Name: 배아 일 7.5에서 자궁 내 나노 주사 (NEPTUNE)에 의한 뮤린 신경 판 표적화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 배우세요 배아 일 7.5에서 자궁 내 나노 주사(NEPTUNE)를 이용한 뮤스 신경 판 표적화 방법을. 초음파 유도 하에 렌티바이러스를 주사하여 신경계 유전자 조작 및 계통 추적 모델을 신속하게 생성할 수 있습니다.

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우리는 쥐의 전문적인 보살핌에 대해 Bettina Semsch와 Jia Sun (Infinigene)에게 감사드립니다. Biomedicum Imaging Core (BIC)의 Florian Salomons와 Göran Månsson은 이미지 획득 및 상담에 대한 지원을 제공합니다. 기금 : 스웨덴 연구위원회, 카롤린스카 연구소 (KI 재단, 경력 개발 보조금, 박사 과정 학생 KID 기금 및 SFO StratNeuro 기금, 혁신 의학 센터), 올리와 엘로프 에릭슨 재단, 토른 스피란 재단, Jeansssons 재단, Sven and Ebba-Christina Hagbergs 상 및 연구 보조금, Knut and Alice Wallenberg Project Grant, Fredrik and Ingrid Thurings Foundation, Lars Hiertas Minne, The Childhood Cancer Foundation (Barncancerfonden), The Åhlen Foundation, Åke Wibergs Foundation, Tore Nilssons Foundation 및 Swedish Foundations Start Grant to ERA에 대한 보조금. 그림 4D, E 는 BioRender.com 로 작성되었습니다.

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<li>Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+brain-directed+AAV+gene+therapy+results+in+rapid%2C+robust%2C+and+persistent+transduction+of+mouse+choroid+plexus+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia.</a> Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101(2013).</li>
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<li>Portales-Casamar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+toolbox+of+MiniPromoters+to+drive+selective+expression+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).</li>
<li>Tervo, D. G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li>
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</ol>

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

이 프로토콜에는 배아 생존, 주사의 질 및 판독에 영향을 미치는 몇 가지 단계가 있습니다. 배아의 재태 연령은 하룻밤 짝짓기 후 질 플러그 당일 정오에 E0.5로 정의됩니다. 늦은 오후 / 저녁에 E6.5에서 임신에 대한 초음파 검사를 수행하면 배아가 초음파로 식별 할 수있을만큼 충분히 발달됩니다. 이 검사는 (1) 얼마나 많은 플러그 양성 마우스가 실제로 임신했는지에 대한 사전 스크리닝을 허용하고, (2) 플러그 양성 마우스가 임신하지 않은 경우 바이러스가 불필요하게 해동되고 낭비되지 않도록하며, (3) 마우스에 대한 불필요한 개입을 줄입니다 (임신하지 않은 여성에 대한 수술을 피하십시오).
E7.5에서 배아는 외부 힘에 민감하므로 주의해서 다루어야 합니다. 예를 들어, 자궁 뿔을 당기거나 낙엽을 짜내면 배아 흡수가 발생할 수 있습니다. 자궁 조직은 조직이 건조되는 것을 방지하기 위해 여성 복부 외부에 있을 때 항상 촉촉하게 유지되어야 합니다. 대부분의 낙엽은 여성 복부 내부에 남아 있어야하며 주사를 위해 3-4 개만 노출됩니다. 바늘 선명도는 성공적인 주사를 위한 또 다른 중요한 결정 요인입니다. 뭉툭하거나 부러진 바늘 끝은 AC에 들어가기 전에 모델링 점토에 대해 낙엽을 반복적으로 찌르거나 압축하여 흡수율을 높일 수 있습니다. 따라서 잘 연마되고 날카로운 바늘은 항상 안전하게 보관해야하며 최대 2 명의 암컷 후에 교체해야합니다.
이 프로토콜은 렌티바이러스를 한 번 주사하여 신경판을 표적으로 삼는 방법을 설명합니다. 또한, 형질 도입 효능이 단일 세포 클론에서 전체 뇌로 어떻게 적응 될 수 있는지 보여줍니다. 그러나 피부와 구강 상피를 포함한 다른 비신경 조직도 표적화됩니다. 또한 모든 세포 유형(전구세포 및 분화된 세포)이 형질도입되어 이 접근 방식이 효율적이지만 비특이적입니다. 바이러스 구축물에서 MiniPromoters의 사용은 뉴런 또는 성상 세포15에서 전이 유전자의 특이적 발현을 유도한다. 이는 전용 Cre 형질전환 동물의 사용을 피할 수 있는 장점이 있으며, 따라서 노동량(균주 유지 및 유전형 분석)과 비용을 절감할 수 있다.
NEPTUNE의 한계에는 기술적 어려움, 예측 가능하고 일관된 속도로 임산부를 확보하는 데 따른 어려움, 특수 기기를 구입하는 비용이 포함됩니다. 또한, 렌티바이러스에 의한 세포의 비선택적 표적화는 이 기술의 이점이자 한계로 볼 수 있습니다. AC에 더 많은 부피를 주입하면 뇌전증13이 발생하지만, 여기에 설명된 부피로 뇌 기형과 뇌증은 피할 수 있습니다15. 따라서 뇌 발달에 부정적인 영향을 미치는 것은 배아 단계와 AC 크기에 맞는 정확한 양을 주입하여 조심스럽게 피해야하는 자궁 내 나노 주사의 위험입니다.
이 기술의 향후 적응은 바이러스 성 향성에 초점을 맞출 수 있습니다. 아데노 관련 바이러스(AAV)는 서로 다른 혈청형을 가지고 있으며, 이는 CNS17,26에서 다양한 세포 유형을 강력하게 표적으로 하는 것으로 나타났습니다. 그러나 AAV는 숙주 세포 게놈에 통합되지 않으므로 분열률이 높은 세포에서 손실 될 수 있습니다. NEPTUNE의 특이성을 높이는 방법에는 여러 가지가 있지만 형질전환 동물은 생체 내 유전자 조작과 관련하여 여전히 황금 표준입니다. Cas9 마우스 및 sgRNA-코딩 렌티바이러스는 배아 표피(27)에서 유전자 스크리닝을 위해 사용되었으며, 또한 발달 중인 CNS에 적응될 수 있다.
E7.5에서 AC로의 주사는 신경 형성을 시작하기 전에 신경 외배엽의 세포를 효율적으로 표적화하고 자궁 전기 천공보다 발달중인 뇌를 더 효율적으로 표적으로 삼습니다. 이를 통해 초기 시점부터 뇌 발달에 중요한 유전 적 단서를 연구 할 수 있습니다. 기존의 유전자 마우스 모델과 달리 NEPTUNE은 기능적 유전자 분석을 수행하기 위한 유연한 접근 방식을 제공합니다. 과발현 또는 유전자 결실에 따른 표현형은 수개월 또는 수년에 비해 며칠에서 몇 주 내에 연구할 수 있습니다. 여러 바이러스 구조의 주입은 하나의 배아 내에서 여러 유전자의 조작을 허용하고 이중 또는 삼중 녹아웃 동물의 생성을 방지합니다. 따라서 NEPTUNE은 시간을 절약할 뿐만 아니라 연구에 사용되는 동물의 수를 줄일 수 있습니다.

뇌와 척수는 배아 발생 1,2 동안 형성을 시작하는 최초의 기관 중 하나입니다. 신경 발달 장애와 관련된 유전자가 확인되고 있지만 유전 적 변이의 기능적 심문은 3,4에 뒤쳐져 있습니다. 조건부 녹아웃 마우스의 생성에는 몇 달 또는 몇 년이 걸릴 수 있으므로 발달중인 뇌에서 유전자 기능을 신속하게 조사하는 대체 기술이 중요합니다. 마우스 배아에서 신경판이 신경관으로 변형되어 중추 신경계 (CNS)를 생성하는 형태 형성 과정 인 신경 형성은 임신 후 8 일에서 10 일 사이에 발생합니다5. 신경화가 시작되기 전에 외배엽의 일부인 신경판은 CNS 6,7 내에서 수많은 신경 세포 및 신경교 세포 유형으로 증식하고 분화하는 단일 층의 원주 형 세포로 구성됩니다. 따라서 CNS에서 유전자 발현에 대한 오래 지속되는 변화를 실험적으로 유도하기 위해 신경판을 표적으로 하는 것은 모든 전구 세포의 접근성을 포함하여 명백한 이점을 제공합니다.
신경 과학에서, ovo 전기 천공 8,9 및 마우스 배아의 바이러스 형질 도입은 배아 CNS 유전자 발현을 조작하는 데 사용되었습니다. 발달중인 병아리 배아는 난자에서 병아리 배아의 접근성과 결과적으로 유전자 발현 조작의 용이성으로 인해 척수 발달 중 유전자 기능을 연구하기 위해 선택되는 모델이었습니다. 특히, ovo 플라스미드에서 전기천공은 각 병아리 척수에서 실험 및 제어 조건을 생성합니다. 전기 천공은 세포막 투과를 일으키고 두 개의 전극을 통해 배아에 전기 펄스를 적용하여 음전하를 띤 DNA를 (음성) 음극에서 (양성) 양극으로 향하게합니다. 마우스에서 자궁 내 전기 천공은 일반적으로 신경 화가 완료된 배아 단계로 제한되었으며 뇌 또는 척수는 이미 여러 세포층으로 구성되어있어 전기 천공 효율이 낮습니다10. 플라스미드 전기천공은 일시적인 유전자 발현을 초래하며 일반적으로 소수의 세포를 표적으로 합니다.
초음파 유도 자궁 미세 주사는 피부 및 뇌11,12,13,14와 같은 다양한 배아 구조를 조작하는 데 사용되었습니다. 그러나, 발달 중인 쥐 CNS를 표적으로 하는 주사는 낮은 효능을 나타내거나 배아 생존에 부정적인 영향을 미쳤다12,13,14. 따라서, E7.5에서 양수 (AC)로 고 역가 렌티 바이러스를 전달하기위한 개선 된 프로토콜이 개발되었으며, 이는 자궁 내ano-injection15와 함께 neural plate targeting에 대한 NEPTUNE이라고 불렸다. 주사는 E13.5에서 전체 뇌의 >95 %의 오래 지속되는 표적 효능을 가져 왔습니다. 또한, 임신 초음파 검증 시 병기 결정 단계를 도입하여 암컷과 임신을 발달 단계별로 분류하여 연구 동물에 대한 불필요한 시술을 최소화하고 주사 성공률을 극대화했습니다. 주입 효율과 생존은 AC 크기의 증가와 밀접한 관련이 있습니다. 따라서, 본 논문은 배아의 재흡수를 유발하지 않는 AC에 적절한 부피를 전달하기 위해 주사 전에 AC 크기를 측정하는 방법을 설명한다. NEPTUNE은 현재 자궁 내 접근 방식에 대한 강력한 대안이며 기능 연구의 획득 및 손실, 계통 추적 또는 스크리닝15,16을 포함하되 이에 국한되지 않는 여러 용도에 맞게 조정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1 mL 주사기</td><td>BD Bioscience</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>27 G 바늘</td><td>BD Bioscience</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>3.5 인치 모세관</td><td>Drummond Scientific</td><td>3000203G/X</td><td>집 바늘을 당기는 데 사용 70</td></tr><tr><td>MHz MS 시리즈 변환기</td><td>Visual Sonics</td><td>MS700</td><td></td></tr><tr><td>Aquasonic 투명 초음파 젤</td><td>Parker Laboratories</td><td>Mar-50</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip Applier 9 mm</td><td>Angthos</td><td>12020-09</td><td></td></tr><tr><td>CD1 마우스</td><td>Charles River, Germany</td><td>Crl:CD1(ICR)</td><td>암컷: 생후 8주령부터 수컷: 생후 12주령부터</td></tr><tr><td>면봉</td><td>OneMed Sverige AB</td><td>120788</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>드레싱 집게 섬세한 스트레이트 13cm</td><td>Agnthos</td><td>08-032-130</td><td></td></tr><tr><td>EG-400 Narishige 마이크로 피펫 그라인더</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>EZ 클립 9mm</td><td>Angthos</td><td>59027</td><td>클립</td></tr><tr><td>아이리스 가위, 슈퍼 컷, 스트레이트, 9cm</td><td>Agnthos</td><td>307-336-090</td><td></td></tr><tr><td>이소 플루오란</td><td>Baxter Medical AB</td><td>EAN : 50085412586613</td><td>스웨덴 약국</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clarke</td>에서 구입<td>7557</td><td></td></tr><tr><td>멤브레인 테이프</td><td>비주얼 소닉</td><td>SA-11053</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>모델링 클레이</td><td>센스 AB</td><td>10209</td><td></td></tr><tr><td>마우스 핸들링 테이블</td><td>비주얼 소닉</td><td>50249</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II 자동 인젝터 키트</td><td>드러먼드</td><td>3-000-205A</td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>Bemis</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>중앙 개구부가 있는 페트리 접시 (낮은 벽)</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11620</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, (&Oslash; xH): 92 x 16 mm</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>Rely+On Virkon</td><td>DuPont</td><td>130000132037</td><td>소독제</td></tr><tr><td>실리콘 멤브레인</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11054</td><td></td></tr><tr><td>Steri 250, 핫 비드 살균기</td><td>Angthos</td><td>31100</td><td></td></tr><tr><td>수술 테이프(1.25cm x 9.14m)</td><td>Medicarrier</td><td>67034</td><td></td></tr><tr><td>Vevo Compact Dual(Med. Air & O2) 마취 시스템</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-12055</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 이미징 스테이션 2</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-11983</td><td></td></tr><tr><td>Vevo2100</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-20047</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 6-0; C-3 바늘, 45cm 보라색 필라멘트</td><td>Agnthos</td><td>J384H</td><td></td></tr></tbody></table>

배아 일 7.5에서 자궁 내 나노 주사 (neptune)에 의한 뮤린 신경 판 표적화

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

자궁에서 발달중인 마우스 뇌 에서 유전자 발현을 조작하는 것은 기능적 유전학 연구에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 이전에는 신경화 후 배아 단계의 조작으로 크게 제한되었습니다. 배아 일 (E) 7.5에 양수를 주입하고 cDNA 또는 shRNA를 암호화하는 렌티 바이러스를 전달하여 신경판과 신경 볏 세포의 >95 %를 표적으로 삼아 미래의 뇌, 척수 및 말초 신경계에 기여하는 프로토콜이 개발되었습니다. 이 프로토콜은 유리 모세관 바늘의 연삭, 임신 확인, 초음파 영상을 사용한 발달 병기 결정 및 배아 단계에 맞는 최적의 주입량을 포함하여 성공적인 형질 도입을 달성하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 
이 프로토콜에 따라 고역가 렌티바이러스로 발달 중인 뇌의 >95%를 형질도입하여 전체 뇌 유전자 조작을 수행할 수 있습니다. 대조적으로, 더 낮은 바이러스 역가를 사용하여 모자이크 형질도입을 달성할 수 있어 유전자 스크리닝 또는 계통 추적이 가능합니다. E7.5에서의 주사는 또한 눈, 혀 및 말초 신경계의 뚜렷한 구획에 기여하는 외배엽과 신경 볏을 표적으로 합니다. 따라서 이 기술은 신경전 단계에서 마우스 신경판 및 외배엽 유래 조직에서 유전자 발현을 조작할 수 있는 가능성을 제공하여 실험에 사용되는 마우스의 수를 줄이는 이점이 있습니다.

hPGK-H2B-GFP 렌티바이러스11,12와 함께 E7.5에 주입된 배아를 E13.5에서 수집하고 형광 해부 현미경으로 검사했습니다(그림 5A). 신경판의 성공적인 형질도입은 주로 뇌 및 다른 외배엽 유래 조직, 예를 들어 피부에서 형광 리포터의 강한 발현을 갖는 배아를 초래합니다(그림 5A,B). 지나치게 높은 부피(예: ≥500nL)를 주입하면 AC의 압력이 증가하고 완전한 재흡수(데이터는 표시되지 않음) 또는 뇌증과 같은 신경관 결함이 발생할 수 있습니다(그림 5A). E7.5에서 성공적인 주사는 전뇌에서 후뇌로 균일하게 전달됩니다 (그림 5C-J).
2 × 1010 감염 단위 (IFU) 주변의 렌티 바이러스 역가는 95 % 이상의 표적화를 달성하는 반면, ~ 1 × 109 IFU의 역가는 15 % 표적 효율15를 달성합니다. 또한 맥락막신경총 17,18과 같이 이전에 전기 천공을 사용하여 타겟팅하기 어려웠던 구조도 타겟팅됩니다 (그림 5 E, F). 형질도입 효능은 AC로 전달되는 바이러스 역가를 조정함으로써 변형될 수 있다. 낮은 역가의 주사는 단일 세포 클론의 형질도입을 초래하는 반면(그림 5C, 그림 5E 및 그림 5G,H) 고역가 바이러스의 사용은 전체 뇌의 거의 100%를 형질도입합니다(그림 5D, 그림 5F, 그림 5H 및 그림 5J ). 따라서 NEPTUNE은 클론 형질도입, 계통 추적 및 유전자 스크리닝 접근 방식 또는 전체 뇌에서 유전자 과발현 또는 하향조절의 글로벌 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
포유류의 눈 발달은 배아 외배엽의 세 가지 유도체 사이의 잘 조직 된 통신의 결과입니다 : 신경 망막 (NR)과 망막 색소 상피 (RPE)는 복부 전뇌의 신경 상피에서 파생되는 반면, 표면 외배엽은 미래의 수정체와 각막 상피를 생성합니다. 그러나, 각막의 다른 두 층인 중앙 간질과 후방 내피는 안구 주위 중간 엽19,20의 신경 볏 세포에서 파생된다. E7.5에 고 역가 렌티 바이러스로 주입 된 E13.5 배아를 통한 관상 동맥 절편은 뇌와 유사하게 눈의 신경 조직뿐만 아니라 렌즈, 각막 및 중간 엽의 높고 균일 한 형질 도입을 보여주었습니다 (그림 5K). 신경화가 진행됨에 따라 E8.5 및 E9.5에서의 주사는 수정체와 각막 상피의 지속적인 표적화를 초래하는 반면(그림 5L 및 그림 5N), 눈의 신경외배엽 유래 조직의 형질도입은 E8.5(그림 5L,M)에서 덜 효율적이거나 E9.5(그림 5N)에서 표적화되지 않습니다.
대부분의 바이러스 입자는 주사시 노출 된 조직을 감염시키는 반면, 일부 입자는 나중에 발생하는 비 외배엽 유래 조직을 형질 도입합니다 (그림 6A). 타액선과 덕트는 구강 상피21 에서 E11.5 주변에서 발생하며 해왕성을 표적으로 합니다(그림 6B). E9.5에서 주사 한 후, 혀의 설측 상피가 잘 변형됩니다. 그러나, 하부 중간엽은 음성이다 (도 6C; 괄호는 형질도입된 세포를 나타내고, 별표는 형질도입되지 않은 세포를 나타냄). 또한 설측 상피 내에 양성 클러스터가 있으며 음수 부분 (그림 6C, 흰색 화살촉)으로 구분되어 유두 표면의 전달을 시사합니다. 신경 볏 세포는 밑에있는 혀 중간 엽과 설측 상피 내에서 기술되었으며, 여기서 그들은 미각 유두와 미뢰22의 발달에 관여합니다. 실제로, E7.5에서의 주사는 E13.5에서 혀 중간엽의 광범위한 형질도입을 초래하며(그림 6D), 이는 조기 주사가 신경 볏 세포를 표적으로 하여 혀의 중간엽에 기여한다는 것을 시사합니다.
척추동물에서, 등쪽 근신경절(DRGs)은 말초신경계(PNS)의 중심 성분이며, 이는 신체의 말초로부터의 모든 체성 감각 입력(온도, 통증, 압력)이 DRG 뉴런(23)의 활성화를 통해 뇌로 전달되기 때문이다. DRG의 뉴런과 신경교 세포 모두는 몸통 신경 볏 세포24로부터 유래된다. 유비쿼터스 hPGK 프로모터가 형광 리포터의 발현을 조절하는 렌티바이러스 주사는 DRG(그림 7C)뿐만 아니라 척수(그림 7B)의 뉴런과 전구세포를 모두 형질도입하여 중추 및 말초 신경계(그림 7A)의 광범위한 표적화를 유도합니다. 더블코르틴25에 미니프로모터를 사용하면 GFP 발현을 뉴런으로만 제한할 수 있습니다(15 및 그림 7D,E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3.jpg"> 그림 5: NEPTUNE을 사용한 고효율 또는 클론 형질도입. (A) 표준 조명으로 조명된 해부 현미경 아래의 E13.5 배아(왼쪽 패널) 및 GFP용으로 조명된 동일한 배아(오른쪽 패널). 맨 왼쪽에 주입되지 않은 배아, 맨 오른쪽에 성공적으로 주입 된 배아, 뇌에서 긍정적 인 신호를 생성합니다 (가장 오른쪽 배아). 과도한 부피 주입으로 인한 뇌파 배아 (중간 배아). (B) E7.5 주사를 통한 피부 및 뇌 표적화. 스케일 바 = 50 μm. (C, D) E13.5 낮은 클론 변환 (C) 또는 고효율 변환 (D)을 가진 전뇌의 컨포칼 이미지. (C, E, G, I) 뇌의 다른 영역의 클론 형질 도입. (D, F, H, J) 뇌의 다른 영역의 고효율 형질 도입. 스케일 바 = 200 μm. 다른 형질 도입 효율은 CNS의 다른 영역을 대표합니다. (E, F) 맥락막 신경총 표적화, 클론 (E) 또는 고효율 (F). 스케일 바 = 200 μm. (G, H) 클론 타겟팅 (G) 및 고효율 (H) 후뇌 타겟팅, (I, J)에서 확대. 스케일 바 = 200 μm. (K) E7.5에서 자궁 내 주사 후 E13.5에서 눈에서의 GFP 리포터 발현 (L, M) E8.5에서 자궁 주사 후 E15.5에서 눈에서의 GFP 리포터 발현 (L), (M) 또는 E9.5 (N)에서 확대 된 박스 영역. 자가 형광 혈관에는 흰색 별이 표시되어 있습니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어 : 해왕성 = neural plate tartgeting with uteronano-injection; C = 각막; LE = 렌즈 상피; LF = 렌즈 섬유; M = 중간엽; NR = 신경 망막; ON = 시신경; RPE = 망막 색소 상피; GFP = 녹색 형광 단백질; CNS = 중추 신경계. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig06.jpg"> 그림 6 : 비 신경 조직의 자궁 내 형질 도입. (A) E15.5 구강의 공초점 이미지. 배아에 형광 리포터 렌티바이러스를 E9.5에 주입하였다. 스케일 바 = 200 μm. (B, C) (B) 삽입 패널의 배율; 타액관 상피가 바이러스로 형질 도입되었습니다. (C) 삽입 패널의 확대; GFP 리포터 바이러스(흰색 브래킷)로 형질도입된 등쪽 설측 상피. 신경 볏 세포에서 파생 된 기본 중간 엽은 음성입니다. 흰색 화살촉은 바이러스 형질도입된 상피 세포로 둘러싸인 음성 신경 볏 세포가 있는 용의자를 나타냅니다(자가 형광 혈액 세포/혈관은 흰색 별표로 표시됨). 스케일 바 = 50 μm. (D) E7.5에서 형광 리포터 바이러스를 주사 한 후 E13.5 혀 중간 엽의 개략도 및 공초점 이미지. 스케일 바 = 50 μm. 약어 : D = 등쪽; M = 중간엽; N = 비 인두; SLD = 설하 덕트; SMD = 턱밑 덕트; T = 혀; V = 복부; GFP = 녹색 형광 단백질. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig07.jpg"> 그림 7: 신경 볏 유래 등근 신경절 세포의 형질도입. (A) E7.5에서의 넵튠 표적화는 CNS 및 PNS 모두의 표적화를 허용한다. (B) E7.5에서 hPGK-H2B-GFP 리포터 렌티바이러스를 주입한 E13.5 척수 및 DRG의 컨포칼 이미지는 SOX2+ 신경 전구 세포와 NeuN+ 뉴런 모두의 형질도입을 보여줍니다. 스케일 바 = 100 μm. (C) SOX2+(흰색 화살표) 및 NeuN+(흰색 화살촉) 세포 집단에서 GFP 발현을 갖는 DRG를 보여주는 B의 박스형 영역. 스케일 바 = 20 μm. (D) DCX+ 세포만을 표적으로 하는 E7.5에서 DCX-H2B-GFP 렌티바이러스를 주입한 E13.5 척수 및 DRG의 공초점 이미지. 스케일 바 = 100 μm. (E) GFP 발현이 DCX+ 뉴런(흰색 화살촉)으로 제한된 DRG를 보여주는 D의 박스형 영역. DCX-세포는 GFP(흰색 화살표)에 대해 음성이다. 스케일 바 = 20 μm. 약어 : 해왕성 = neural plate tartgeting with utero nano-injection; CNS = 중추 신경계; PNS = 말초 신경계; DRGs = 등근 신경절; GFP = 녹색 형광 단백질. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜에서는 E7.5의 마우스 양수에 렌티 바이러스를 주입하여 생존 또는 배아 발달에 미치는 해로운 영향을 최소화하면서 전체 신경판을 균일하게 형질 도입하는 방법을 설명합니다.

배아 일 7.5에서 자궁 내 나노 주사 (NEPTUNE)에 의한 뮤린 신경 판 표적화

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

NEPTUNE은 배아 7.5일부터 마우스 배아 신경계의 표적화 및 유전자 조작을 허용하고 며칠 만에 녹다운 또는 계통 추적 모델을 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 적응 가능하고 유연하며 빠릅니다. shRNA, cdRNA 또는 바코드 바이러스 라이브러리를 제공하여 몇 달 또는 몇 년이 아닌 며칠 만에 다양한 질문을 해결할 수 있습니다.우리는 NEPTUNE이 신경 과학에 대한 통찰력을 제공 할 것으로 기대하지만 다른 장기 시스템에도 적용될 수 있습니다. 양수를 식별하는 것은 매우 어려울 수 있으므로 시간을내어 초음파 이미지를보고 교과서 또는 기타 해부학 자료를 준비하십시오. 바늘 로딩을 시작하려면 유리 바늘을 금속 플런저에 밀어 넣고 콜렛을 부착 한 상태로 유지하되 약간 느슨하게합니다.그런 다음 금속 플런저와 함께 모세관 바늘이 스페이서에 도달할 때까지 전면 개스킷을 통해 밀어 넣습니다. Empty를 눌러 플런저를 바늘에 밀어 넣고 바늘 끝에서 오일을 배출합니다. 그런 다음 채우기를 눌러 기포를 만들고 오일과 용액을 나눕니다.마지막으로 바늘을 내리고 팁을 용액에 담그고 Fill을 다시 눌러 바늘을 넣습니다. 마취 된 암컷 마우스를 가열 테이블에 이상적인 크기의 양수로 고정 한 후 양쪽 눈에 아이 젤을 바르고 각막 건조를 방지하고 진통제를 피하 주사합니다. 그런 다음 밀리리터 당 0.5 밀리그램의 클로르헥시딘 용액으로 적신 천으로 닦아 하복부를 소독하고 피부를 말리십시오.다음으로 수술 용 가위를 사용하여 하복부에 1.5-2cm의 수직 정중선 피부 절개를합니다. 그런 다음 피부를 부드럽게 들어 올려 절개 지점 주변의 약 1cm 밑에있는 근육층에서 제거하여 수술 후 봉합을 용이하게합니다. 다음으로, 근육층에 1 센티미터의 수직 정중선 절개를하십시오.한 쌍의 집게를 사용하여 피부와 근육층의 한쪽을 들어 올리고 다른 쌍으로 자궁 뿔을 찾으십시오. 그런 다음 집게를 사용하여 배아 사이의 조직을 잡고 복부에서 두 자궁 뿔을 조심스럽게 빼냅니다. 난소에서 자궁 경부까지 또는 자궁 경부에서 난소까지 양쪽의 배아를 세고 번호를 매기십시오.그런 다음 축축한 면봉으로 주입 할 처음 3 개를 제외한 모든 배아를 복강 내로 부드럽게 밀어 넣습니다. 그런 다음 시중에서 판매되는 변형 된 페트리 접시의 둥근 중앙 개구부에 붙인 탄성 막에 PBS 한 방울을 놓고 배아 바로 위에 놓습니다. 닫힌 집게를 탄성 절개 부위에 삽입 한 다음 집게를 풀어 탄성 절개를 열고 액체를 배아에 떨어 뜨립니다.집게를 사용하여 탄성을 통해 3 개의 배아에 해당하는 자궁 부분을 당기고 마우스 복부에 페트리 접시를 부드럽게 앉 힙니다. 4 개의 점토 발을 사용하여 페트리 접시를 복부 위에 고정하고 고정하여 마우스에 가해지는 압력을 줄이고 마우스의 호흡 및 심장 박동에 대한 이미징 감도를 줄입니다. 다음으로 집게와 젖은 면봉을 사용하여 자궁과 탄성을 조정하여 탄성이 마우스 피부 주위에 밀봉되어 PBS 누출을 방지하도록 합니다.다음으로, 자궁을 고정하려면 모델링 점토 실린더를 배아 또는 자궁의 오른쪽으로 누르고 배아와 자궁이 PBS로 완전히 덮일 때까지 페트리 접시에 PBS를 추가합니다. 주사 기록을 용이하게하려면 초음파 프로브를 PBS에 담그고 첫 번째 배아가 초음파 프로브와 정렬되도록 마우스 또는 수술 테이블을 조정합니다. 세 개의 배아를 모두 스캔하고 양수를 검사하십시오.그런 다음 초음파 기계를 사용하여 양강의 직경을 측정하여 적절한 주입량을 결정합니다. 주입 컨트롤러를 사용하여 결정된 주입량과 주입 속도를 초당 23나노리터의 주입 속도로 느리게 설정합니다. 레일 시스템의 메인 휠을 사용하여 바늘을 PBS로 내린 후 액체가 바늘 끝에 도달할 때까지 나노 주입기 컨트롤러에서 Empty를 누릅니다.그런 다음 PBS에서 바늘을 들어 올리고 주입을 눌러 대략적인 원하는 부피의 방울이 배출되는지 확인합니다. 바늘을 다시 PBS로 내리고 마이크로 매니퓰레이터의 Y면 휠로 나노 주입기를 움직여 바늘을 초음파 프로브 및 배아에 맞춥니다. 주입 각도 휠로 바늘 각도를 조정하여 자궁벽에 대해 거의 수직에 가까운 주입 각도를 보장합니다.그런 다음 마이크로 매니퓰레이터의 주입 휠을 사용하여 바늘을 양수에 한 번에 삽입합니다. 바늘 끝이 초음파 이미지에서 사라지면 프로브를 앞뒤로 움직여 바늘의 초점을 다시 맞춥니다. 그런 다음 Inject를 적절한 횟수만큼 눌러 원하는 볼륨을 주입합니다.필요한 양을 주입 한 후 5-10 초 동안 기다렸다가 한 번의 부드러운 움직임으로 바늘을 집어 넣습니다. 무대를 다음 배아로 옮기고 시연된 대로 다른 두 배아에 대해 주사를 반복합니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 초음파 프로브와 바늘을 PBS에서 들어 올려 바늘을 작업자에게서 멀어지게 하여 손상과 부상을 방지합니다.집게를 사용하여 첫 번째와 두 번째 배아를 탄성을 통해 부드럽게 밀어 넣어 복부에 다시 놓습니다. 그런 다음 세 번째 배아에 인접한 조직을 부드럽게 잡고 자궁을 탄성 절개의 상단으로 당깁니다. 집게로 네 번째에서 여섯 번째 배아를 부드럽게 당기고 세 번째 배아가 복부에 다시 들어갈 수 있도록합니다.최적의 양수를 가진 모든 배아를 주입 한 후 배아와 자궁을 마우스의 복부로 부드럽게 밀어 넣습니다. 신경판의 성공적인 형질도입은 뇌 및 피부와 같은 다른 외배엽 유래 조직에서 형광 리포터의 강한 발현을 갖는 배아를 초래합니다. 과도하게 많은 양을 주입하면 뇌증과 같은 신경관 결함이 발생할 수 있습니다.배아 7.5 일에 성공적인 주사는 맥락막 신경총을 포함하여 전뇌에서 뒷뇌로 균일 한 전달을 초래합니다. 낮은 역가의 주사는 단일 세포 클론의 형질 도입을 초래하는 반면, 높은 역가 바이러스는 전체 뇌의 거의 100 %를 형질 도입합니다. 배아 13.5일째 배아를 통한 관상동맥 절편은 눈, 수정체, 각막 및 중간엽의 신경 조직의 높고 균일한 형질도입을 보였다.배아 9.5 일에 주사 한 후, 타액선과 덕트는 구강 상피에서 배아 11.5 일경에 발생합니다. 혀의 설측 상피는 잘 변형되는 반면, 밑에있는 중간 엽은 음성입니다. 또한, 설측 상피 내의 양성 클러스터는 음의 섹션으로 분리되어 유두 표면의 형질 도입을 암시합니다.배아 7.5 일에 주사하면 배아 13.5 일에 혀 중간 엽이 광범위하게 형질 도입되어 조기 주사가 신경 볏 세포를 표적으로 삼아 혀의 중간 엽에 기여한다는 것을 시사합니다. 렌티 바이러스 주사는 또한 중추 신경계와 말초 신경계의 광범위한 표적화로 이어져 척수의 뉴런과 전구 세포뿐만 아니라 등근 신경절을 형질전환합니다. 좋은 준비가 필수적입니다.누출이없고 배아가 잘 고정되어 있는지 확인하여 쥐구멍에 주사하는 데 전적으로 집중할 수 있습니다. NEPTUNE 후 뇌의 면역 형광 분석, 단일 세포 RNA 시퀀싱 또는 행동 분석을 위해 주입 된 배아를 태어날 수 있도록하는 것과 같은 다양한 방법으로 분석을 수행 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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출처: Mangold, K., H el. al., 배아기 7.5일에 자궁 내 나노 주사(NEPTUNE)에 의한 쥐 신경판 표적화. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 배아 마우스 모델에서 신경판 표적화를 위한 자궁 내 나노 주입 방법을 보여줍니다. 고역가 렌티바이러스 용액을 양강에 주입하여 신경판 세포에 통합하여 신경발달 연구 및 치료 응용을 위한 안정적인 유전자 조작을 가능하게 합니다.

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