Name: 인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 학습하세요 인간 단핵구 유래 대식세포에서 BiFC 기법을 이용한 염증성 카스파제 활성화 시각화 방법을. 이 프로토콜은 살아있는 세포에서 분자 수준의 면역 반응 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는이 기술의 발전에 기여한 LBH의 과거와 현재의 실험실 구성원들에게 감사드립니다. 이 실험실은 NIH / NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH / NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH / NIGMS R01GM121389 (LBH)가 지원합니다. 도 2는 바이오렌더 소프트웨어를 사용하여 도출하였다.

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<li>Pop, C., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+caspases%3A+activation%2C+specificity%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human caspases: activation, specificity, and regulation.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).</li>
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<li>Bolívar, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+caspase+regulation%3A+maintaining+balance+between+inflammation+and+cell+death+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease.</a> The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).</li>
<li>Martinon, F., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+caspases%3A+linking+an+intracellular+innate+immune+system+to+autoinflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases.</a> Cell. 117 (5), 561-574 (2004).</li>
<li>Lamkanfi, M., Vishva, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of inflammasomes.</a> Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).</li>
<li>Viganò, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+caspase-4+and+caspase-5+regulate+the+one-step+noncanonical+inflammasome+activation+in+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes.</a> Nature Communications. 6, 8761(2015).</li>
<li>Cerretti, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+interleukin-1+beta+converting+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme.</a> Science. 256 (5053), 97(1992).</li>
<li>van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasome+activation+and+IL-1%CE%B2+and+IL-18+processing+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammasome activation and IL-1β and IL-18 processing during infection.</a> Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).</li>
<li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome%3A+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+inflammasome+activation+targets+caspase-11%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11.</a> Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+inflammasome+activation+by+intracellular+LPS+independent+of+TLR4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4.</a> Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).</li>
<li>Masumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASC%2C+a+novel+22-kDa+protein%2C+aggregates+during+apoptosis+of+human+promyelocytic+leukemia+HL-60+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).</li>
<li>Bertin, J., DiStefano, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PYRIN+domain%3A+a+novel+motif+found+in+apoptosis+and+inflammation+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins.</a> Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).</li>
<li>Agostini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NALP3+forms+an+IL-1beta-processing+inflammasome+with+increased+activity+in+Muckle-Wells+autoinflammatory+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder.</a> Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).</li>
<li>Bürckstümmer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthogonal+proteomic-genomic+screen+identifies+AIM2+as+a+cytoplasmic+DNA+sensor+for+the+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome.</a> Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).</li>
<li>Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+regulation+of+the+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Activation and regulation of the inflammasomes.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-11+cleaves+gasdermin+D+for+noncanonical+inflammasome+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling.</a> Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+caspases+are+innate+immune+receptors+for+intracellular+LPS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS.</a> Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).</li>
<li>Bolívar, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+Roles+of+Caspase-4+and+Caspase-5+in+Heme-Driven+IL-1%CE%B2+Release+and+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1β Release and Cell Death.</a> The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).</li>
<li>Schmid-Burgk, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-4+mediates+noncanonical+activation+of+the+NLRP3+inflammasome+in+human+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).</li>
<li>Baker, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+inflammasome+activation+downstream+of+cytoplasmic+LPS+recognition+by+both+caspase-4+and+caspase-5%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).</li>
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<li>Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lighting+up+the+pathways+to+caspase+activation+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316(2018).</li>
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<li>Lu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unified+polymerization+mechanism+for+the+assembly+of+ASC-dependent+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes.</a> Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).</li>
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<li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+heterodimeric+cysteine+protease+is+required+for+interleukin-1%CE%B2processing+in+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1βprocessing in monocytes.</a> Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).</li>
<li>Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+small+interfering+RNA+%28siRNA%29+delivery+into+bovine+monocyte-derived+macrophages+by+transfection+and+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).</li>
<li>Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+introduction+into+rice+by+electroporation+and+analysis+of+transgenic+plants%3A+use+of+electroporation+buffer+lacking+chloride+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions.</a> Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).</li>
<li>Bhowmik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+wheat+microspores+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6502(2018).</li>
<li>Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+the+difference+between+CD80+and+CD86%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">What's the difference between CD80 and CD86.</a> Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).</li>
<li>Kurokawa, M., Kornbluth, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+and+kinases+in+a+death+grip%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Caspases and kinases in a death grip.</a> Cell. 138 (5), 838-854 (2009).</li>
</ol>

저자들은 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

이 프로토콜은 인간 혈액 샘플로부터 분리된 단핵구로부터 대식세포를 수득하는 워크플로우 및 세포 생존력 및 거동을 손상시키지 않으면서 염증성 카스파제 BiFC 리포터를 인간 MDM에 효율적으로 도입하는 방법을 기술한다.
이 프로토콜은 BiFC 기술(35 )을 활용하여 카스파제 모집 도메인(CARD)에서 염증성 카스파제를 비형광 단백질 금성의 비형광 단편으로 태그한다. 염증성 카스파제는 큰 (p20) 및 작은 (p10) 서브유닛으로 구성된 촉매 도메인을 코딩하고, 보존된 단백질-단백질 상호작용 모티프는 그들의 N 말단 또는 프로도메인36 에서 CARD로 명명된다 (도 1B). 그들의 활성화 플랫폼에 염증성 카스파제의 모집은 손상되지 않은 카드에 달려 있습니다. 이러한 접근법을 위해, 두 개의 카스파제 프로도메인 작제물(CARD 모티프를 코딩함)이...

카스파제는 개시제 카스파제 및 집행자 카스파제로 그룹화될 수 있는 시스테인 아스파르테이트 프로테아제의 패밀리이다. 사형 집행자 카스파제는 카스파제-3, -6 및 -7을 포함한다. 그들은 이량체로서 세포에서 자연적으로 발견되며 아폽토시스1을 실행하기 위해 개시제 카스파제에 의해 절단됩니다. 개시제 카스파제는 인간 카스파제-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 및 -12를 포함한다. 이들은 근접-유도된 이량체화에 의해 활성화되고 자가-단백질 분해 절단 2,3에 의해 안정화되는 비활성 효소원(pro-caspases)으로서 발견된다. 염증성 카스파제는 개시제 카스파제2의 서브세트이고, 인간에서 카스파제-1, -4, -5, 및 -12를 포괄하고, 마우스4,5에서 카스파제-1, -11, 및 -12를 포괄한다. 아폽토시스 역할보다는 염증에서 중심적인 역할을합니다. 이들은 프로인터루킨(IL)-1β 및 프로-IL-18 6,7의 단백질 분해 처리 및 분비를 매개하며, 이는 병원성 침입자 8,9에 반응하여 방출되는 최초의 사이토카인이다. Caspase-1은 활성화 플랫폼으로의 모집시 활성화됩니다. 큰 분자량의 단백질 복합체를 인플람마솜(도 1A)10이라고 불렀다. 카스파제-4, -5 및 -11의 이량체화는 비정준 인플라마솜 경로(11,12)를 통해 이들 플랫폼과 독립적으로 발생한다.
정준 인플라마좀은 인플람마솜 센서 단백질, 어댑터 단백질 ASC(CARD를 함유하는 아폽토시스-관련 얼룩-유사 단백질), 및 이펙터 단백질 카스파제-110으로 구성된 시토졸 다량체 단백질 복합체이다. 가장 잘 연구된 정준 인플라마좀은 피린 도메인 (NLRP), NLRP1 및 NLRP3을 함유하는 NOD 유사 수용체 패밀리, CARD (NLRC), NLRC4, 및 흑색종 2 (AIM2)에 결석한 NLR 패밀리를 함유한다. 그들은 각각 피린 도메인, 카드 또는 두 도메인을 모두 포함합니다. CARD 도메인은 CARD 함유 카스파제와 그들의 업스트림 활성화제 사이의 상호작용을 매개한다. 따라서, N 말단 피린 도메인 (PYD) 및 C 말단 CARD 모티프 13,14로 구성되는 스캐폴드 분자 ASC는 NLRP1 10, NLRP315 및 AIM216 inflammasomes에 대한 카스파제-1의 모집에 필요하다.
각 인플람마솜은 뚜렷한 전염증성 자극을 인식하는 고유한 센서 단백질의 이름을 따서 명명되었습니다(그림 1B). 이 경로의 활성화자는 정식 자극이라고합니다. 인플람마좀은 미생물 성분 및 조직 스트레스에 대한 센서로서 작용하고, 염증 카스파제(17)의 활성화를 통해 강력한 염증 반응을 촉발시키기 위해 조립된다. 인플라마솜 어셈블리는 카스파제-1 활성화를 개시하여 그의 주요 기질인 pro-IL-1β 및 pro-IL-18의 성숙 및 분비를 매개한다. 이 프로세스는 두 단계 메커니즘을 통해 발생합니다. 첫째, 프라이밍 자극은 NF-κB 경로의 활성화를 통해 특정 염증성 단백질 및 pro-IL-1β의 발현을 상향조절한다. 둘째, 세포내(정경적) 자극은 프로파스파제-1 6,7의 인플라마솜 조립 및 모집을 유도한다.
Caspase-4 및 caspase-5는 뮤린 카스파제-11 11의 인간 오르토로그이다. 이들은 그람 음성 박테리아 18,19,20의 외막에서 발견되는 분자인 세포내 리포폴리사카라이드(LPS)와 적혈구 용혈(21)의 산물인 세포외 헴에 의해 인플라마솜-비의존성 방식으로 활성화된다. LPS가 이들 단백질의 CARD 모티프에 직접 결합하고 이들의 올리고머화(20)를 유도한다는 것이 제안되었다. 카스파제-4 또는 카스파제-5의 활성화는 기공 형성 단백질 가스더미민 D(GSDMD)18,19의 절단을 통해 피롭토시스라고 불리는 염증성 형태의 세포 사멸을 유도함으로써 IL-1β 방출을 촉진한다. 또한, 카스파제-4 및 GSDMD 매개 열록토시스 사멸로부터 야기되는 칼륨 이온의 유출은 NLRP3 인플라마좀의 활성화 및 카스파제-122,23의 후속 활성화를 유도한다. 따라서, 카스파제-4, -5, 및 -11은특정 자극(11,24)에 반응하여 피옵토시스 및 카스파제-1 활성화를 유도할 수 있는 LPS용 세포내 센서로 간주된다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63162/63162fig01.jpg"> 그림 1: 염증성 카스파제 및 카스파제-이분자 형광 보체 (BiFC) 분석. (A) 카스파제-BiFC 시스템을 나타낸 도면으로, 금성의 각 비형광 단편(Venus-C 또는 Venus-N)에 연결된 두 개의 카스파제-1 프로도메인(C1-pro)이 NLRP3 활성화 플랫폼으로 모집되어 금성이 재굴 및 형광을 갖도록 강제한다. 이 복합체는 현미경 하에서 녹색 반점으로 나타나며 개시제 카스파제 활성화의 첫 번째 단계 인 염증성 카스파제 유도 근접성에 대한 판독 역할을합니다. (b) 염증성 카스파아제 및 염증성 카스파제의 도메인 조직을 보여주는 개략도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63162/63162fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
특정 개시제 카스파제 활성화를 측정하는 것은 어렵고, 이미징 접근법에 의해 그렇게 할 수 있는 방법은 많지 않다. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)은 살아있는 세포에서 직접 염증성 카스파제 활성화를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다 (그림 1A)25. 이 기술은 최근 인간 단핵구 유래 대식세포 (MDM)21에서 사용하기 위해 적응되었다. 카스파제 BiFC는 염증성 카스파제 활성화의 첫 번째 단계를 측정하고, 이량체화를 촉진하기 위해 근접성을 유도한다. 광화성 황색 형광 단백질 금성 (Venus-C[VC]) 및 Venus-N[VN])의 비형광 단편에 융합된 CARD 함유 카스파제 프로도메인을 코딩하는 플라스미드의 발현이 사용된다. 두 카스파제 프로도메인이 그들의 활성화 플랫폼으로 모집되거나 유도된 근접성을 겪을 때, 금성의 두 반쪽은 근접하게 가져와 굴착 및 형광을 강요받는다(도 1A,B 참조). 이는 특정 염증성 카스파제 활성화의 실시간 판독을 제공한다.
인간 MDM은 위험 신호 및 병원체 생성물을 식별하는 인플라마솜 유전자와 패턴 인식 수용체를 풍부하게 발현한다. 이것은 염증성 카스파제 경로의 심문을 위한 이상적인 세포 유형을 제공한다. 또한, 이들은 말초 혈액 및 심지어 환자 샘플로부터 유래되어 특정 질병 상태에서의 염증성 카스파제 활성화를 평가할 수 있다. 이 프로토콜은 뉴클레오펙션을 사용하여 BiFC 카스파제 리포터를 MDM에 도입하는 방법, 전기천공 기반 트랜스펙션 방법, 염증성 카스파제 활성화를 유도하기 위해 세포를 치료하는 방법, 현미경 접근 방식을 사용하여 활성 카스파제 복합체를 시각화하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 이 방법론은 이들 복합체의 분자 조성, 아세포 국재화, 동역학, 및 이들 고도로 정렬된 구조의 크기(25,26,27)를 결정하도록 적응될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>48 웰 조직 배양2:34 플레이트</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-108</td><td></td></tr><tr><td>10cm 조직 배양 접시</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>2 메르캅토에탄올 1000x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>8 웰 챔버 커버 글라스, 1.5 HP 커버 글라스</td><td>Cellvis</td><td>c8-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS 컬럼</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-021-101</td><td>AutoMACS Pro Separator만 사용한 자동 분리</td></tr>용 <tr><td>AutoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-092-545</td><td>AutoMACS Pro Separator만 사용한 자동 분리용</td></tr><tr><td>AutoMACS Pro 세척 솔루션</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-092-987</td><td>AutoMACS Pro Separator만 사용한 자동 분리용</td></tr><tr><td>AutoMACS 헹굼 솔루션</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-091-222</td><td>AutoMACS Pro Separator를 사용한 자동 분리의 경우</td></tr><tr><td>버퍼를 실행하는 AutoMacs</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-091-221</td><td>QuadroMACS 또는 AutoMACS pro Separator를 사용한 수동 또는 자동 분리의 경우</td></tr><tr><td>CSU-X1A 5000 회전 디스크 장치가 장착된 Axio Observer Z1 전동 도립 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td>568nm(RFP) 및 488 또는 512nm(GFP 또는 YFP) 파장의 레이저 라인이 장착된 레이저 모듈이 장착된 모든 컨포칼 현미경을 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>568nm(RFP) 및 488 또는 512nm(GFP 또는 YFP) 파장을 자극할 수 있는 형광 필터가 있는 모든 상피 형광 현미경을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>CD14+ MICROBEADS</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-050-201</td><td>염화칼슘 및 염화마그네슘이 없는 QuadroMACS 또는 AutoMACS pro Separator DPBS를 사용한 수동 또는 자동 분리의 경우</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>DsRed mito plasmid</td><td>Clontech</td><td>632421</td>형<td>광 리포터로 사용할 수 있는 유사한 플라스미드는 Addgene</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS 6 x 100에서 찾을 수 있습니다. mL</td><td>Sigma</td><td>GE17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제 (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050079</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC2011</td><td></td></tr><tr><td>Hemin BioXtra, from Porcine, &ge; 96.0% (HPLC)</td><td>Sigma</td><td>51280-1G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td><td></td><td></td><td>LBH lab</td></tr><tr><td>LPS-EB Ultrapure</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-3PELPS</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-042-401</td><td>QuadroMACS 분리기를 사용한 수동 분리만</td> 가능</tr><tr><td>MACS 15 mL Tube Rack</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-091-052</td><td>QuadroMACS Separator only를 이용한 수동 분리용</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-042-303</td><td>QuadroMACS Separator 전용 수동 분리</td></tr>용 <tr><td>mCherry plasmid</td><td>Yungpeng Wang Lab</td><td></td><td>형광 리포터로 사용할 수 있는 유사한 플라스미드는 Addgene</td></tr><tr><td>Neon Transfection System에서 찾을 수 있습니다.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK5000</td>에는 <td>Neon electroporation 장치, 피펫 및 피펫 스테이션 Neon</td></tr><tr><td>Transfection System 10 &micro가 포함됩니다. L Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK1096</td>에는 <td>재부유 완충액 R, 재부유 완충액 T, 전해 완충액 E, 96 x 10 &micro; L 네온 팁과 네온 electroporation 튜브</td></tr><tr><td>Nigericin 나트륨 염, 기성품 솔루션</td><td>Sigma</td><td>SML1779-1ML</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P7280-5mg</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS 분리기</td><td>Miltenyi (Biotec)</td><td>130-090-976</td><td>수동 분리용 QuadroMACS 분리기 전용</td></tr><tr><td>qVD-OPh</td><td>Fisher (ApexBio)</td><td>50-101-3172</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen 2.6 (blue edition) 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td></td><td>선택한 컨포칼 현미경을 작동하는 데 사용되는 모든 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

염증성 카스파제는 카스파제-1, -4, -5, -11, 및 -12를 포함하고, 개시제 카스파제의 하위군에 속한다. Caspase-1은 염증 신호전달의 정확한 조절을 보장하기 위해 요구되며, 염증에 대한 모집 후 근접-유도된 이량체화에 의해 활성화된다. Caspase-1은 단핵구 세포 계보에 풍부하고, 전염증성 사이토카인인 인터루킨(IL)-1β 및 IL-18의 성숙을 활성 분비 분자로 유도한다. 다른 염증성 카스파제, 카스파제-4 및 -5 (및 이들의 뮤린 상동체 카스파제-11)는 피로옵토시스를 유도함으로써 IL-1β 방출을 촉진한다. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)은 카스파제 활성화의 판독으로서 염증성 카스파제 유도 근접성을 측정하는데 사용되는 도구이다. 인플라마좀에 결합하는 영역을 포함하는 카스파제-1, -4, 또는 -5 프로도메인은 카스파아제가 유도된 근접성을 겪을 때 형광성 복합체를 개혁하기 위해 연관되는 황색 형광 단백질 금성(Venus-N[VN] 또는 Venus-C[VC])의 비형광 단편에 융합된다. 이 프로토콜은 핵을 사용하여 이러한 리포터를 일차 인간 단핵구 유래 대식세포 (MDM)에 도입하고, 세포를 치료하여 염증성 카스파제 활성화를 유도하고, 형광 및 공초점 현미경을 사용하여 카스파제 활성화를 측정하는 방법을 설명합니다. 이러한 접근법의 장점은 살아있는 세포에서 염증성 카스파제 활성화 복합체의 성분, 요건 및 국소화를 확인하는데 사용될 수 있다는 것이다. 그러나 세포 생존력과 행동을 손상시키지 않도록 신중한 통제를 고려해야합니다. 이 기술은 인플라마솜 수준에서 동적 카스파제 상호작용을 분석하고 살아있는 MDM 및 인간 혈액 샘플로부터 유래된 단핵구에서 염증성 신호전달 캐스케이드의 심문을 위한 강력한 도구입니다.

도 2에 도시된 반응식은 인간 MDM을 수득, 형질감염 및 이미지화하는 방법에 대한 개요를 제공한다. 선택된 CD14+ 단핵구를 GM-CSF로 7일 동안 인큐베이션한 후, 분화 기간에 걸쳐 세포 형태가 변화하고(도 3A), 구형 현탁액 세포로부터 스핀드하고 완전히 부착되는 과정(제3일 및 제4일), 마지막으로 완전히 분화되었을 때 세포를 더 많이 퍼뜨린다(제7일째). 완전히 분화된 세포는 이어서 플레이트로부터 분리되고 카스파제 BiFC 쌍 (VC 및 VN)과 함께 리포터 플라스미드 (예를 들어, dsRedmito, 미토콘드리아를 표적화하는 적색 형광 단백질을 코딩하는 플라스미드)로 형질감염되고, 이는 형질감염된 세포를 표지하는데 사용되고(도 3B), 24시간 후에 형질감염의 효율을 평가하기 위해 사용된다. 도 3B-D</st...

이 프로토콜은 인간 혈액 샘플로부터 단핵구 유래 대식세포 (MDM)를 얻는 워크 플로우, 세포 생존력과 행동을 손상시키지 않고 염증성 카스파제 BiFC (BiFC) 리포터를 인간 MDM에 효율적으로 도입하는 간단한 방법, 살아있는 세포에서 염증성 카스파제 활성화를 측정하기위한 이미징 기반 접근법을 설명합니다.

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

이 프로토콜은 특정 질병 상태의 살아있는 세포에서 분자 수준에서 염증성 카스파제 경로를 시각화하고 심문하는데 사용될 수 있기 때문에 중요하다. 이 기술의 주요 이점은 원발성 면역 세포에서 염증성 카스파제 활성화 복합체의 성분, 요건 및 국소화를 확인하는데 사용될 수 있다는 것이다. 사소한 최적화를 통해이 방법은 다른 일차 세포 및 올리고 머화에 의해 활성화 된 다양한 단백질에 적응할 수 있으며 그 적용 가능성은 현미경 방법론에 국한되지 않습니다.먼저, 완전히 분화된 대식세포로부터 배지를 10센티미터 접시에 흡인하고, 따뜻한 무혈청 RPMI-1640 배지로 세포 단층을 세척하여 모든 배지를 완전히 제거한다. 10 센티미터 접시 당 0.25 % 따뜻한 트립신-EDTA 용액 2 밀리리터를 첨가하여 세포를 수확하십시오. 트립신-EDTA를 P-1000 마이크로피펫으로 접시 전체에 걸쳐 위아래로 부드럽게 피펫한 다음, 현탁액을 5밀리리터의 따뜻한 완전한 배양 배지가 들어있는 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.밝은 현장 현미경으로 세포 분리가 있는지 확인하고 필요한 경우 다시 분리하십시오. 배지를 흡인하고, 세포를 섭씨 37도까지 미리 가온된 1X 멸균 PBS의 10 밀리리터에 재현탁시킨다. 그런 다음 혈구계를 사용하여 세포 수를 결정하기 위해 20 마이크로 리터 분취량을 취하십시오.형질감염 당 다섯 번째 세포에 10 ~ 두 번 복용하여 15 밀리리터 튜브에 넣으십시오. 미리 예열된 1X 멸균 PBS로 15 밀리리터의 최종 부피로 가져 오십시오. PBS를 흡인하고 250 x g에서 1분 동안 한 번 더 원심분리한다.P-200 마이크로피펫을 사용하여 세포 펠릿으로부터 임의의 잔류 PBS를 제거하였다. 형질감염 당 1.5밀리리터 멸균 마이크로튜브를 취하고, 적절한 리포터 플라스미드 및 카스파제 BiFC 플라스미드를 후드에 첨가한다. 피펫 스테이션, 장치, 팁, 전기 천공 튜브 및 피펫을 멸균 층류 후드에 놓습니다.핵 형성 장치를 연결하고 켭니다. 표시된 시작 화면에 transection 매개 변수를 입력합니다. 전압을 누르고 1000을 입력 한 다음 완료를 눌러 1000V로 설정하십시오.Width를 누르고 40을 입력한 다음 Done을 눌러 펄스를 40밀리초로 설정합니다. 마지막으로 펄스를 누르고 2를 입력 한 다음 완료를 눌러 전기 펄스 수를 2로 설정하십시오. 전기 천공 튜브 중 하나를 가져 와서 실온에서 세 밀리리터의 전해 버퍼 E로 채 웁니다.전기 천공 튜브를 피펫 스테이션의 피펫 홀더에 삽입하여 튜브 측면의 전극이 안쪽을 향하고 튜브를 삽입할 때 클릭 소리가 들리도록 합니다. 세포 펠릿을 취하고, 다섯 번째 세포에 각각 10 내지 2회 동안 10 마이크로리터의 미리 가온된 재현탁 R 완충액을 첨가하고, P-20 마이크로피펫으로 부드럽게 혼합한다. 10 마이크로리터의 세포 현탁액을 각 형질감염 튜브에 첨가하고 P-20 마이크로피펫으로 부드럽게 혼합한다.푸시 버튼을 두 번째 스톱으로 눌러 팁을 피펫에 삽입하여 클램프가 팁에 있는 피스톤의 장착 스템을 완전히 집어 들도록 합니다. 다음으로, 피펫의 푸시 버튼을 첫 번째 정지로 누르고 세포 또는 플라스미드 DNA 혼합물을 함유하는 첫 번째 튜브에 담그고 샘플을 흡인시킨다. 샘플이 있는 피펫을 피펫 홀더에 매우 조심스럽게 삽입하여 피펫이 딸깍 소리가 나고 적절하게 배치되도록 합니다.터치 스크린에서 시작을 누르고 전기 펄스가 전달될 때까지 기다립니다. 역에서 피펫을 천천히 제거하고, 첫 번째 정지에 푸시 버튼을 천천히 눌러 미리 가온된 항생제가 없는 배지와 함께 상응하는 웰에 횡단된 세포 현탁액을 즉시 첨가한다. 형질화된 세포로 플레이트를 부드럽게 락하고 가습된 조직 배양 배양기에서 한세 시간 동안 배양한 다음, 200 마이크로리터의 미리 가온된 배양 배지를 각 웰에 첨가한다.접시를 인큐베이터에 놓고 유전자 발현을 위해 적어도 24 시간을 허용하십시오. 다음날, 에피형광 현미경을 이용하여 세포 생존율 및 형질감염 효율을 검사한다. P-1000 마이크로피펫으로 세포에서 배지를 조심스럽게 제거하고 500 마이크로리터의 자극 용액을 웰 옆으로 떨어뜨립니다.처리되지 않은 제어 웰을 실행하려면 자극이 없는 이미징 배지를 추가합니다. epifluorescence 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포를 시각화하려면 지침에 따라 현미경과 형광 광원을 켭니다. 10 배 또는 20 번 목표를 선택하고 배양 접시를 현미경 단계에 놓습니다.아이피스가 있는 568나노미터 필터 아래에서 세포를 찾습니다. 그리고 리포터 적혈구를 발현하는 세포에 초점을 맞춘다. 시각적 필드의 모든 빨간색 셀을 계산합니다.동일한 시각적 필드에 있는 동안 488 또는 512 필터로 변경하면 빨간색 셀 수가 녹색이기도 합니다. 최소 세 개의 필드로 구성된 최소 100개의 빨간색 셀을 계산합니다. 시야당 금성 양성 형질도입 세포의 백분율을 계산하고, 표준 편차를 얻기 위해 각 치료 웰에 대한 결과 백분율을 평균화한다.후광성 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포를 이미지화하려면 카메라에 의해 획득 된 것처럼 컴퓨터 화면에서 세포의 라이브 이미지를 시각화하십시오. 조이스틱 컨트롤과 포커스 휠을 사용하여 셀의 초점과 위치를 미세 조정합니다. 512 나노미터 또는 488 나노미터 및 568 나노미터 레이저에 대한 백분율 레이저 전력 및 노출 시간을 설정하여 이미지의 신호가 채도 없이 양호하게 보이도록 합니다.라이브 캡처를 켜고 결과 이미지를 검사하여 두 채널의 디스플레이 히스토그램에서 각 층에 대해 뚜렷한 피크가 표시되는지 확인합니다. 세포의 라이브 이미지를 시각화하면서, 플레이트의 각 웰에 대해 mCherry 또는 dsRedmito 리포터를 발현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 필드의 다수의 대표적인 이미지를 취한다. 7일 동안 GM-CSF와 함께 배양된 선택된 CD-14 양성 단핵구는 분화 기간 동안 세포 형태학의 변화를 나타냈으며, 구형 현탁액 세포로부터 스핀드되고 완전히 부착되고, 마지막으로 완전히 분화되었을 때 더 많은 확산 세포로 이동하였다.완전히 분화된 세포를 리포터 플라스미드 dsRedmito와 함께 카스파제 BiFC 쌍 VC 및 VN으로 형질감염시키고, 이를 트랜스펙트된 세포를 표지하는데 사용하였다. 처리되지 않은 세포는 금성 형광을 나타내지 않았다. 니게리신 처리된 세포에서, 카스파제-1 BiFC는 ASC 스펙크의 전형적인 형태를 갖는 단일 누점으로 나타났다.금성 양성 MDM의 정량화는 카스파제-1 BiFC의 가장 높은 비율이 LPS 플러스 니제리신 처리군에서 보여지는 것으로 나타났다. 카스파제-1, 4, 및 5개의 pro-BiFC 쌍의 플라스미드 적정에서, 금성-양성 세포의 가장 높은 비율은 각각 400, 500 및 1, 000 나노그램의 형질감염된 플라스미드로부터 유래하였다. 횡단 후 24시간 동안 세포 필드의 20배 객관적으로 얻어진 공초점 이미지는 미토콘드리아가 손상되지 않은 상태로 처리되지 않은 형질화된 세포가 생존 가능하다는 것을 보여주었다.헴으로 치료 한 후, 카스파제-1 복합체는 니게리신에 의해 유도 된 것과 유사한 단일 녹색 누점으로 나타납니다. 분화, 형질감염 및 치료 동안 세포의 가혹한 조건과 과도한 조작을 피해야 자발적 활성화와 높은 배경 수준의 카스파제 활성화를 초래할 수 있으므로 주의해야 합니다.

visualization-inflammatory-caspases-induced-proximity-human-monocyte

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

내피 Ca2 + 신호의 paracrine 파생 ROS 유도를 시각화에 대한 통찰력을 얻기 위해 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 공동의 문화 모델에서 혈관 내피 세포의 Ca2 +의 동원을 촉발 paracrine 파생 ROS 측정을 활용합니다.

혈관 CA의 시각화 2 + Paracrine 유래 ROS에 의해 트리거된 신호

이 비디오는 이분자 형광 보완 리포터 단백질을 사용하여 인간 대식세포에서 카스파아제 단백질의 활성화를 보여줍니다. 카스파제-1의 프로 도메인은 비너스 단백질의 비형광 단편과 융합되며, 이 단백질은 인플라마솜 복합체에 동원됩니다. 인플라마솜의 근접성은 금성 단편의 재접힘과 형광을 유도하여 대식세포에서 카스파아제 활성화를 확인합니다.

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

이 비디오는 형광 리포터 프로브를 사용하여 대식세포에서 NLRP3 인플라마솜 활성화를 감지하는 방법을 보여줍니다. 세포는 인플라마솜 조립 및 카스파제-1 활성화를 유도하기 위해 칼륨 이오노포어와 글리신으로 처리됩니다. 형광 리포터 프로브는 활성화된 카스파제-1을 시각화하고 세포는 핵 시각화를 위해 형광 염료로 염색됩니다.

Fluorescence Microscopy를 통한 Inflammasome 활성화 검출

이 동영상은 면역형광을 통해 일차 대식세포에서 NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) 인플라마솜 형성을 연구하는 기술을 보여줍니다. 대식세포는 먼저 NLRP3 단백질 발현을 상향 조절하기 위해 박테리아 지질다당류(LPS)로 프라이밍됩니다. 대식세포를 칼륨 이오노포단인 니게리신(nigericin)에 노출시키면 NLRP3가 활성화되고 인플라마좀(inflammasome)이 형성되며, 이는 면역형광을 통해 시각화됩니다.

대식세포에서 인플라마솜 복합체 형성을 연구하기 위한 시험관 내 기술

이 비디오는 인플루엔자 바이러스를 자극하여 골수 유래 대식세포에서 여러 카스파아제 활성화를 평가하는 방법을 보여줍니다. 대식세포 용해, 용해물의 열 불활성화 및 원심분리 후 후속 면역학적 분석을 위해 세포 내 카스파제를 수집합니다.

대식세포에서 다중 카스파제의 활성화에 대한 평가

이 프로토콜은 높은 세포 활력과 분화 및 편광에 대한 완전한 식세포 용량을 유지하면서 높은 형질 전환 효율로 전기 천공에 의해 또는 siRNA의 플라스미드 DNA와 함께 인간 대 식세포 THP-1을 형질 효율적이고 신뢰할 수있는 방법을 제시한다.

Nucleofection에 의해 인간의 THP-1 대 식세포의 고효율 형질

이 프로토콜 설명 caspase 분자 형광 보완성 (BiFC); 그들의 활성화에 있는 첫걸음은 초기자 caspases의 유도 근접을 시각화 하는 데 사용할 수는 영상 기반 방법입니다.

Caspase 활성화 분자 형광 보완성을 사용 하 여 경로를 조명

형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 및 활성 caspase-1와 어댑터, ASC에 대 한 얼룩 세포질 기준 NLRP3 inflammasome 활성화의 탐지를 설명 합니다. 젖 산 효소 자료 분석 결과 인구 기준 pyroptotic 세포를 감지 하 여. 이 기술은 inflammasome 생물학의 여러 측면을 연구 적응 될 수 있다.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

여기는 마우스 주민 복 막 대 식 세포에 의해 회전 디스크 confocal 현미경 이미지 단일 phagocytic 이벤트를 사용 하 여 방법에 설명 합니다. 프로토콜은 다른 phagocytic 세포를 확장할 수 있습니다.

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

이 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내 (마우스내) 감염, 무균 손상 및 암 모델 모두에 대한 반응으로 카스파제 활성화(카스파제-1, 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-11)를 평가하여 파이롭토시스, 세포자멸사, 괴사 및 PANoptosis와 같은 세포 사멸 경로의 개시를 결정합니다.

선천면역세포사멸을 평가하기 위한 카스파아제 활성화 평가

본 프로토콜은 유동 세포분석 또는 분광형광계를 사용하여 형광 기질을 통해 카스파아제 활성을 측정하는 두 가지 방법을 설명합니다.

형광 분석 또는 유세포분석을 사용한 카스파제 활성 측정

학습하세요 인간 단핵구 유래 대식세포에서 BiFC 기법을 이용한 염증성 카스파제 활성화 시각화 방법을. 이 프로토콜은 살아있는 세포에서 분자 수준의 면역 반응 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화

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