Name: 엑스 우테로 사전 배후에서 고급 유기발생에 이르는 마우스 배아의 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 배우세요 마우스 배아의 엑스 우테로 배양 방법으로, 7.5일령 이후 배아를 6일간 성공적으로 배양하여 고급 유기발생 단계까지 발달 과정을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 파스칼과 일라나 만투에 의해 지원되었다; 유럽 연구 위원회 (ERC-CoG-2016 726497-셀나디티); 승무원 의학 연구 위원회 (FAMRI); 이스라엘 암 연구 기금 (ICRF) 교수, BSF, 헬렌과 마틴 킴멜 줄기 세포 연구를위한 연구소, 헬렌과 혁신적인 조사에 대한 마틴 킴멜 상; 이스라엘 과학 재단 (ISF), 미네르바, 약용 화학에 대한 셔먼 연구소, 넬라와 레온 베노지요 신경 질환에 대한 센터, 유전 질환 연구를위한 데이비드와 펠라 셰이벨 가족 센터, 의학 유전학에 대한 케이스트 가족 연구소, 박사 베스 롬 - 라이머 줄기 세포 연구 기금, 에드먼드 드 로스 차일드 재단, 잔트 커 자선 재단, Zvia 제로니의 부동산.

모든 동물 실험은 바이즈만 과학 연구소의 동물 보호 지침에 따라 수행되었으며 관련 Weizmann Institute IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2)에 의해 승인되었습니다. 건강한 임산부는 람밤 의료 센터 헬싱키 위원회 (#RMB-0452-15)의 승인을 받아 탯줄에서 혈액을 수집하는 데 정보에 입각한 동의를 요청받았습니다. 건강한 성인은 과학 헬싱키 위원회의 Weizmann 연구소의 지침에 따라 혈액을 수집하기 위해 자신의 정보에 입각한 동의를 요청했다 (#1566-3).
1. 미디어 준비
<ol><li>페놀 레드와 L-글루타민없이 덜벡코의 수정 독수리 매체(DMEM)의 500mL를 사용하여 해부 매체를 준비, 10% 태아 소 혈청, 5mL 의 페니실린/스트렙토마이신, 필터 멸균 0.22 μm 필터를 사용 하 여. 참고: 해부 배지를 최대 1개월 동안 4°C로 유지하십시오.</li>
	<li>배아 배지의 25%와 쥐 혈청 50%, 인간 탯줄 혈청(HCS) 또는 인간 성체 혈액 혈청(HBS)을 사용하여 생물학적 후드 내에서 매일 씩 씩씩하게 배아 배양 배지(EUCM)를 준비한다.</li>
	<li>배아 매체를 준비하려면 글루타민 5mL, HEPES 5mL, 페니실린/스트렙토마이신 5mL을 페놀 레드 및 L-글루타민 없이 DMEM 500mL에 넣으세요. 10-15 mL 알리코를 준비하고 최대 2 개월 동안 4 °C에서 저장하십시오. 참고: 오염이 발생하면 항생제 농도를 두 배로 늘리십시오.</li>
	<li>30-45분 동안 56°C에서 쥐 세럼을 가열하고 0.22 μm 폴리비닐리덴 디플루오라이드 필터를 통해 필터를 드십시오. 비활성화 당일 문화에 세럼을 사용하십시오. HCS 또는 HBS를 해동하고 실험에 즉시 사용하십시오. 참고: 상업용 쥐 혈청은 일관된 결과를 제공합니다(명백한 변화 없이 최소 4개의 로트 테스트). 대안적으로, 고품질 쥐 혈청은 이전에 설명된 바와 같이 사내에서 얻을 수 있다8,14. HCS를 사용할 수 없는 경우 사내에서 수집된 HBS로 교체하십시오. 쥐 혈청, HCS 및 HBS는 한 번 재냉동하고 다른 날에 사용하기 위해 -20 °C에서 보관 할 수 있습니다. 동결 및 새로 해동 된 세럼의 더 큰 볼륨과 재냉동 세럼을 결합하고 다시 고정하지 않습니다.</li>
</ol>2. 인간 탯줄 혈액 혈청 및 인간 성인 혈액 혈청 의 컬렉션
<ol><li>HCS를 격리하려면 예정된 제왕 절개 배달 당일 건강한 임산부로부터 탯줄 혈액을 수집하십시오.<ol>
<li>배꼽 코드 5-7cm를 배꼽에서 이중 으로 고정하고 유아의 출산 직후 클램프 사이에 횡단합니다.</li>
		<li>태반은 혈혈증의 흔적을 피하기 위해 자리에 남아있는 동안 수동으로 큰 보어 14 G 바늘과 배꼽 정맥에서 직접 50 mL 주사기를 사용하여 혈액을 그립니다. 참고: 유아가 수술 장에서 제거된 후 혈액을 수집하고, 임상 검사를 위해 배꼽 혈액이 그려졌습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수집된 혈액을 5mL 프로응고제 멸균 시험관에 분배하고 즉시 완전한 응고를 허용하기 위해 15분 동안 4°C로 이송합니다. 4°C에서 10분 동안 2,500g× g 에서 응고된 시험관을 원심분리합니다.</li>
	<li>용혈 (분홍색 빨간 혈청)의 흔적을 보여주는 튜브를 폐기하십시오. 5mL 파이펫을 사용하여 혈청(노란색)을 수집하고 0.22 μm 필터를 통해 필터링합니다. 45분 동안 56°C 수조에서 즉시 혈청을 열이 비활성화합니다.</li>
	<li>불활성 혈청의 1-1.5mL 알리쿼트를 준비하고 최대 6개월 동안 -80°C에 보관하십시오. 필요한 경우 드라이 아이스를 사용하여 -70 °C에서 발송하십시오.</li>
	<li>성인 인간의 혈액 혈청 수집을 위해 건강한 성인에게서 혈액을 그리고 탯줄 혈액 혈청에 대해 설명된 동일한 프로토콜에 따라 즉시 혈청을 분리합니다. HBS를 최대 6개월 동안 -80°C에서 열비활성화 및 여과된 알리쿼트로 저장합니다. 참고: 인간 탯줄 세럼과 어른 의 인간 혈청은 사내에서 신선하게 준비된 상시 세럼에 우수한 결과를 주었습니다. 건강한 여성으로부터 HCS를 수집, 18 세 이상 과 40 세 미만 은 제왕 절개 배달 예정. 임신 성 당뇨병이나 고혈압을 포함하여 만성 질환이나 활동적인 질병을 가진 여성과 질 출산을 한 여성을 제외하십시오.</li>
</ol>3. E7.5에서 E11까지 배아의 자궁 롤러 배양
<ol><li>롤러 배양 인큐베이터 및 가스 레귤레이터 설정<ol>
<li>배양 E7.5 이상의 고급 배아는 롤러 배양 인큐베이터 시스템을 이용하여 한다. 배아 해부 전에 적어도 1 시간 동안 37°C에서 회전기 및 가열 장치를 켭니다. 가스 입구 병과 콘센트 테스트 튜브에 자동 용수를 추가합니다. 참고: 회전 드럼 에 인접한 온도계를 배치하고 자주 인큐베이터 내부온도의 안정성을 확인합니다. 가능한 한 빨리 인큐베이터를 열어 개방 시간이 길어지면 온도가 증가하고 배아 발달에 영향을 미칩니다. 필요한 경우 가스 입구 병과 출구 테스트 튜브에 더 많은 자동 용수를 추가하여 문화 중에 최소 절반 용량으로 유지하십시오. 인큐베이터를 천으로 덮어 인큐베이터 내부의 배아를 빛으로부터 보호합니다.</li>
		<li>메인 스위치를 누르고 산소/질소 및 CO2 컨트롤러를 켜서 가스 레귤레이터 모듈을 켭니다(그림 1A). 각 컨트롤러를 사용하여 산소 및 CO2 값을 5%로 설정합니다. 가스 레귤레이터를 열고 압력 송신기(그림 1B)에서 전압 스위치를 이동하여 제곱인치당 6.5-7파운드(psi)로 가스 압력을 설정합니다. 디지털 압력 게이지를 사용하여 가스 압력 값을 확인합니다.</li>
		<li>정밀 인큐베이터 내부에 할당된 배출구 수분 충전 테스트 튜브 내부에서 생성된 기포의 속도를 확인하여 가스 흐름을 모니터링합니다. 물병 뚜껑에 가스 흐름 밸브를 닫고 열어 적절한 거품 속도를 설정합니다. 가스 흐름이 초당 2-4 기포 의 속도로 기포의 형성을 허용하거나 버블링이 물로 채워진 출구 튜브에 나오는 첫 번째 지점에서 거품 흐름을 설정할 수 있는지 확인합니다.</li>
		<li>배양 배지 2mL로 배양병을 채우고 1h의 프리플리션을 위해 속이 빈 회전 드럼에 연결합니다. 속이 빈 실리콘 번그를 사용하여 병을 드럼에 밀봉하십시오. 솔리드 번그를 사용하여 회전 드럼의 빈 공간을 밀봉하십시오. 참고: 출구 관에 기포가 없거나(시스템을 통해 들어오는 가스 없음) 또는 매우 높은 가스 흐름이 태아 발달에 영향을 줄 수 있습니다. 출구 테스트 튜브에 거품 흐름이 부족한 경우 모든 실리콘 번그가 회전 드럼에 올바르게 배치되어 시스템을 밀봉하고 물병이 제대로 닫혀 있고 모든 튜브가 올바르게 연결되어 있는지 확인하십시오. 물병에 거품이 들어오지 않아 가스 조절기의 오작동을 나타낼 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>임신 한 마우스에서 마우스 배아의 해부<ol><li>인큐베이터 내부의 해부 배지를 37°C및 5% CO2 에서 최소 1h로 선평화한다. 뚜껑을 약간 열어 가스 교환을 허용합니다.</li>
		<li>자궁 경부 탈구로 임신 한 여성을 희생하고, 여성의 복부를 70 %의 에탄올로 청소하고, 가위로 피부와 복벽을 잘라냅니다. 자궁의 한쪽 끝을 찾아 난소와 자궁 사이의 교차점에 잘라. 다음으로, 자궁을 따라 다른 쪽 끝까지 자르고 실온 덜벡코의 인산완충식식염(DPBS)으로 채워진 100mm 페트리 접시로 옮는다. 참고: 비 호르몬 프라이밍의 사용, 자연스럽 게 짝짓기 된 여성 권장.</li>
		<li>DPBS의 개념을 신속하게 세척하고 쌍으로 잘라 배아 처리를 용이하게합니다. 모든 컨셉을 60mm 페트리 접시에 미리 보정된 해부 매체로 옮기고 개별 컨셉으로 자른다.</li>
		<li>총 집게 한 쌍을 사용하여 자궁 조직을 찢어 개념의 자궁 벽을 제거합니다. 미세한 미세 수술 용 집게를 사용하여 배 모양의 데시두아의 끝을 잘라냅니다. 긴 축에 평행배 옆에 있는 집게를 삽입하고 집게를 열어 데시두아를 반으로 나눕다.</li>
		<li>마지막으로, 데시두아에서 배아를 잡고 미세 한번을 사용하여 배아에서 정수리 노른자 주머니를 벗겨내어 계란 실린더에 부착된 그대로의 자궁절 콘을 남깁니다. 참고: 배아에 영향을 미치지 않으려면 최대 30-40분 이내에 37°C의 가열 플레이트가 장착된 현미경에서 해부를 수행합니다. 한 번에 한 마리의 배아를 해부합니다.</li>
		<li>해부 직후, 배아를 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 평형 해부 배지로 채워진 새로운 판으로 배아를 옮겨 배아가 조직 파편에 달라붙는 것을 방지합니다.</li>
		<li>신경판/초기 헤드 폴드 스테이지에서 이러한 배아를 선택하여 에피블라스트에 손상을 주지 않고 병당 5-6개의 배아를 미리 보정된 유리 배양 병으로 옮기십시오. 참고: 유리 파스퇴 파이펫을 준비하려면 파이펫의 개구부를 유리 커터를 사용하여 배아에 맞게 적절한 크기로 자르고 오염을 방지하기 위해 에탄올에 보관하십시오. 배아를 옮기기 전에 PBS로 유리 파이펫을 씻으시면 됩니다. 배아를 배양병으로 옮길 때, EUCM희석을 피하기 위해 가능한 한 해부 매체의 적은 부피를 이월해야 한다.</li>
		<li>회전 배양 시스템에 병을 37°C, 5% O2 및 5% CO2의 대기에 놓습니다.</li>
		<li>문화의 매일, 스테레오 현미경에서 배아 개발을 평가하기 위해 인큐베이터에서 하나씩 병을 제거합니다. 병을 제거할 때 드럼의 빈 구멍을 단단한 붕으로 닫아야 합니다. 멸균 플라스틱 파스퇴르 파이펫의 끝을 잘라 배아 크기에 맞게 배아를 페트리 접시로 이동하여 관찰을 용이하게 합니다. 배아는 항상 매체에 의해 덮여 있는지 확인하십시오. 참고: 배아가 인큐베이터 외부에 있는 시간을 최소화하여 체온 의 감소로 인해 배아의 해로운 영향을 피하십시오. 배아 생존에 영향을 미치는 노른자 낭 혈관의 파열을 피하기 위해 배아를 신중하게 처리하십시오.</li>
		<li>문화일1(E8.5에 해당)에서 3개의 배아를 새로운 병에 옮기는 그룹은 2mL의 신선하고 미리 보정된 EUCM으로 D-포도당 3 mg/mL을 추가로 함유하고 있으며 가스 혼합물은 13% O2, 5% CO2이다.</li>
		<li>48h(E9.5에 해당) 후, 2개의 배아를 신선한 예열된 EUCM과 3.5 mg/mL의 가스 대기에서 18% O2 및 5% CO2의 가스 대기로 새로운 병으로 이송한다.</li>
		<li>72h의 배양(E10.5에 해당)에서 각 배아를 1.5-2mL의 신선한 배지를 함유한 개별 병으로 이동하여 4 mg/mL의 포도당과 21% O2 및 5%의 CO2의 가스 공급으로 보충한다. 참고: 배아는 4일 자정에 최대 성장에 도달합니다.</li>
		<li>미세 한 집게를 사용 하 여 노 른 자 낭과 양수 를 제거 하 고 배아 형태의 적절 한 관찰에 대 한 탯줄을 분리. 가스 규제 모듈과 정밀 인큐베이터를 끕니다. 참고: 배아 단계에 따라 적절한 가스 대기로 롤러 배양에서 유리병 내부의 배양배지를 1시간 동안 선평화한다. 배양병과 모든 인큐베이터 유리제품을 세척하여 증류수 세 번의 세척을 수행한 후 70% 에탄올에 잠수한 야간 세척을 수행합니다. 증류수로 세 번 재세척하고, 병이 하룻밤 동안 건조하게 하고, 오토클레이브로 살균합니다. 마찬가지로 실리콘 플러그를 정기적으로 오토클레이브합니다. 70% 에탄올로 모든 해부 도구를 철저히 청소하고 건조 살균합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. E5.5/E6.5에서 E11로 확장된 배아 배양
<ol><li>배양 배기 전 (E5.5) 및 초기 위화 (E6.5) 정적 플레이트에서 초기 소미트 단계 (E8.5)까지 배아.</li>
	<li>37°C에서 5% CO2 로 인큐베이터에서 1h의 해부 배지를 선평화한다. 참고: 가스 교환을 허용하려면 튜브 뚜껑을 완전히 닫지 마십시오.</li>
	<li>새로 준비된 EUCM 250 μL을 각 웰에 추가하여 배양 판을 준비합니다. 미리 보정을 위해 CO2 인큐베이터 내부에 플레이트를 37°C로 배치합니다. 참고: 8웰 플레이트는 배아 성장에 적합하지만, 배양은 플레이트의 크기에 따라 배지의 부피를 조정하여 다른 플레이트에서 수행할 수 있다.</li>
	<li>E7.5에 대해 기술된 기술에 따라 자궁에서 계란 실린더 배아를 해부한다. 배아의 정수리 노른자 주머니를 제거하고 계란 실린더에 부착 된 그대로 ectoplacental 콘을 둡니다.</li>
	<li>마이크로피펫을 사용하여 8웰 플레이트의 각 웰에 개별 배아를 옮기고 플레이트를 37°C에서 5% CO2 로 인큐베이터 내부에 놓습니다.</li>
	<li>스테레오현미경아래 배아를 이미지화하고, 명백한 손상없이 라이처트의 멤브레인없이 잘 형성 된 양수 구멍을 가진 사람들만 배양을 선택합니다. 참고: 20 μL 파이펫 팁을 사용하여 E5.5 배아와 200 μL 팁을 전송하여 E6.5 배아를 이송합니다. E6.5에서 시작되는 문화의 경우 HCS는 갓 수거된 HBS로 대체할 수 있습니다.</li>
	<li>배지의 절반을 제거하고 24시간 후 새로 준비된 예온 EUCM 250 μL을 추가하여 배아가 항상 배양 배지에 침지되도록 합니다. E5.5에서 시작되는 배양의 경우, 2일간의 배양(E7.5에 해당)을 제거하여 200 μL을 제거하고 새로운 EUCM의 250 μL을 추가합니다. 참고: 정적 배양 시 배아는 배아 발달을 심각하게 손상시키는 플레이트(주로 플라스틱 플레이트를 사용하는 경우)에 부착할 수 있습니다. 배아를 접시에 부착하는 것은 E5.5 배아를 배양하는 첫날에 더 빈번합니다. 부착을 방지하기 위해 미세한 멸균 집게를 사용하여 배아를 플레이트 표면에서 조심스럽게 밀어 넣습니다. 절제된 콘만 플레이트 표면에 부착된 상태로 남아 있는지 확인합니다.</li>
	<li>초기 소미트 단계에서 롤러 배양으로 배아를 전송 (4-7 somites; E5.5에서 배양에 박은 배아에 대한 문화의 3 일 후 E6.5에서 시작), E8.5 단계 배아에 대해 이전에 설명 된 동일한 표시에 따라. 참고: 상기와 다른 소미트 스테이지에서 배아를 롤러 배양으로 옮기면 추가 개발이 실패하게 된다. E7.5 전 자궁 배양과 는 달리, 21% 산소와 5% CO2의 일정한 대기에서 배아를 유지할 수 있어, 동적 산소 농도를 가진 대기보다 배아 발달의 약간 더 높은 효율을 제공한다.</li>
</ol>

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</ol>

J.H.H는 생물산업(생물학공업)의 고문으로, 여기에 설명된 롤러 및 정적 문화 조건을 다루는 특허 출원을 제출했습니다(J.H.H. 및 바이즈만 과학 연구소가 출원). 다른 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

본 명세서에 제시된 배양 프로토콜은 E5.5에서 E11까지 최대 6일 동안 적절하고 지속적인 마우스 배아 발달 ex utero를 유지할 수 있다. 이전에는 이러한 발달 단계에 있는 배아가 짧은 기간 동안만 배양에서 정상적으로 개발할 수 있었습니다(최대 48h)15. 산소 농도 및 고압 가스 압력의 정밀한 제어를 위한 롤러 배양 인큐베이터에 가스 조절 모듈을 결합하는 것은 본 원에 기재된 적절한 마우스 배아 배아 배양에 매우 중요하다. 가스 압력을 7psi로 증가하면 산소 확산이 향상되어 장기적으로 배아에 해로울 수 있는 95% O216의 이전에 사용된 조건과 달리 최대 21% O2/5% CO2의 대기중의 E11까지 배아 발달이 가능합니다. 또한, 산소 농도는 초기 이식 후 배아 발생이 저산소 조건하에서 발생함에 따라 배아 발달에 중요한 역할을 하는 것...

포유류 배아의 자궁 내 발달은 이식 후 발달의 초기 단계의 연구를 제한했다1,2. 개발 배아의 접근성은 동물 체형 계획의 수립, 세균 층의 사양 또는 조직 및 장기의 형성과 같은 자궁으로 배아 임플란트 후 발생하는 주요 발달 과정의 이해를 방해합니다. 더욱이, 초기 이식 후 배아의 아주 작은 크기는 E103 의 앞에 자궁에 있는 본질적인 화상 진찰에 의해 관찰하기 어렵게 만듭니다. 이 단계에서 살아있는 태아를 관찰하고 조작하는 무능력은 발달 도중 스냅샷에 초기 이식 후 배아 발생의 연구 연구를 제한했습니다.
전 이식 포유류 배아의 체외 배양을 위한 프로토콜은 잘 확립되고, 믿을 수 있고, 정기적으로 이용됩니다4. 그럼에도 불구하고, 적절한 포유류 이식 후 배아 성장을 지원할 수 있는 자궁 배양 시스템을 확립하려는 시도는 성공을 제한했다5. 종래의 정적 판에서 배아를 배양함으로써 100년 이상 다양한 배양 기술이 제안되어 왔으며, 주로 종래의 정적 플레이트6,7,8 또는 회전병(롤러 배양)5,9,10에서 배아를 배양함으로써 제안되었다. 이 플랫폼은 이식 후 포유류 개발에 대한 지식을 확장하는 데 도움이 입증11,12, 정상적인 배아 생존을 위해 매우 비효율적이고 짧은 기간에 제한에도 불구하고. 배아는 문화 개시 후 24-48 h로 발달 지체 및 형태 학적 이상을 표시하기 시작했다.
본 연구는 사전 접종에서 최대 6일간의 고급 유기발생 단계로의 지속적인 발달을 허용하는 전 자궁 배아 배양 시스템을 설정하기 위한 상세한 설명을 제공한다13. 이 논문은 정전기 판및 롤러 배양 플랫폼에 문화를 결합하여 뒷다리 형성 단계(~E11)와 E5.5/E6.5로부터의 확장배양까지 E7.5 배아(신경판 및 헤드폴드 스테이지)의 성장을 지원하는 개선된 롤러 배양 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>0.22 & 마이크로; m 기공 크기 필터 (250 mL)</td><td>JetBiofil</td><td>FCA-206-250</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m 기공 크기 주사기 PVDF 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>8-well &micro;-plates glass bottom/ibiTreat</td><td>iBidi</td><td>80827/80826</td><td></td></tr><tr><td>가스 주입구용 어댑터 캡이 있는 병</td><td>Arad Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bungs (Hole)</td><td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td><td>BTC 06</td> 병을 드럼 Bungs(솔리드)<td></td></tr><tr><td></td><td>에 밀봉하는 데 사용됩니다.B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td><td>BTC 07</td><td>회전 드럼 배</td></tr><tr><td>양 병 밀봉에</td> 사용 <td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td><td>BTC 03/BTC 04</td><td>유리병(소) BTC 03 또는 유리병(대) BTC 04</td></tr><tr><td>D(+)-포도당 일수화물</td><td>J.T. 베이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 나이프</td><td>Fine Science Tools</td><td>10100-30/45</td><td></td></tr><tr><td>디지털 압력계</td><td>Shanghai Benxu Electronics Technology co., Ltd</td><td>BX-DPG80</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11880</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Biological industries</td><td>02-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Biological industries</td><td>04-013-1A</td><td></td></tr><tr><td>가스 조절 모듈</td><td>Arad Technologies</td><td>HannaLab1</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050061</td><td>글루타민</td></tr><tr><td>Graefe 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Microsurgical byps (Dumont # 5, # 55)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 (유리)</td><td>Hilgenberg</td><td>3150102</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 (플라스틱)</td><td>Alexred</td><td>SO P12201</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>생물학 산업</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시(60mm 및 100mm)</td><td>Falcon</td><td>351007/351029</td><td></td></tr><tr><td>정밀 인큐베이터 시스템</td><td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td><td>BTC01</td><td>BTC01 모델 with gas bubbler kit</td></tr><tr><td>Pro-coagulant sterile test tubes(5 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#456005</td><td></td></tr><tr><td>쥐 전체 배아 배양 혈청</td><td>ENVIGO Bioproducts</td><td>B-4520</td><td></td></tr> 혈청 여과용 가열<tr>판 <td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td></td>멸균 주사기(5, 10ml)가<td>장착된 실체 현미경</td></tr><tr><td></td><td>Pic Solution</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr></tbody></table>

엑스 우테로 사전 배후에서 고급 유기발생에 이르는 마우스 배아의 배양

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

이식 후 포유류 배아 배양 방법은 일반적으로 비효율적이고 자궁에서 해부 후 짧은 기간으로 제한되었습니다. 플랫폼은 최근에 향상된 유기발생까지 계란 실린더 단계에서 마우스 배아의 매우 강력하고 장기간 전 자궁 배양을 위해 개발되었습니다. 이러한 플랫폼은 뒷두개 형성 단계(E11)까지 배아(E5.5)를 예식하는 적절하고 충실한 개발을 가능하게 한다. 늦은 가스루 배아(E7.5)는 이러한 설정에서 회전병에서 재배되는 반면, 예기 단계(E5.5 또는 E6.5)에서 확장된 배양은 정적 및 회전 병 배양의 조합을 필요로 한다. 또한, O2 및 CO2 농도, 가스 압력, 포도당 수준 및 특정 전 자궁 배양 배지의 사용에 대한 민감한 조절은 적절한 배아 발달에 매우 중요하다. 여기서, 확장된 전자궁 마우스 배아 배양을 위한 상세한 단계별 프로토콜이 제공된다. 기체에서 유기발생에 이르는 정상 마우스 배아 전 자궁 을 성장시키는 능력은 배아 발달 중 다른 실험적 동요의 효과를 특성화하기 위한 귀중한 도구를 나타낸다.

E7.5 배아(후기 위화 단계)에 대해 설명된 롤러 배양 조건은 4배양일 후 평균 효율이 75%에 가까운 일정하고 정상적인 배아 성장을 지원합니다(그림 2 및 표 1). 배아 발달의 효율성은 다양한 마우스 유전 배경에 따라 다를 수 있지만 일관되게 견고합니다(그림 2C). HCS 대신 HBS를 사용하면 마우스의 유전적 배경에 따라 4일간의 자궁 배양 후 ~68%의 효율을 산출한다(도 2D 및 표 2). 배아는 약 44-somite 단계까지 적절한 발달을 재구성하는 전 자궁 을 개발했습니다. 그 후, 배아는 알란토성 태반의 부재로 인해 배아 이상을 제시하고, 이 단계에서 증가된 체질량을 감안할 때 산소와 영양 공급이 불충분하다.
정...

전체 배아 배양을 위한 향상된 플랫폼은 사전 배기 단계부터 고급 유기발생까지 최대 6일 동안 이식 후 마우스 배아의 연속적이고 강력한 전자궁 개발을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서는 정적 플레이트와 회전 병 시스템을 사용하여 성공적인 배아 배양을 위한 표준 절차를 자세히 설명합니다.

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

이 방법은 포유류의 형성을 따라 가스를 이해하는 데 기본이 될 것입니다. 모성 자궁 안쪽에 오랫동안 숨겨져 있던 배아 단계 도중 살아있는 태아에 있는 실험을 허용해서. 그것은 최대 6 일의 연장된 기간 동안 자궁 외부 마우스 태아의 효율적이고 적당한 성장을 계속합니다.가스 농도 와 압력의 신속하고 적절한 배아 해부 및 선기량은 성공적인 배아 성장을위한 가장 중요한 단계입니다. 7.5일 이상 진행된 마우스 배아를 배양하기 시작하려면 배아 해부 전에 최소 1시간 동안 롤러 배양 인큐베이터 시스템의 회전기 및 가열 장치를 켭니다. 또한 가스 입구 병과 출구 테스트 튜브에 오토클레이브 물을 추가합니다.다음으로, 메인 스위치를 눌러 가스 레귤레이터 모듈을 켜고, 각 컨트롤러를 사용하여 산소 및 이산화탄소 값을 5%로 설정하고 압력 송신기의 전압 스위치를 이동하여 가스 압력을 평방 인치당 약 6.5~7파운드로 설정합니다. 디지털 압력 게이지를 사용하여 가스 압력 값을 확인합니다. 정밀 인큐베이터 내부에 할당된 출구 수충전 테스트 튜브 내부에서 생성된 기포의 속도를 확인하여 가스 흐름을 모니터링합니다.물병 뚜껑에 가스 흐름 밸브를 닫거나 열어 적절한 거품 속도를 설정합니다. 가스 흐름이 초당 2~4개의 거품 속도로 기포를 형성할 수 있도록 하거나 거품이 가득 찬 출구 튜브에 나오는 첫 번째 지점에서 거품 흐름을 설정할 수 있는지 확인합니다. 다음으로, 배양 배지의 2 밀리리터로 배양 병을 채웁니다.속이 빈 실리콘 번그를 사용하여 병을 밀봉하고 1 시간 동안 미리 평형하기 위해 속이 빈 회전 드럼에 연결합니다. 솔리드 번그를 사용하여 회전 드럼의 빈 공간을 밀봉상태로 유지합니다. 다음으로, 안락사 된 임신 한 여성 마우스에서 배아를 해부.70%에탄올로 복부를 청소하고 가위를 사용하여 피부와 복부를 잘라냅니다. 자궁의 한쪽 끝을 찾아 난소와 자궁 사이의 교차점에 잘라. 다른 쪽 끝까지 자궁을 따라 절단을 계속하고 DPBS로 채워진 100 밀리미터 페트리 접시로 전송합니다.DPBS의 개념을 신속하게 세척하고 쌍으로 잘라 배아 처리를 용이하게합니다. 모든 개념 쌍을 60mm 페트리 접시에서 미리 평형된 해부 배지로 이동한 다음 개별 개념으로 잘라냅니다. 다음으로, 한 쌍의 총 집게를 사용하여 자궁 조직을 찢어 개념의 자궁 벽을 제거한 다음 미세한 미세 수술 용 집게를 사용하여 배 모양데시두아의 끝을 자른다.긴 축에 평행배 옆에 있

ex-utero-culture-mouse-embryos-from-pregastrulation-to-advanced

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 주변 신경 가지의 재배와 시간 경과 영상을위한 중간 회임 마우스 배아의 organotypic 조각을 준비하는 방법을 제시한다.

의 Organotypic 슬라이스 문화 GFP - 표현 주변 신경 가지의 실시간 이미징을위한 마우스 배아를

산모 신진 대사를 무시 neurulation 동안 마우스 배아의 직접적인 약리 조작에 대한 허용하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 시점과 약리 에이전트를 변화하여 neurulation의 다양한 측면을 연구하기 위해 적용할 수 있습니다.

마우스 배아 전체 문화 신경 튜브 폐쇄

마우스 발달 연구는 임신 기간 동안 태아의 어려움에 의해 방해된다. 임신의 후반 단계에서 배아 심장의 장기 문화를 촉진하기 위해, 우리는 절제 마음이 반 고체, 희석 리겔에 배양되는 프로토콜을 개발했다.

소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

배아 배양에 활용 혈청 특히 신호의 상호 작용을 포함하는 연구 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 알 수없는 구성 요소가 포함되어 있습니다. 여기서 우리는 혈청 산소 배양 시스템을 활용하고 16-40 시간 동안 배양 한 중간 회임 마우스 배아가 자궁에서 개발 태아에 비해 형태 개발을 전시 것을 보여줍니다.

무 혈청 전체 배아 배양 시스템에서 마우스 배아 개발

우리는 마우스 배아 피부의 해부와 생체의 문화를 설명합니다. 배양 시스템은 조직 표면에 걸쳐 공기 - 액체 계면을 유지하고 거꾸로 현미경의 이미징을 허용한다. Melanoblasts, 개발 피부의 구성 요소는, 형광 그들의 행동은 공 초점 현미경을 사용하여 관찰 할 수 있도록 표시되어 있습니다.

마우스 배아의 피부와 Melanoblast 이주의 라이브 영상의 생체 문화

향상된 이미징 기술은 발달 중에 장기의 3차원 이미징을 가능하게 합니다. 여기에서는 태아 쥐의 장에서 발달 중인 융모의 실시간 이미징을 허용하는 전체 장기 배양 시스템에 대해 설명합니다.

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템 전의 VIVO 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

생체 외 직립 액적 배양은 현재의 시험관 내 및 생체 내 실험 기술의 대안입니다. 이 프로토콜은 수행하기 쉽고 더 적은 양의 시약이 필요하며 태아 혈관화, 형태 형성 및 기관 형성을 조작하고 연구할 수 있는 기능을 허용합니다.

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 전체 태아 기관의 강직 한 방울 문화 마우스 기관 형성 기간 동안 발달 프로세스를 연구

우리는 마우스 Wolffian 덕트 (WD)의 분리 및 배양 방법을 제시한다. 우리는 또한 형광 태그 항체 배양 / 갓 격리 WDS의 전체 마운트 면역 염색에 대한 자세한 절차를 보여줍니다. 함께, 이러한 기술은 WD의 개발, 코일 링, 및 분화에 대한 연구를 할 수 있습니다.

오르간 문화와 마우스 Wolffian 덕트의 전체 마운트 면역 형광 염색법

우리는 심장 전구 세포의 3D + 시간 이미징을 가능하게 하는 마우스 배아 배양 및 이미징을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 비디오 툴킷은 텍스트 전용 출판물에서 얻기 어려운 성공적인 라이브 이미징에 필요한 핵심 기술을 다룹니다.

생쥐 배아에서 초기 심장 전구체의 생생한 영상

이 논문은 단일 세포 및 핵의 염기서열 분석을 위한 gastrulating mouse embryos의 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 위한 파이프라인을 설정합니다.

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

배우세요 마우스 배아의 엑스 우테로 배양 방법으로, 7.5일령 이후 배아를 6일간 성공적으로 배양하여 고급 유기발생 단계까지 발달 과정을 연구할 수 있습니다.

엑스 우테로 사전 배후에서 고급 유기발생에 이르는 마우스 배아의 배양

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