by+sonic+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog.</a> Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).</li>
<li>Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+adult+Leydig+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of adult Leydig cells.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).</li>
<li>Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+11%CE%B2-hydroxysteroid+dehydrogenase.+Testicular+11%CE%B2-hydroxysteroid+dehydrogenase%3A+development+of+a+model+for+the+mediation+of+Leydig+cell+function+by+corticosteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids.</a> Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).</li>
<li>Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli+cell+signaling+by+Desert+hedgehog+regulates+the+male+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline.</a> Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).</li>
<li>Beverdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9-dependent+expression+of+Gstm6+in+Sertoli+cells+during+testis+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice.</a> Reproduction. 137 (3), 481(2009).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+single-cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Technologies for single-cell isolation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108(2018).</li>
<li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693(2020).</li>
<li>Barsoum, I., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+and+differential+roles+of+transcription+factors+Gli1+and+Gli2+in+the+development+of+mouse+fetal+Leydig+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells.</a> Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).</li>
<li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

전체 조직 전사체 분석의 유용성은 특히 복잡한 이종 조직을 연구할 때 저해될 수 있습니다. 세포 유형 특이적 RNA를 얻는 방법은 강력한 RNA-seq 기술을 발휘하는 것이 시급한 필요성이 되고 있다. 세포 유형 특이적 RNA의 분리는 일반적으로 미세 조작, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 레이저 포획 미세 해부(LCM)18를 사용한 특정 유형의 세포 수집에 의존합니다. 다른 현대의 고처리량 단일 세포 수집 방법 및 기기도 개발되었습니다(19). 이러한 방법은 일반적으로 미세 유체 기술을 사용하여 단일 세포에 바코드를 적용한 다음 단일 세포 RNA-seq를 바꿉니다. 세포 해리는 부유 세포 용액을 얻는 데 필요한 단계이며, 그런 다음 세포 분류기 또는 미세 유체 장치를 통해 각 세포를 바코드화합니다. 세포 해리 단계는 효소 처리가 조직을 분해할 뿐만 아니라 세포 생존율 및 전사 프로파일에도 영향을 미치기 때문에 세포 유형 특이적 연구를 ...

RNA 시퀀싱(RNA-seq) 및 마이크로어레이를 포함한 고처리량 접근 방식을 통해 게놈 전체 수준에서 유전자 발현 프로필을 조사할 수 있게 되었습니다. 심장, 뇌 및 고환과 같은 복잡한 조직의 경우 세포 유형 특이적 데이터는 전체 조직 1,2,3의 RNA 사용을 비교하는 더 자세한 정보를 제공합니다. 세포 이질성의 영향을 극복하기 위해, 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법은 2010년대 초부터 개발되어 왔다4. TRAP는 조직 해리없이 특정 세포 유형에서 리보솜 결합 RNA를 분리 할 수 있습니다. 이 방법은 초파리 배아5에서 극히 드문 근육 세포 집단을 표적으로 삼고, 모델 식물 Arabidopsis thaliana6에서 다른 뿌리 세포를 연구하고, 포유류7에서 내피 세포의 전사체 분석을 수행하는 것을 포함하여 다양한 유기체에서 트랜스플라톰(번역을 위해 리보솜에 모집되는 mRNA) 분석에 사용되었습니다.
TRAP은 모델 유기체의 리보솜에 태그를 지정하기 위해 유전자 변형이 필요합니다. Evan Rosen과 동료들은 최근 Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) 마우스8이라는 마우스 모델을 개발했으며, 이는 2017 년부터 Jackson Laboratory를 통해 제공되었습니다. 연구자들은 Cre 마우스 라인과 교차함으로써 이 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 분류 없이 Cre 발현 세포에서 리보솜 결합 RNA와 세포핵을 분리할 수 있습니다. NuTRAP 대립 유전자도 운반하는 Cre 발현 세포에서 EGFP/L10a 태그가 지정된 리보솜을 사용하면 친화성 풀다운 분석을 사용하여 번역 mRNA를 분리할 수 있습니다. 동일한 세포에서 비오틴 리가아제 인식 펩타이드(BLRP) 태그가 부착된 핵막(mCherry 양성이기도 함)은 친화성 또는 형광 기반 정제를 사용하여 핵 분리를 허용합니다. 같은 연구팀은 또한 핵막이 비오틴8없이 mCherry로만 표지 된 유사한 마우스 라인을 생성했습니다. 이 두 개의 유전자 변형 마우스 라인은 관심 있는 특정 유형의 세포의 쌍을 이루는 후성유전체 및 전사체 프로필을 특성화할 수 있는 액세스를 제공합니다.
고슴도치(Hh) 신호 전달 경로는 조직 발달에 중요한 역할을 합니다9. GLI 계열의 구성원인 GLI1은 전사 활성제 역할을 하며 Hh 신호 전달을 매개합니다. Gli1+ 세포는 부신과 고환을 포함한 많은 호르몬 분비 기관에서 찾을 수 있습니다. NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 Gli1+ 세포로부터 세포 유형 특이적 DNA 및 RNA를 분리하기 위해, Gli1-CreERT2 마우스를 NuTRAP 마우스와 교차시켰다. Shh-CreERT2 마우스는 또한 소닉 헤지혹(Shh) 발현 세포를 단리하는 것을 목표로 하는 NuTRAP 마우스와 교차하였다. 다음 프로토콜은 Gli1-CreERT2를 사용하는 방법을 보여줍니다. NuTRAP 마우스를 사용하여 성인 마우스 고환의 Gli1+ 세포에서 리보솜 결합 RNA를 분리합니다.

<table><tbody><tr><td>Actb</td><td>eurofins</td><td>qPCR 프라이머</td><td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (정방향 프라이머/역방향 프라이머)</td></tr><tr><td>바이오분석기</td><td>Agilent</td><td>2100 바이오분석기 기기</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>밀리포어</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>사이클로헥시미드</td><td>밀리포어</td><td>239764-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Cyp11a1</td><td>eurofins</td><td>qPCR 프라이머</td><td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer)</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DTT, Dithiothreitol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>GFP 항체</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>유리 그라인더 세트</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>heparin</td><td>BEANTOWN CHEMICAL</td><td>139975-250MG</td><td></td></tr><<tr><td>em>Hsd3b</td><td>eurofins</td><td>qPCR 프라이머</td><td>GACAGGAGCAGGAGGGTGTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (정방향 프라이머/역방향 프라이머)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Biosciences</td><td>R005</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosciences</td><td>R004</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 2mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-707-354</td><td></td></tr><tr><td>마우스 Clariom S 분석 마이크로어레이 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>마이크로어레이 서비스</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Millipore</td><td>492018-50 Ml</td><td></td></tr><tr><td>올리고(dT)20</td><td>Invitrogen</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure RNA 분리 키트</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>단백질 G, Dynabead</td><td>Thermo Fisher Scientific</td>, <td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 수생</td><td>세포</td><td>NUPW-0500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT 재조합 리보뉴클레아제 억제제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> 10777019<td></td></tr><tr><td>Sox9</td><td>eurofins</td><td>qPCR 프라이머</td><td>TGAAGAACGGACCAAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (정방향 프라이머/역방향 프라이머,</td></tr><tr><td>Superscript IV, 역전사효소</td>, <td>Invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR 마스터 믹스</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> 4309155<td></td></tr><tr><td>Sycp3</td><td>eurofins</td><td>qPCR 프라이머</td><td>GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (정방향 프라이머/역방향 프라이머)</td></tr><tr><td>트리스</td><td>알파 Aesar</td><td>J62848</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 분류 없이 스냅 동결 이종 조직 샘플에서 세포 유형 특이적 rna 분리

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

세포 이질성은 전사체 수준에서 복잡한 조직의 기능을 이해하는 데 어려움을 겪습니다. 세포 유형 특이적 RNA를 사용하면 조직의 이질성으로 인한 잠재적인 위험을 방지하고 강력한 전사체 분석을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법을 사용하여 세포 분류 없이 복잡한 조직에서 소량의 EGFP 발현 세포에서 리보솜 결합 RNA를 분리하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 최근 이용 가능한 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 유형 특이적 RNA를 분리하는 데 적합하며 EGFP 발현 세포에서 RNA를 분리하는 데에도 사용할 수 있습니다.

Gli1-CreERT2 마우스 (잭슨 랩 스톡 번호: 007913)를 먼저 NuTRAP 리포터 마우스 (잭슨 랩 스톡 번호: 029899)와 교차시켜 이중 돌연변이 마우스를 생성하였다. 유전자 조작 유전자 대립 유전자 (즉, Gli1-CreERT2 및 NuTRAP)를 모두 보유한 마우스에 하루에 한 번, 격일로 3 회 주사 할 때 타목시펜을 주사 하였다. 조직 샘플은 주사 후 1일째 되는 날인 7일째에 수집하였다. 면역 형광 분석 결과 EGFP는 고환의 간질 세포에서 발현되었습니다 (그림 1). 부신 캡슐은 Gli112,13의 또 다른 세포 집단 양성인 것으로 알려져 있습니다. EGFP는 또한 Gli1-CreERT2...

이 프로토콜은 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 유형 특이적 번역 리보솜 mRNA를 분리하는 것을 목표로 합니다.

세포 분류 없이 스냅 동결 이종 조직 샘플에서 세포 유형 특이적 RNA 분리

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

이 프로토콜은 세포 분류 없이 복잡한 조직의 소수의 세포에서 고품질 세포 유형 특이적 RNA를 얻는 것을 목표로 합니다. 연구자들이 GLP 풀다운을 사용하여 리보솜 결합 RNA를 분리할 수 있도록 하는 최근 사용 가능한 마우스 모델을 사용합니다. 상기 방법은 또한 임의의 EGFP 발현 세포로부터 리보솜 결합 RNA를 단리하는데 적합하다.시작하려면 유리 티슈 그라인더 세트에 2 밀리리터의 얼음처럼 차가운 균질화 작업 버퍼를 추가하십시오. 냉동 샘플을 분쇄기에 빠르게 넣고 느슨한 유봉을 사용하여 얼음 위에서 30 스트로크로 조직을 균질화하십시오. 균질 액을 2 밀리리터의 둥근 바닥 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10 분 동안 12, 000g에서 원심 분리합니다.그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 새로운 2 밀리리터 튜브로 옮기고 100 마이크로 리터를 입력으로 예약합니다. 항-GFP 항체와 함께 상청액을 섭씨 4도에서 밤새 회전근의 끝에서 배양합니다. 균질액과 항체 혼합물을 세척된 단백질 g 비드를 함유하는 새로운 2밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮기고, 2시간 동안 24RPM의 회전기에서 섭씨 4도 인큐베이션하였다.마그네틱 랙을 사용하여 상청액으로부터 마그네틱 비드를 분리한다. 상청액을 EGFP 음성 세포의 RNA와 리보솜에 결합되지 않은 EGFP 양성 세포의 RNA를 포함하는 음성 분획으로 저장합니다. 비드에 1 밀리리터의 고 염 세척 버퍼를 추가하고 튜브를 간단히 와동시켜 비드를 세척합니다.그런 다음 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다. 세척 완충액을 제거하고 세척 단계를 2회 더 반복하여 EGFP 양성 세포로부터 비드 리보솜 RNA 복합체를 얻었다. 비드를 RNA 분리 키트의 추출 버퍼 50마이크로리터와 함께 써모믹서에서 30분 동안 인큐베이션하여 비드에서 RNA를 방출합니다.마그네틱 랙으로 비드를 분리하고 상층액을 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브를 3000g에서 2분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 피펫팅합니다.RNA 정제 컬럼을 사전 컨디셔닝하기 위해, 250 마이크로리터의 컨디셔닝 버퍼를 정제 컬럼 상에 피펫팅하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 컬럼을 16, 000g에서 1 분 동안 원심 분리합니다. 동일한 부피의 70% 에탄올을 세포 추출물에 피펫팅하고 피펫팅하여 잘 혼합합니다.최대 200 마이크로리터의 혼합물을 사전 조절된 RNA 정제 컬럼에 피펫팅합니다. 샘플 손실을 줄이려면 용량의 80 % 이상 열을 채우지 마십시오. 모든 RNA가 각 분획의 동일한 컬럼에 수집될 때까지 이 단계를 여러 번 반복합니다.컬럼을 2분 동안 원심분리하여 컬럼 내의 멤브레인에 RNA를 결합시킨다. 그런 다음 30 초 동안 원심 분리를 계속하십시오. 유동을 버리고 100 마이크로리터의 세척 완충액을 피펫팅하여 컬럼 내로 넣는다.1 분 동안 원심 분리한 다음 흐름을 폐기하십시오. 피펫 75 마이크로리터의 DNA 용액을 정제 컬럼 멤브레인에 직접 혼합합니다. 실온에서 15 분 동안 배양하십시오.이어서, 40 마이크로리터의 세척 완충액 하나를 컬럼 내로 피펫팅하고 또 다른 30초 동안 원심분리한다. 통과 흐름을 폐기합니다. 피펫 100 마이크로리터의 세척 완충액 2개를 컬럼에 넣고 8, 000 g에서 1분 동안 원심분리한다.통과 흐름을 폐기합니다. PET 100 마이크로 리터의 세척 완충액 2 개를 컬럼에 넣고 16, 000 g에서 2 분 동안 원심 분리한다. 유동을 버리고, 동일한 컬럼을 16, 000 g에서 1분 동안 다시 원심분리하여 세척 완충액의 모든 미량을 제거한다.컬럼을 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 피펫 팁이 멤브레인에 닿지 않도록 정제 컬럼의 멤브레인에 직접 12 마이크로 리터의 RNase 자유수를 피펫합니다. 실온에서 1 분 동안 배양하고 1000g에서 1 분 동안 원심 분리합니다.그 후 16, 000 G에서 1분 동안 RNA를 용출시켰다. 추출된 RNA의 품질과 양을 평가하기 위해 바이오분석기를 사용하십시오. RNA를 80도 냉동고에 보관하거나 추가 분석을 위해 보내십시오.유전자 조작 유전자 대립 유전자 인 Gli1-CreERT2와 NuTRAP을 모두 보유한 마우스는 하루에 한 번, 격일로 3 회 주사 할 때 타목시펜을 주사합니다. 수집 된 조직의 면역 형광 분석은 EGFP가 고환의 간질 세포에서 발현되었음을 보여줍니다. EGFP는 또한 NuTRAP 마우스인 Gli1-CreERT2의 부신 캡슐 세포에서 발견되었습니다.소닉 헤지혹-CreERT2에서 NuTRAP 마우스 EGFP 양성 세포 집단은 캡슐 아래 부신의 외부 피질에 상주하여 EGFP 사전 발현 세포의 발현을 확인합니다. 세포 유형 특이적 RNA를 추출한 후, 추출된 RNA를 마이크로어레이 분석을 위해 보냈다. 결과는 음성 분획의 유전자에 비해 약 3000 개의 유전자가 양성 분획에서 풍부 한 반면, 약 4, 000 개의 유전자가 음성 분획에서 풍부하다는 것을 보여 주었다.차등적으로 발현된 유전자 중에서, 라이디히 세포 관련 유전자 Hsd11b1 및 Hsd3b6은 양성 분획에서 풍부하였다. 음성 분획에서, Sertoli 세포 관련 유전자 사막 고슴도치 및 Gstm6이 풍부 해졌다. 음성 분획을 입력과 비교할 때 몇 가지 차등적으로 발현된 유전자만이 확인되었습니다.실시간 정량 RT-PCR을 이용하여 양성 및 음성 분획에서 핵심 유전자의 발현을 확인하였다. 마이크로어레이 분석에서 발견된 것과 유사하게, 스테로이드 생성 효소 3-베타 하이드록시스테로이드 탈수소효소 및 콜레스테롤 측쇄 절단 효소가 양성 분획에서 풍부하게 나타났다. 한편, Sertoli 세포 마커 SRY 박스 전사 인자 9 및 생식 세포 마커 시냅톤 복합체 단백질 3은 음성 분획에서 풍부하게 나타났다.이 프로토콜을 시도할 때 사용하기 전에 DTT, 사이클로헥시미드 재조합 리보뉴클레아제 및 프로테이나제 억제제 칵테일을 균질화 스톡 용액에 추가하는 신선한 균질화 작업 완충액을 준비하는 것이 중요합니다. 사용하기 전에 신선한 저염과 고염 세척 완충액을 준비하는 것도 중요합니다.

isolate-cell-type-specific-rnas-from-snap-frozen-heterogeneous-tissue

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서에서 우리는 쥐를 기본의 연결을 문화와 아르나의 증폭을 사용하여 후속 transcriptome 분석에서 단일 세포의 수확을위한 간단한 방법을 설명합니다. 이러한 접근 방식은 모든 세포 유형에 generalizable있다.

단일 셀 Transcriptome 분석

특정 조직에서 세포의 서브 세트의 유전자 발현 분석가 중대한 과제이다. 이 문서에서는 레이저 캡처 미세 절제와 빠른 immunolabeling 방법을 결합하여 특정 세포 집단에서 고품질의 총 RNA를 분리하는 방법에 대해 설명합니다.

셀 특정 부분 집단에서 RNA 분리 빠른 Immunolabeling과 결합 레이저 캡처 이외에 Microdissection을 사용하여

여기에서는 전사 프로파일링을 위한 특정 식물 세포 유형의 레이저 보조 미미해부에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 종과 세포 유형에 적합하지만, 십자화과 속 Boechera에서 유성 생식 및 종말 생식에 중요한 암컷 생식세포의 접근하기 어려운 세포에 초점을 맞추고 있습니다.

개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)

여기, 선물이 빠르게 다운스트림 대규모 병렬 RNA 시퀀싱 신선 또는 냉동 조직에서 높은-품질 핵을 분리 하는 프로토콜. 우리는 세제-기계 및 소형 기계 조직 장애 및 셀 세포 옵션을 둘 다 핵의 격리에 대 한 사용할 수 있습니다를 포함 합니다.

대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연

이 프로토콜 수동을 정렬 mRNA 증폭 높은 깊이 단일 셀 RNA 시퀀싱 전사 기반 생체 외에서 다음 단일 붙일 레이블된 신경 세포를 분리 하는 절차에 설명 합니다.

단일 셀 RNA 시퀀싱 시퀀싱 (디바-Seq) 절대 수 수동 정렬 및 두 배 전사 생체 외에서 를 사용 하 여 붙일 레이블이 마우스 뉴런의

레이저 포획 미세해부(LCM) 프로토콜은 골세포의 유전자 발현 분석을 위한 고품질 RNA의 충분한 양을 얻기 위해 개발되었다. 현재 연구는 마우스 대퇴골 섹션에 초점을 맞추고. 그러나, 여기에 보고된 LCM 프로토콜은 임의의 경조직의 세포에서 유전자 발현을 연구하는데 사용될 수 있다.

신선 냉동 마우스 뼈에서 고품질 RNA를 생성하는 레이저 캡처 미세 해부 프로토콜

본 간행물은 성숙한 지방세포로부터 핵의 분리, 형광 활성화 선별에 의한 정제, 및 단세포 수준 전사학에 대한 프로토콜을 설명합니다.

단세포 게놈 응용을 위한 지방 조직 핵의 격리

단일 핵 절연은 세포막의 해리 및 세제 기반 과구화에 의존하며 최적화가 필요하며 기술 적 유물을 도입하는 경향이있는 단계입니다. 당사는 전체 조직에서 직접 그대로 핵을 신속하게 분리하기 위한 세제 및 효소 없는 프로토콜을 시연하여 단일 핵 RNA-seq(snRNA-Seq) 또는 ATAC-seq에 적합한 핵을 산출합니다.

세제 및 효소 없는 방법을 사용하여 조직 전체에서 핵 분리

여기에서는 단일 핵 RNA-seq, ATAC-seq 및 관절 다중오믹스(RNA-seq 및 ATAC-seq)에 대해 급속 냉동되고 보관된 간 조직에서 핵을 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

단일 세포 다중오믹스를 위한 급속 동결 간 조직으로부터 핵 분리

여기에서 우리는 세포핵 준비를 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 심장 조직을 단일 세포로 미세 해부 및 효소 해리한 후, 전구 세포를 동결한 다음, 순수 생존 세포를 분리하여 단일 핵 RNA 시퀀싱 및 고처리량 시퀀싱 분석을 통한 전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 단일 핵 분석에 사용했습니다.

단일 세포 분해능에서 후성유전체 및 유전자 발현 프로파일링을 위한 마우스 심장 전구 세포에서 핵 분리

이 연구는 다운스트림 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 위해 냉동 포유류 조직에서 고품질 핵을 분리하는 간단하고 빠르며 부분적으로 자동화된 프로토콜을 설명합니다.

단일 핵 염기서열분석을 위해 냉동 포유류 조직에서 단일 핵을 분리하기 위한 간단하고 빠르며 부분적으로 자동화된 프로토콜

학습하세요 NuTRAP 마우스 모델과 GLP 풀다운을 이용한 세포 유형 특이적 리보솜 결합 RNA 분리 방법입니다. EGFP 발현 세포에서 고품질 RNA를 추출하여 고환의 Leydig 세포와 Sertoli 세포에서 유전자 발현을 연구할 수 있습니다.

세포 분류 없이 스냅 동결 이종 조직 샘플에서 세포 유형 특이적 RNA 분리

더 많은 동영상 탐색