Name: 뮤린 오비덕트의 미세 절제 및 해리: 개별 세그먼트 식별 및 단일 세포 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 배우세요 생식생물학 연구를 위한 뮤린 난관 미세 절제 및 비효소적 세포 해리 방법. 개별 세그먼트 식별과 단일 세포 격리를 통해 RNA 품질을 보존하며 체외수정 기술 개선에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425)에 대한 DoD 획기적인 상에 의해 부분적으로 지원되었다. KCR은 교내 펠로우십에 의해 부분적으로 지원되었다: Pease 암 전 박사 과정 펠로우십과 메리 갈빈 부담 생물 의학 과학 및 캘리포니아 대학, 리버 사이드, 교내 상에서 박사 전 펠로우십: 대학원 위원회 펠러십 위원회 논문 연구 보조금 및 대학원 부문 논문 연도 프로그램 상. 저자는 길리안 M. 라이트와 알리사 M. 쿠마리에게 이 방법의 초기 문제 해결에 도움을 준 것에 대해 감사드립니다.

모든 동물 취급 및 절차는 캘리포니아 대학, 리버사이드 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되고 실험실 동물 관리를 위한 미국 협회, 미국 농무부 및 건강의 국가 학회에서 지침에 따라 이었습니다. 설명된 방법은 C57BL/6 성인, 여성 마우스를 활용하였다. 모든 동물은 조직 수확 전에 참수에 의해 안락사되었다.
참고: 파란색 염료를 사용하여 배반의 효율적인 해부 및 코일링을 지원하는 프로토콜에 대한 개요가 첫 번째 그림(그림 1)에 표시됩니다.
<img alt="난관 구조: 온전한, 염색, 난소 제거 후; 누두부, Ampulla, 협부 다이어그램으로 풀립니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63168/63168fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 미세 절제 방법의 개요입니다. (A) 왼쪽 패널은 난소 지방 패드의 대부분과 난소를 둘러싼 결합 조직의 잔재가 제거된 그대로 구조를 나타낸다. 그 후, toluidine 블루의 추가는 oviduct (중간 패널)의 코일을 구별하는 데 도움이됩니다. 오른쪽 패널은 난소를 제거 한 후 구조를 보여줍니다. (B) 각 세그먼트가 시작되고 끝나는 위치를 결정하기 위한 내부 회전이 있는 코이징 되지 않은 배반입니다. (C) 사용되는 세분화의 만화 (확장에 그려지지 않음). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63168/63168fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
1. 해부 표면의 준비
<ol><li>접착제와 페트리 접시에 치과 왁스 조각을 부착하고 건조하게 (그림 2A). 70%의 에탄올로 접시를 소독합니다. 서피스는 해부할 준비가 되어 있습니다.</li>
</ol>2. 난소, 난소 및 자궁의 매크로 절
<ol><li>선단 현미경하에서 치과 왁스를 포함하는 페트리 접시를 냉장 플랫폼(예: 사용하기 전에 -20°C에 보관한 얼음 팩)을 해부(그림 2A)에 사용할 준비가 되면 정차합니다.</li>
	<li>동물의 복부 표면을 70%의 에탄올로 소독합니다. 멸균 해부 가위로 복부와 골반 구멍을 열고 위장관을 한쪽으로 이동하여 등쪽 양혼 자궁을 찾습니다. 각 자궁 뿔을 따라 신장 바로 아래에 있는 자궁 지방 패드에 둘러싸인 각 난소와 난소를 찾습니다(그림 2B, C).</li>
	<li>난소와 말단 배관의 일부를 모두 절제 된 가위를 사용하여 부착. 각 측면 자궁 경적을 코일 난기와 난소에 부착된 뿔의 약 1-2cm로 자릅니다(도 2D). 차가운 해부 배지의 2mL에 즉시 조직을 침수 ( 재료의 표 참조).</li>
</ol><img alt="IVF 절차의 콜드 플랫폼 설정; 바늘, 페트리 접시 다이어그램; 난소 구조 그림." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63168/63168fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 난소 및 해부 설정의 매크로 절제. oviduct는 난소 지방 패드 (B) 내신장의 기지에서 골반 구멍에 등등으로 위치하고 있습니다. 골반 구멍(C)에서 자궁 분비를 찾아 내고 측면 자궁 경적을 따라 자궁-oviduct-난소 연속체(B)를 찾습니다. 하나의 자궁 경적과 거친 해부를 절단하여 이러한 구조를 제거합니다. 해부 플랫폼(A)에 놓고 자궁 부분을 바늘(A 및 D)으로 치과 용 왁스에 부착합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63168/63168fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
참고: 충분한 자궁 경적을 그대로 두고 배부 플랫폼에 부착할 수 있도록 배분에 부착합니다(그림 2D).
<ol start="4"><li>자궁 조직을 멸균 25 G 바늘로 치과 왁스에 부착하여 해부 조직을 확보합니다(도 2A, D 및 도 3A). 해부 현미경하에서 작업, 깨끗 하 고 난소 지방 패드와 결합 조직을 멀리 해부 oviduct의 명확한 시각화를 허용 (그림 3B).</li>
</ol><img alt="난관 해부 공정도; 난소, 자궁 뿔, 누두, 팽대부 식별을 포함합니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63168/63168fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: 단계별 oviduct 미세 절제. 잔재 지방 및 결합 조직 (A,B)을 제거 한 다음, 조직 (C)에 toluidine 파란색을 추가 한 다음 난소의 시각화 및 후속 제거및 튜브 (D-H)의 제거를 용이하게합니다. 인펀디불룸은 근위 협소와 자궁관 접합부(UTJ) 옆에 있습니다. 메소살핀스를 절단하는 동안 탈단 끝을 가볍게 당기고 굴(H)의 내인성 회전을 적절한 세분화를 위해 방향을 드러냅니다. 그림 A-C 스케일 바 = 500 μm, D-H 스케일 바 = 400 μm (I) 다양한 세그먼트의 만화 (스케일에 그려지지 않음). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63168/63168fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="5"><li>1 mL 주사기를 사용하여, 1-2 방울의 멸균 1 % 톨루이딘 블루 염료 용액으로 자궁에 부착 된 oviduct를 30 s-1 분 동안 배양한다. 차가운 덜벡코의 인산완충식염(DPBS)으로 헹구고 모든 액체(그림 3C)를 제거합니다.</li>
	<li>코일 난소에서 난소를 가볍게 당기고 관 조직을 손상시키지 않고 oviduct에서 난소를 제거하기 위해 활액막과 넓은 인대에서 잘라냅니다 (그림 3D, E). 참고 : 난소는 oviduct에 부착되지 않지만 oviduct (도 2D)와 bursal 막에 싸여 넓은 인대를 통해 자궁의 측면에 연결됩니다.</li>
</ol>3. 마이크로 디스섹션 및 배반의 세분화
<ol><li>자궁 관 접합 (UTJ)에 측면 발견 oviduct의 탈, fimbrial 끝을 찾습니다. oviduct 는 그 자체로 다시 코일; 따라서 피모브리알 끝은 근해 끝에 측면으로 위치할 수 있으며, oviduct의 코일링을 위한 방향을 지정하는 적절한 출발점입니다(그림 3F,I).<ol>
<li>튜브를 부드럽게 당기면서, 메소살핀스(그림 3I)에서 스프링 형태의 마이크로 가위를 잘라 배란을 풀게 합니다(그림 3G).</li>
	</ol>
</li>
	<li>일단 코이알이 생기지 않고 튜브를 잘라 내어 빈약하고, 암풀하고, isthmic 영역을 생성한다(그림 3H).<ol>
<li>인펀드티불룸(fimbrial end 및 근위 줄기)을 절제한 후, 튜브의 두 번째 눈에 띄는 회전 후 절단하여 암풀 영역을 소비합니다(2번과 3번, 길이 약 1cm 사이 절단). 마지막으로, 나머지 부분을 ISthmic 영역인 UTJ로 잘라냅니다(그림 3H). 참고: 배반은 완전히 직선 구조로 코일되지 않습니다. 튜브는 회전을 유지합니다 (그림 3H)3. 암풀 리전 다음후속 회전에 기초하여, 하나는 남은 튜브를 암풀-협합 및 isthmus3로 더 세분화할 수 있다. 암풀라 절제 후, 암풀리-isthmic 접합을 얻기 위해 5~6회전 사이를 잘라; 나머지 튜브(UTJ의 시작까지 6회전)는 isthmus3이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA 절연을 위해 액체 질소에서 해부된 조직 세그먼트를 즉시 스냅하거나 지향적인 임베딩 및 면역 조직 분석을 위해 각 세그먼트를 수정하고 처리합니다.<ol>
<li>RNA 추출 시약200 μL과 1:1 균질화 비드 믹스( 재료 표 참조)를 RNA 추출을 진행하면 조직에 추가합니다(5.1단계 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 오비덕트 해리
<ol><li>3.1.1 단계에서 계속) 상피의 최적의 해리를 위해, 슬릿은 가능한 한 영역(즉, fundibulum 및 ampulla)에서 난소를 열어 발광 상피(그림 4A)를 노출한다.</li>
</ol><img alt="나팔관 단면도, 상피 샘플 추출, 해부 설정, 실험실 장비." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63168/63168fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: Oviduct 세포 해리, 1부. 최적의 세포 해리(A)를 위해 해실 상피를 노출하는 방법과 1mm2 메쉬(B)를 가장 쉽게 사용하는 방법을 보여주는 이미지를 보여주는 만화. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63168/63168fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="1" style="margin-left: 40px;"><li>피프브리알 지역에서 시작하여 집게를 레버리지로 사용하여 스프링 형태의 가위로 튜브를 세로로 슬릿합니다.</li>
</ol><ol start="2"><li>슬릿 열린 부분과 나머지 oviducts를 세그먼트(크기 1-2mm)로 다진 다음 5mL의 따뜻하고 비 효소 적 해리 버퍼( 재료 표 참조)를 추가하고 37°C에서 배양합니다.<ol>
<li>조직 조각과 전구 피펫으로 3 분마다 9-10 분 동안 분리 된 세포를 다시 중단하십시오. 차가운 해부 배지로 해리 버퍼 1:1을 희석합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원심분리(350xg, 3분, 4°C)로 세포를 수집한다. RBC 용해 버퍼2mL에서 세포를 실온에서 2분 동안 재연한 다음 냉부 배지로 1:1을 희석시 보입니다.</li>
	<li>원심분리(350xg, 3분, 4°C)로 세포를 수집하고 5mL의 냉간 pronase 용액으로 재연한다.<ol>
<li>pronase 소화 매체에서 배양하고 단일 셀 현탁액이 달성 될 때까지 3-5 분마다 전구 파이펫으로 세포 덩어리를 다시 분리합니다 (~25-30 분). 참고: 이 단계는 pronase에 불필요한 과다 노출을 방지하는 일정한 관측을 허용하기 위하여 조직 배양 판 또는 플라스크에서 가장 잘 수행됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>멸균 매크로 메시(고무 대역(그림 4B)가 있는 원적 튜브에 부착된 1mm x 1mm 메쉬)를 통해 세포를 통과하여 남은 비소 조직 조각을 제거합니다. 원심분리(350xg, 3분, 4°C)로 세포를 수집하고 다운스트림 분석에 적합한 냉기 에서 재보설(예: 유동 세포측정을 위한 염색을 진행하는 경우 FACS 버퍼).</li>
</ol>5. oviductal 세그먼트의 RNA 추출
<ol><li>스테인레스 스틸 비드 믹스를 사용하여 4°C에서 2개의 간격(각 3분)에 대해 12레벨에 있는 비드 탄환 블렌더 조직 균질화에서 RNA 추출 시약의 200 μL에서 스냅 냉동 샘플을 균질화한다. 참고: RNA 무결성을 보존하기 위해 샘플은 스냅 냉동 상태에서 RNA 추출 시약으로 즉시 이동해야 하며 계량하지 않아야 합니다.</li>
	<li>상온에서 약 5초 동안 상온에서 약 5초 동안 탁상 원심분리기에서 100-200 x g 의 원심분리기 균등하게 하여 액체를 구슬과 분리합니다. 상체를 신선한 튜브로 옮기.</li>
	<li>더 많은 샘플을 복구하기 위해 비드에 RNA 추출 시약의 또 다른 200 μL을 추가하고 원심 분리 (100-200 x g, 5 s, 실온)가 뒤따릅니다. 슈퍼네티츠를 결합합니다. 참고: 작은 파이펫 팁(대부분의 p200 팁이 적합)을 사용하여 상퍼를 제거할 때 비드 이월을 방지합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침을 따라 분리 및 침전 RNA를 단계화하십시오. 대표적인 샘플은 -20°C에서 100% 이소프로판올(약 2:1 부피, 이소프로파놀: 수성상 회복)으로 하룻밤 사이에 침전되었다.</li>
	<li>9,500 x g에서 30s에 대한 RNA 결합 스핀 컬럼 및 원심분리기로 용액과 함께 완전한 RNA 침전을 전달 한다. 제조업체의 지침에 따라 RNA 온컬럼을 정화한 다음 핵이 없는 물의 20 μL에서 RNA를 유동합니다. 마이크로 볼륨 분광광계 및/또는 생체 분석기의 품질/양을 평가합니다.</li>
</ol>

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</ol>

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oviduct의 세 세그먼트는 조직학적으로, 형태학적으로, 및 기능적으로 구별1,2,3이다. 상피는 oviduct의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝까지 크게 다릅니다. Ciliated 세포는 fimbrial/fundibular 끝에 지배, 분비 세포는 isthmic 지역에서 지배 하는 동안1. 이 전반적인 그라데이션은 한동안 인정되었지만, 최근 연구는 oviductal 세그먼트 중 더 많은 구별을 발견했습니다. 따라서, 모온 세포가 관의 근위쪽 끝으로 덜 빈번해지는 동안, 암풀라에서 암풀리-isthmic 접합3로 이동하는 그들의 수(약 60%에서 10% ciliation)의 급격한 하락이 있다3. 또한, 근위 및 탈산 세그먼트에서 상피 세포 집단은 발달적으로 구별되는 계보<sup cla...

뮤린 배관은 인간 나팔관1과 기능 및 형태학에서 유사합니다. 둘 다 역사적으로 설명된 두 개의 상피 상피 상피 세포로 구성된 의사 섬광 상부로 구성됩니다: 양모 세포 및 분비 세포1,2. oviduct는 세 가지 고전적으로 인식 세그먼트가 있습니다 : fundibulum, 암풀라, 그리고 isthmus. 최근 연구에서, 하와카르 외. 3 7개의 명백한 인구로 상피 세포의 분류의 확장으로 이끌어 내는 oviduct 형태학 및 유전자 발현을 조사했습니다. 또한, 그들은 oviduct3의 뚜렷한 세그먼트로 ampullary-isthmus 접합을 설립했다. 본 명세서에서 기재된 방법은, 농가, 암풀라 및 isthmus에 초점을 맞추고, ampullary-isthmic 접합뿐만 아니라 2,3을 포함하도록 쉽게 확장될 수 있었다. 기금 부족 영역은 오시덕트의 오스티움 또는 개방을 포함하고 있으며, 근접 줄기뿐만 아니라 피모브리알 영역을 포함한다. 자궁쪽으로 이동, 다음 암풀라, 그리고 isthmus입니다. Ciliated 세포는 이 지역의 단부 끝에서 가장 두드러지며, 난소에 근접하거나, 또는 fundibulum이 있는 반면, 분비 세포는 근위 말쪽 또는 isthmus 세그먼트1에서 가장 두드러집니다. 인간 나팔관과는 달리, 뮤린 배관은 메소살핀스, 넓은 인대 복막1,4의 연장에 의해 지원되는 코일 구조입니다. 또한, 마우스 oviduct는 oviduct4로 oocyte 전송의 가능성을 증가 bursal 낭에 싸여있다. 암풀라는 자궁5에 들어가기 전에 개발 배아가 isthmus로 통과하는 수정의 위치로 확인됩니다. 관 세그먼트는 직경 200-400 μm이고 더 긴 ampullary 및 isthmus 영역은 길이가 약 0.5-1.0cm입니다4. oviduct는 에스스트라이스트 사이클 동안 불협화음과 암풀라와 인펀드티불룸은 isthmus1보다 더 현명하지 못합니다.
세포의 증식, 특히 분비 세포는 골반 구멍에서 발견되는 장종양에 전구체 병변을 특성화합니다6. 이러한 전구체 장피상피성 병변은 피모브리알 영역에서만 난소 상피에서 발생합니다. 병변 형성이 일반적으로 우세한 세포 유형이 분모가 아닌 분비2,7,8이 되는 이 부위로 제한되는 이유는 알려지지 않았다. 정상적인 생리적 기능 측면에서 지역성은 난소암의 난소 기원에 대한 관심이 높아졌을 뿐만 아니라, 난소암의 분비성 기원에 대한 관심이 높아지고 있다9,10,11,12,13, 난소 세그먼트의 별도 평가의 중요성을 강조한다.
여기서 설명된 방법은 분할 특이적 유전자 발현 및 해리된 세포의 기능의 후속 다운스트림 분석을 위한 별도의 배반 세그먼트의 수집을 자세히 설명합니다. 전통적으로, 많은 조직은 페놀에 따라 전체 RNA 추출을 위해 처리됩니다: 클로로폼 방법 또는 온컬럼 완전 추출 방법; 그러나, 우리는 RNA 품질이 설명된 조합 방법으로 충분한 수율을 생성하는 동안 유지되었다는 것을 것을을 발견했습니다. 이 방법을 활용하면, oviduct의 매우 작은 기능 세그먼트는 서로 다른 세그먼트를 대표하는 결과를 마스크 할 수있는 전체 oviduct을 조사하는 대신 다운스트림 분석을 위해 처리 될 수있다14.
해리된 뮤린 오비덕탈 세포는 이 조직에서 세포 수율을 제한하기 때문에 혈류 세포측정에 의해 거의 조사되지 않았습니다. 이 문제를 극복하기 위한 한 가지 접근법은 세포를 해리화하고, 배양에서 성장한 다음, 다운스트림 세포 분석을 위한 적절한 세포 수를 얻기 위해 시험관에서 재분화를 자극하는 것입니다15,16,17,18. 이 접근법에 대한 제한은 배양에서 전 생체 및 변경 된 미세 환경이며, 둘 다 유전자 발현을 바꿀 가능성이 있습니다. 또한 형태학적 재분화가 그대로 동물에 존재하는 것과 동일한 전사 및 프로테오믹 시그니처를 가지고 있다는 가정도 있습니다. 현재 해리 방법은 단일 세포 분화를 유지하면서 이성수 배반 세포 집단에서 가장 많은 상피 세포를 달성하도록 설계되었습니다. 추가, 대부분 비 효소 접근은 가능성이 세포 표면 단백질의 손실을 제한.

<table><tbody><tr><td>0.5mm 스테인리스강 비드 믹스</td><td>Next Advance</td><td>SSB05</td><td>Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized</td></tr><tr><td>1.4 mm Stainless steel bead mix</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td>Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized</td></tr><tr><td>1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td>Cold, sterile</td></tr><tr><td>25G needle</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>60mm 멸균 페트리 접시</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m 세포 메쉬</td><td>Fisherbrand</td><td>22-636-548</td><td></td></tr><tr><td>애질런트 진핵 생물 총 RNA 6000 피코 칩 키트</td><td>애질런트 2100 생물 분석기</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>비드 총알 블렌더 조직 균질화 기</td><td>다음 사전</td><td>BBY24M</td><td></td></tr><tr><td>Bioanlyzer</td><td>애질런트 2100 생물 분석기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>감기 플레이트/팩/선택한 표면</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>-20 &#176으로 유지; C 해부용</td></tr><tr><td>치과 왁스</td><td>Polysciences Inc.</td><td>403</td><td></td></tr><tr><td>둘베코 의 변형된 독수리' s 미디엄 (DMEM)/햄 ' s F12</td><td>Corning</td><td>10-090-CV</td><td>해부 매체 준비: DMEM/ Ham' s F12, 10% FBS, 25mM Hepes, 1% Pen-Strep</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Corning</td><td>35-015CV</td><td></td></tr><tr><td>선택한 미세 포인트 겸자</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G712b</td><td>면역세포화학적 검증 이미지</td></tr><tr><td>염소 항-마우스 IgG Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td>면역세포화학적 검증 이미지</td></tr><tr><td>염소 항-토끼 IgG Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>면역세포화학적 검증 이미지</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H-3784</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4082S</td><td>면역세포화학적 검증 이미지</td></tr><tr><td>도립 복합 현미경</td><td>Keyence BZ-X700</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 마우스 Occludin</td><td>Invitrogen</td><td>33-1500</td><td>면역세포화학적 검증 이미지</td></tr><tr><td>비효소 해리 완충액</td><td>N/A</td><td></td><td>5 mM EDTA, 1 g/L 포도당, 0.4% BSA, 1X DPBS</td></tr><tr><td>나일론 매크로 메쉬 1 mm x 1 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>1210U04</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-6148</td><td>면역세포화학적 검증 이미지</td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>MP Biomedicals</td><td>10220-718</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade</td><td>Reagent Cell Signaling Technologies</td><td>9071S</td><td>면역세포화학적 검증 이미지: 페이드 방지 마운팅 배지</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10165921001</td><td>프로나제 분해 배지 준비: DMEM/Ham의 F12에서 0.15% 프로나제, 멸균</td></tr><tr><td>프로피듐 요오드</td><td>Roche</td><td>11 348 639 001</td><td>생존력 검증 이미지</td></tr><tr><td>토끼 안티 마우스 아세틸화-튜불린</td><td>Abcam</td><td>ab179484</td><td>면역세포화학 검증 이미지</td></tr><tr><td>RBC 용해 완충액</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>텍스트의 온컬럼 정제에 활용</td></tr><tr><td>스프링 형태 현미해부 가위</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5610</td><td></td></tr><tr><td>멸균 3mL 전구 피펫터</td><td>Globe Scientific</td><td>137135</td><td></td></tr><tr><td>톨루이딘 블루</td><td>Alfa Aesar</td><td>J66015</td><td>준비 톨루이딘 블루 용액 : 1X DPBS, 멸균</td></tr><tr><td>Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)</td> <td>N / A</td> N <td>/ A</td><td>면역 세포 화학 검증 이미지; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1 % 트윈 20</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Mallinckrodt Inc.</td><td>3555</td><td>면역세포화학적 검증 이미지</td></tr><tr><td>Trizol RNA 추출 시약</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>RNA 추출 시약이라고 합니다. Nucelase-free 물, 클로로포름 및 이소프로포날은 제조업체의 지침에 따라 Trizol 추출을 수행하기 위해 필요합니다</td></tr></tbody></table>.

뮤린 오비덕트의 미세 절제 및 해리: 개별 세그먼트 식별 및 단일 세포 격리

Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

마우스 모델 시스템은 유전적 절만성과 실험 적 치료의 저렴한 비용으로 인해 질병 프로세스의 분석에 대한 타의 추종을 불허합니다. 그러나, 그들의 작은 체내에서, 200-400 μm의 직경을 가진 oviduct와 같은 몇몇 구조물은 면역작용화학을 제외하고는 연구하기 상대적으로 어려운 것으로 입증되었습니다. 최근, 면역히토화학 연구는 이전에 인식된 것보다 oviduct 세그먼트에 있는 더 복잡한 다름을 발견했습니다; 따라서, oviduct는 7개의 명백한 상피 세포 모형의 상이한 비율을 가진 4개의 기능적인 세그먼트로 분할됩니다. 상피 세포 모형의 상이한 배아 기원 및 비율은 가능성이 4개의 기능적인 지구가 질병에 분화하기 쉽게 만듭니다. 예를 들어, 전구체 병변은 마우스 모델의 농가 에서 발생하며 인간 나팔관의 상응하는 피모브리알 영역에서 발생한다. 여기서 설명된 프로토콜은 역전사-정량PCR(RT-qPCR) 및 RNA 시퀀싱(RNAseq)과 같은 다운스트림 분석에 필요한 RNA의 충분한 양및 순도를 산출하는 방식으로 마이크로절이 배관을 세분화하는 방법을 상세히 기술한다. 또한 완전히 분화된 난관 세포의 유동 세포측정 또는 단일 세포 RNAeq 분석에 적합한 대부분 비 효소 조직 해리 방법이 기재되어 있다. 설명된 방법은 생식, 불임, 암 및 면역학 분야에서 뮤린 배관을 활용하는 추가 연구를 촉진할 것입니다.

설명된 해리 프로토콜은 두 oviducts의 풀링으로 마우스 당 100,000-120,000 세포를 산출합니다. 이 방법은 다중 모액 세포 테두리를 그대로 두고 다중 모액 세포와 분비 세포를 구별할 수 있게 하고 소화 방법이 탈분화를 방지할 만큼 충분히 부드럽다는 것을 확인할 수 있을 만큼 부드럽습니다. 도 5의 대표적인 면역불성 이미지는 4.2.1 단계 다음 의 작은 세포 덩어리를 나타내며, 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)/ DPBS에서 3 분 동안 고정되어 1 % 소 세럼 알부민 (BSA)/ 트리스 버퍼링 식염수 -tween (BTBST)로 세척및 정지에 얼룩이 있습니다. 간단히, 세포는 0.5% TritonX-100/BTBST에서 실온에서 15분 동안 투약되었고, BTBST에서 20m 글리신/DPBS에서 실온에서 2시간 동안 배경 형광을 위해 담금질한 다음, BTBST에서 세척한 다음, 5% BSAA/TBSTXXX의 실내 온도에서 1시간 동안 차단하였다. 세포는 B...

RNA 무결성을 유지하면서 개별 세그먼트의 수집을 허용하는 마우스 배반의 미세 절제 방법이 제시된다. 또한, 비효소 성 배관 세포 해리 절차가 설명된다. 이 방법은 기능적으로 상이한 배반 분과 및 해리된 배관 세포의 후속 유전자 및 단백질 분석에 적합합니다.

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

다른 oviduct 세그먼트는 뚜렷한 생리적 기능을 가지고 있으며 병리학적 변화에 차별화되기 쉽습니다. 매우 작은 마우스 oviduct에서 다른 세그먼트의 식별은 조직 해리에 의해 잘 분화 된 세포의 좋은 수율의 생산과 마찬가지로 도전적이다. 이 비디오에서는 마우스 배관을 풀고, 서로 다른 세그먼트를 인식하여 개별적으로 분석할 수 있도록 하는 방법을 시연하고, 마지막으로 분화된 분리된 세포의 비교적 높은 수율을 생성하는 방법을 시연할 것입니다.암풀라에 특화 된 환경의 더 나은 이해체 외 수정 기술을 향상 시킬 수 있습니다. 또한, 다른 세그먼트와 fundibulum을 대조적으로, 우리는 더 나은 악성 변화에 대한 fundibulum의 성향을 이해할 수 있습니다. 단세포 해리 절차는 기질뿐만 아니라 난소로부터상피 세포를 해방시다.우리의 방법은 또한 별도로 면역, 부드러운 근육, 그리고 난소의 생리학 및 병리에 상피 세포 기여를 분석하는 기회를 제공합니다. 해부 현미경하에서 일하는 것은 처음에 어려울 수 있습니다. 난 당신의 도구가 oviduct 미세 절에 적합한지 확인하기 위해 자궁과 같은 더 큰 튜브로 연습하는 것이 좋습니다.먼저 치과 용 왁스를 접착제로 페트리 접시에 부착하고 건조하게하십시오. 그런 다음 70 %의 에탄올로 요리를 소독합니다. 이제 서피스가 해부할 준비가 되었습니다.해부를 준비하면 해부 현미경으로 차가운 플랫폼에 치과 왁스가 들어있는 페트리 접시를 고정하십시오. 동물의 복부 표면을 70%에탄올로 소독합니다. 그런 다음 멸균 해부 가위로 복부와 골반 구멍을 엽니다.위장관을 한쪽으로 이동하여 등쪽 양혼 자궁을 찾습니다. 각 자궁 뿔을 따라 신장 바로 아래 자궁 지방 패드에 둘러싸인 각 oviduct 및 난소를 찾습니다. 그런 다음 난소와 해부 가위를 사용하여 여전히 부착 된 해회 자궁 뿔의 일부를 가진 측면 배반소를 모두 소비합니다.각 측면 자궁 경적을 코일 난기와 난소에 부착된 뿔의 약 1~2센티미터로 자릅니다. 차가운 해부 매체의 2 밀리리터에 즉시 조직을 담급하고, 멸균 25 게이지 바늘로 치과 왁스에 자궁 조직을 부착하여 해부를 위한 조직을 확보합니다. 난소 지방 패드와 결합 조직을 깨끗하고 해부하여 oviduct를 명확하게 시각화합니다.1 밀리리터 주사기를 사용하여 멸균 1%의 토루이딘 블루 염료 용액을 1~2방울 에 분배하고 30초에서 1분 동안 배양합니다. 차가운 DPBS로 헹구고 모든 액체를 제거합니다. 코일 난소에서 난소를 가볍게 당깁니다.관 조직을 손상시키지 않고 oviduct에서 난소를 제거하기 위해 넓은 인대의 활액 막에서 잘라. 자궁 관 접합에 측면 발견 oviduct의 탈경 피모브리알 끝을 찾습니다. 튜브를 부드럽게 당기고 스프링폼 마이크로 가위로 메소살핀스를 잘라 내어 배관을 풀어냅니다.튜브를 잘라 내어 기금이 없는 영역을 생성합니다. 그런 다음 2턴과 3회전 사이를 절단하여 암풀 영역을 소비합니다. 마지막으로, 나머지 부분을 자궁 관 접합부로 잘라내어 isthmic 영역입니다.즉시 액체 질소에서 해부 된 조직 세그먼트를 동결 한 다음 RNA 절연을위한 조직에 감기 RNA 추출 시약 및 일대일 균질화 비드 믹스의 200 마이크로 리터를 추가합니다. fimbrial 영역에서 시작하여 스프링 폼 가위로 튜브를 세로로 슬릿하고 포셉을 레버리지로 사용하여 발광 상피를 노출시합니다. 슬릿 열린 부분과 나머지 oviduct를 약 1~ 2밀리미터 세그먼트로 다진다.그런 다음 조직에 따뜻한 비 효소 해리 버퍼의 5 밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 배양합니다. 폐백, 핵 및 아세틸화 튜룰린에 대해 양성 세포 클러스터의 형광 및 위상 대조 이미지가 여기에 나와 있다. 빨간색은 폐골, 파란색을 나타내며 녹색은 아세틸화된 튜룰린을 나타냅니다.섬광 식 테두리는 프로토콜 전체에 걸쳐 그대로 유지되며 단일 세포에 대한 추가 소화를 견딜 수 있습니다. 이러한 대표적인 이미지에서 병합, 빨간색, 파란색, 위상 대비 및 녹색 채널이 표시됩니다. 짧은 pronase 인큐베이션 후, 세포의 대부분은 단일.프로피듐 요오드 스테인닝은 브라이트필드에서 약 93%의 생존력을 나타내며, 적색 채널 PI 양성 및 병합을 나타낸다. 병합시 인셋은 단일 해리 셀에 그대로 섬모테두리를 표시합니다. 이러한 세포는 적극적으로 섬모를 치고있다.전체 RNA는 마이크로볼륨 분광광광계 및 생체 분석기별 수율 과 품질평가를 받았습니다. 결과는 이 방법이 다운스트림 에세이에 적합한 수율에 필요할 수 있는 2개의 동물에게서 풀링이 필요할 수 있는 기금 식 견본을 제외하고 세그먼트 당 800 내지 1, 200 나노그램 RNA를 산출한다는 것을 보여줍니다. 기금 에 대한 제시 된 결과는 총 4 개의 기금 이성 지역인 두 마리의 동물로 구성됩니다.이 프로토콜은 마이크로볼륨 분광광계 및 생체 분석기로 분석된 순수 RNA를 성공적으로 달성합니다. 시료는 순수 RNA 뉴클레오티드 종의 전형적인 1.8과 2 사이의 260~ 280 나노미터 흡수비를 갖는다. 시료를 생체 분석한 결과, 다운스트림 발현 및 시퀀싱 분석에 적합한 7개 이상의 평가된 RNA 무결성 수로 높은 RNA 무결성을 보였다.관 시스템을 해부 플랫폼에 부착하기 위해 자궁 뿔의 1~2cm를 유지해야합니다. 또한, toluidine 블루 염료의 사용은 oviduct의 빠른 코일링에 도움이됩니다. 코일링이 빨라지고 보존이 향상되고 RNA 의 양이 적어집니다.이 방법은 개별 세그먼트 시퀀싱을 허용하는 RNA 염기서열에 적합한 품질의 RNA를 얻기에 충분하다. 세포 해리는 보다 정확한 세그먼트 및 세포 분석을 허용하는 단세포 시퀀싱 또는 유동 세포측정에 적합합니다. 이 방법은 세그먼트 또는 단일 셀 수준에서 차이를 마스크 전체 튜브 분석을 넘어 필드를 이동하는 데 도움이됩니다.

microdissection-dissociation-murine-oviduct-individual-segment

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

개별 도파민 뉴런의 단리 또는 직접 또는 간접 면역과 복측 피개 영역은 레이저 미세 절제를 캡처하여 설명된다. 적외선 레이저를 이용하여 유리 슬라이드 조직으로부터 단리 및 적외선 및 자외선 레이저의 조합을 이용하여 막 slide에서 파라미터 논의된다.

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

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종에 구애받지 않는 단일 조직 응용 분야를 위한 레이저 미세 해부

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