배아 일 7.5에서 자궁 내 나노 주사 (NEPTUNE)에 의한 뮤린 신경 판 표적화
February 14th, 2022
이 프로토콜에서는 E7.5의 마우스 양수에 렌티 바이러스를 주입하여 생존 또는 배아 발달에 미치는 해로운 영향을 최소화하면서 전체 신경판을 균일하게 형질 도입하는 방법을 설명합니다.
NEPTUNE은 배아 7.5일부터 마우스 배아 신경계의 표적화 및 유전자 조작을 허용하고 며칠 만에 녹다운 또는 계통 추적 모델을 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 적응 가능하고 유연하며 빠릅니다. shRNA, cdRNA 또는 바코드 바이러스 라이브러리를 제공하여 몇 달 또는 몇 년이 아닌 며칠 만에 다양한 질문을 해결할 수 있습니다.
우리는 NEPTUNE이 신경 과학에 대한 통찰력을 제공 할 것으로 기대하지만 다른 장기 시스템에도 적용될 수 있습니다. 양수를 식별하는 것은 매우 어려울 수 있으므로 시간을내어 초음파 이미지를보고 교과서 또는 기타 해부학 자료를 준비하십시오. 바늘 로딩을 시작하려면 유리 바늘을 금속 플런저에 밀어 넣고 콜렛을 부착 한 상태로 유지하되 약간 느슨하게합니다.
그런 다음 금속 플런저와 함께 모세관 바늘이 스페이서에 도달할 때까지 전면 개스킷을 통해 밀어 넣습니다. Empty를 눌러 플런저를 바늘에 밀어 넣고 바늘 끝에서 오일을 배출합니다. 그런 다음 채우기를 눌러 기포를 만들고 오일과 용액을 나눕니다.
마지막으로 바늘을 내리고 팁을 용액에 담그고 Fill을 다시 눌러 바늘을 넣습니다. 마취 된 암컷 마우스를 가열 테이블에 이상적인 크기의 양수로 고정 한 후 양쪽 눈에 아이 젤을 바르고 각막 건조를 방지하고 진통제를 피하 주사합니다. 그런 다음 밀리리터 당 0.5 밀리그램의 클로르헥시딘 용액으로 적신 천으로 닦아 하복부를 소독하고 피부를 말리십시오.
다음으로 수술 용 가위를 사용하여 하복부에 1.5-2cm의 수직 정중선 피부 절개를합니다. 그런 다음 피부를 부드럽게 들어 올려 절개 지점 주변의 약 1cm 밑에있는 근육층에서 제거하여 수술 후 봉합을 용이하게합니다. 다음으로, 근육층에 1 센티미터의 수직 정중선 절개를하십시오.
한 쌍의 집게를 사용하여 피부와 근육층의 한쪽을 들어 올리고 다른 쌍으로 자궁 뿔을 찾으십시오. 그런 다음 집게를 사용하여 배아 사이의 조직을 잡고 복부에서 두 자궁 뿔을 조심스럽게 빼냅니다. 난소에서 자궁 경부까지 또는 자궁 경부에서 난소까지 양쪽의 배아를 세고 번호를 매기십시오.
그런 다음 축축한 면봉으로 주입 할 처음 3 개를 제외한 모든 배아를 복강 내로 부드럽게 밀어 넣습니다. 그런 다음 시중에서 판매되는 변형 된 페트리 접시의 둥근 중앙 개구부에 붙인 탄성 막에 PBS 한 방울을 놓고 배아 바로 위에 놓습니다. 닫힌 집게를 탄성 절개 부위에 삽입 한 다음 집게를 풀어 탄성 절개를 열고 액체를 배아에 떨어 뜨립니다.
집게를 사용하여 탄성을 통해 3 개의 배아에 해당하는 자궁 부분을 당기고 마우스 복부에 페트리 접시를 부드럽게 앉 힙니다. 4 개의 점토 발을 사용하여 페트리 접시를 복부 위에 고정하고 고정하여 마우스에 가해지는 압력을 줄이고 마우스의 호흡 및 심장 박동에 대한 이미징 감도를 줄입니다. 다음으로 집게와 젖은 면봉을 사용하여 자궁과 탄성을 조정하여 탄성이 마우스 피부 주위에 밀봉되어 PBS 누출을 방지하도록 합니다.
다음으로, 자궁을 고정하려면 모델링 점토 실린더를 배아 또는 자궁의 오른쪽으로 누르고 배아와 자궁이 PBS로 완전히 덮일 때까지 페트리 접시에 PBS를 추가합니다. 주사 기록을 용이하게하려면 초음파 프로브를 PBS에 담그고 첫 번째 배아가 초음파 프로브와 정렬되도록 마우스 또는 수술 테이블을 조정합니다. 세 개의 배아를 모두 스캔하고 양수를 검사하십시오.
그런 다음 초음파 기계를 사용하여 양강의 직경을 측정하여 적절한 주입량을 결정합니다. 주입 컨트롤러를 사용하여 결정된 주입량과 주입 속도를 초당 23나노리터의 주입 속도로 느리게 설정합니다. 레일 시스템의 메인 휠을 사용하여 바늘을 PBS로 내린 후 액체가 바늘 끝에 도달할 때까지 나노 주입기 컨트롤러에서 Empty를 누릅니다.
그런 다음 PBS에서 바늘을 들어 올리고 주입을 눌러 대략적인 원하는 부피의 방울이 배출되는지 확인합니다. 바늘을 다시 PBS로 내리고 마이크로 매니퓰레이터의 Y면 휠로 나노 주입기를 움직여 바늘을 초음파 프로브 및 배아에 맞춥니다. 주입 각도 휠로 바늘 각도를 조정하여 자궁벽에 대해 거의 수직에 가까운 주입 각도를 보장합니다.
그런 다음 마이크로 매니퓰레이터의 주입 휠을 사용하여 바늘을 양수에 한 번에 삽입합니다. 바늘 끝이 초음파 이미지에서 사라지면 프로브를 앞뒤로 움직여 바늘의 초점을 다시 맞춥니다. 그런 다음 Inject를 적절한 횟수만큼 눌러 원하는 볼륨을 주입합니다.
필요한 양을 주입 한 후 5-10 초 동안 기다렸다가 한 번의 부드러운 움직임으로 바늘을 집어 넣습니다. 무대를 다음 배아로 옮기고 시연된 대로 다른 두 배아에 대해 주사를 반복합니다. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 초음파 프로브와 바늘을 PBS에서 들어 올려 바늘을 작업자에게서 멀어지게 하여 손상과 부상을 방지합니다.
집게를 사용하여 첫 번째와 두 번째 배아를 탄성을 통해 부드럽게 밀어 넣어 복부에 다시 놓습니다. 그런 다음 세 번째 배아에 인접한 조직을 부드럽게 잡고 자궁을 탄성 절개의 상단으로 당깁니다. 집게로 네 번째에서 여섯 번째 배아를 부드럽게 당기고 세 번째 배아가 복부에 다시 들어갈 수 있도록합니다.
최적의 양수를 가진 모든 배아를 주입 한 후 배아와 자궁을 마우스의 복부로 부드럽게 밀어 넣습니다. 신경판의 성공적인 형질도입은 뇌 및 피부와 같은 다른 외배엽 유래 조직에서 형광 리포터의 강한 발현을 갖는 배아를 초래합니다. 과도하게 많은 양을 주입하면 뇌증과 같은 신경관 결함이 발생할 수 있습니다.
배아 7.5 일에 성공적인 주사는 맥락막 신경총을 포함하여 전뇌에서 뒷뇌로 균일 한 전달을 초래합니다. 낮은 역가의 주사는 단일 세포 클론의 형질 도입을 초래하는 반면, 높은 역가 바이러스는 전체 뇌의 거의 100 %를 형질 도입합니다. 배아 13.5일째 배아를 통한 관상동맥 절편은 눈, 수정체, 각막 및 중간엽의 신경 조직의 높고 균일한 형질도입을 보였다.
배아 9.5 일에 주사 한 후, 타액선과 덕트는 구강 상피에서 배아 11.5 일경에 발생합니다. 혀의 설측 상피는 잘 변형되는 반면, 밑에있는 중간 엽은 음성입니다. 또한, 설측 상피 내의 양성 클러스터는 음의 섹션으로 분리되어 유두 표면의 형질 도입을 암시합니다.
배아 7.5 일에 주사하면 배아 13.5 일에 혀 중간 엽이 광범위하게 형질 도입되어 조기 주사가 신경 볏 세포를 표적으로 삼아 혀의 중간 엽에 기여한다는 것을 시사합니다. 렌티 바이러스 주사는 또한 중추 신경계와 말초 신경계의 광범위한 표적화로 이어져 척수의 뉴런과 전구 세포뿐만 아니라 등근 신경절을 형질전환합니다. 좋은 준비가 필수적입니다.
누출이없고 배아가 잘 고정되어 있는지 확인하여 쥐구멍에 주사하는 데 전적으로 집중할 수 있습니다. NEPTUNE 후 뇌의 면역 형광 분석, 단일 세포 RNA 시퀀싱 또는 행동 분석을 위해 주입 된 배아를 태어날 수 있도록하는 것과 같은 다양한 방법으로 분석을 수행 할 수 있습니다.
개요
이 프로토콜은 배아 7.5일에 마우스 양막강에 렌티바이러스를 주입하는 방법을 설명하며, 배아 발달에 최소한의 부작용으로 신경판에 균일한 전달을 가능하게 합니다.
주요 연구 구성요소
과학 분야
- 신경과학
- 발달 생물학
- 유전자 조작
배경
- NEPTUNE은 마우스 배아 신경계의 유전자 조작을 가능하게 합니다.
- 이는 녹다운 또는 계통 추적 모델을 신속하게 생성할 수 있게 합니다.
- 이 프로토콜은 다양한 실험 요구에 적용 가능합니다.
- 양막강 식별은 어려울 수 있으며 주의 깊은 초음파 이미징이 필요합니다.
연구 목적
- 신경판에 효율적인 바이러스 전달 방법을 제공합니다.
- 배아 신경계 발달에 대한 이해를 증진합니다.
- 유전학 연구에서 신속한 실험 일정을 가능하게 합니다.
사용된 방법
- 마우스 배아의 양막강에 렌티바이러스 주입.
- 주입 중 초음파를 사용한 안내.
- 주입을 위한 수술 부위 및 배아 준비.
- 주입 후 배아 발달 모니터링.
주요 결과
- 신경판의 성공적인 전달이 관찰되었습니다.
- 뇌 및 외배엽 유래 조직에서 형광 리포터의 강한 발현이 관찰되었습니다.
- 배아 생존 및 발달에 미치는 해로운 영향이 최소화되었습니다.
- 과도한 주입 량의 경우 신경관 결손의 가능성이 있습니다.
결론
- NEPTUNE 프로토콜은 초기 마우스 배아의 유전자 조작에 효과적입니다.
- 배아 발달 연구에 신속한 접근법을 제공합니다.
- 추가 응용 분야는 다른 기관 시스템으로 확장될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
NEPTUNE enables early-stage genetic manipulation of the mouse neural plate at E7.5, providing a rapid, scalable approach for target validation and functional genomics in neuroscience. By achieving >95% transduction of neural plate and neural crest derivatives, the method supports mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses in prenatal neurodevelopment. This reduces animal usage and accelerates lead identification pipelines for CNS-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in neural plate-derived tissues including brain, spinal cord, and peripheral nervous system.
- Operational Value: Supports rapid generation of knockdown or lineage tracing models in days rather than months.
- Strategic Value: Facilitates target confidence through uniform transduction of >95% of developing brain with high-titer lentivirus.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Allows mosaic transduction with low-titer virus for genetic screening and clonal analysis.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream assays like immunofluorescent imaging and scRNA-seq.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by providing quantitative, reproducible transduction metrics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Targets ectoderm and neural crest contributing to eye, tongue, and PNS, enabling disease-relevant system modeling.
- Operational Value: Provides continuity from preneurulation stages through embryonic day 13.5 analysis.
- Strategic Value: Supports predictive de-risking by linking early genetic manipulation to phenotypic outcomes in neural and peripheral tissues.
Pipeline & Workflow Integration
NEPTUNE fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, enabling early functional validation of genes in neurodevelopmental pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via inducible shRNA or cDNA delivery to neural plate.
- Screening: Enables assay-ready models with uniform or mosaic transduction for compound or genetic library screening.
- Analytics: Generates quantitative readouts such as fluorescent reporter expression and scRNA-seq data for condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through transduction of neural crest-derived tissues like dorsal root ganglia and tongue mesenchyme.
- Enterprise Reuse: Adaptable platform for delivering shRNA, cDNA, or barcoded libraries across organ systems beyond neuroscience.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through early, widespread neural plate transduction.
- Operational Value: Standardized, reproducible injection protocol guided by ultrasound imaging.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk via early mechanistic de-risking in embryogenesis.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on prenatal phenotypic consequences.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse embryology, ultrasound guidance, and microsurgical techniques.
- Dependent on nanoinjector systems, glass capillary preparation, and sterile surgical setup.
- Necessitates cross-team standardization for embryo staging, injection volume calibration, and postoperative care.
- Adaptation across model systems requires validation of amniotic cavity access and viral tropism.
- Practical limitations include sensitivity to injection volume, with excessive volumes risking neural tube defects like exencephaly.
