모성 크리스펀트를 사용한 초기 발달에서 모계 발현 유전자의 역할 결정

초기 발달 과정에서 많은 모계로 발현 된 유전자의 역할은 현재 알려져 있지 않습니다. 이 모성 CRISPR 기술은 모성 효과 유전자와 발달에서의 역할을 신속하게 식별 할 수있게합니다. 가이드 RNA를 단일 유전자로 멀티플렉싱하면 연구자가 단일 세대에서 새로운 모성 효과 표현형을 식별할 수 있습니다.

이 연구는 초기 배아 발생에 필요한 배우자에서 mRNA 전사체의 기능을 이해하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 핵심은 한 세포 단계 초기에 배아를 미세 주입하고 대부분의 가이드 RNA가 주입된 배아에서 체세포 돌연변이를 만들 수 있는지 확인하는 것입니다. 각 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드에 대한 가이드 RNA 주형을 만들기 위해, 상수 올리고뉴클레오티드에 분석물을 넣고 오버행을 T4 DNA 중합효소로 채운다.

4개의 가이드 RNA 주형을 조립한 후 DNA 클린업 및 농축기 키트를 사용하여 함께 정제하고 농축합니다. 풀링가이 RNA 주형으로부터 sgRNA 혼합물을 합성하고, 시험관내 T7 전사 키트를 사용하여, 원고에 기재된 바와 같이 시험관내 전사를 수행한다. sgRNA의 무결성을 확인하기 위해 밀리리터당 1%아가로스 0.5마이크로그램, 에티듐 브로마이드 트리스-붕산염-EDTA 겔을 주조하십시오.

응고된 겔을 트리스-보레이트-EDTA 실행 완충액에 넣는다. 1 마이크로 리터 sgRNA 혼합물과 1 마이크로 리터 RNA 겔 로딩 완충액을 혼합한다. 이 샘플을 젤에로드하고 100 볼트에서 5 분 동안 젤을 실행하십시오.

자외선을 사용하여 밴드를 시각화합니다. 야생형 십자가와 제브라 피쉬 짝짓기 상자를 설치하십시오. 수컷과 암컷 물고기를 같은 탱크에 보관하되 짝짓기 상자 칸막이를 사용하거나 여기에 표시된대로 암컷을 알을 낳는 삽입물 안에 넣어 분리하십시오.

주입 칵테일을 조립 한 후 짝짓기 상자 칸막이를 제거하거나 여기에 표시된대로 암컷과 동일한 알을 낳는 삽입물에 수컷을 놓아 수컷과 암컷이 짝짓기하도록합니다. 배아를 동기화하려면 플라스틱 여과기를 사용하여 10 분 후에 배아를 수집하고 1XE3 배지를 사용하여 페트리 접시로 헹굽니다. 10-15개의 배아를 제거하고 별도의 페트리 접시에 넣어 주입되지 않은 대조군으로 보관합니다.

나머지 배아를 주입 판 우물로 옮깁니다. 하나의 나노리터 단백질 sgRNA 용액을 하나의 세포 배아의 발달 중인 배반주에 주입합니다. 집게를 사용하여 막힌 바늘의 끝을 부러뜨리고 바늘을 다시 보정하여 1나노리터 볼루스를 배출합니다.

주사 후 다음날, 주입되지 않은 플레이트에서 6 개의 건강한 주입 배아와 2 개의 대조 배아를 수집합니다. 각 배아를 PCR 스트립 튜브의 단일 웰에 개별적으로 놓고 튜브 상단에 레이블을 지정합니다. CRISPR-Cas9 표적 부위를 포함하는 100-110개의 염기쌍 DNA 단편을 증폭하기 위해 각 가이드 부위에 고유한 스크리닝 프라이머를 설계합니다.

가능하면 표적 부위를 증폭된 단편의 중간에 배치하여 더 큰 결실을 식별할 수 있습니다. 4개의 가이드 표적 부위 각각에 대해 준비된 단일 배아유전체 DNA 5개와 PCR 믹스 20마이크로리터를 사용하여 8개의 25마이크로리터 PCR 반응을 설정하고, 가이드 특이적 스크리닝 프라이머 혼합물을 사용하여 표적 부위의 체세포 돌연변이를 확인합니다. 약 0.625cm 너비의 웰을 만드는 빗을 사용하여 2.5% 아가로오스, 밀리리터당 0.5마이크로그램의 에티듐 브로마이드 트리스-붕산염-EDTA 젤을 주조합니다.

그런 다음 응고된 겔을 트리스-붕산염-EDTA 실행 완충액이 포함된 전기영동 챔버에 넣습니다. PCR 산물에 5마이크로리터의 6X 로딩 염료를 추가합니다. 이 혼합물 25마이크로리터를 겔에 로드하여 주입된 샘플과 대조군 샘플이 동일한 겔 행에서 실행되도록 합니다.

모든 샘플이 로딩 된 후 트리스-붕산염-EDTA 실행 버퍼 1 리터당 5 마이크로 리터의 에티듐 브로마이드를 젤 상자의 양극 끝에 추가합니다. DNA 금지가 해결되거나 DNA가 차선 끝에 접근 할 때까지 120 볼트에서 젤을 실행하십시오. 모체 효과 표현형과 모체 CRISPR의 배아를 식별하려면 실험 전 오후에 표준 얼룩말 물고기 짝짓기 상자에서 야생형 수컷에 대해 F0 주입 암컷을 설정하고 야생형 교배를 제어했습니다.

수컷과 암컷 물고기를 같은 탱크에 넣되 짝짓기 상자 칸막이로 분리하거나 암컷을 알을 낳는 삽입물 안에 넣으십시오. 실험 아침에 짝짓기 상자 칸막이를 제거하거나 수컷을 암컷과 같은 알을 낳는 삽입물에 넣어 수컷과 암컷이 짝짓기를 시작하도록합니다. 알을 낳는 삽입물을 신선한 시스템 물이 들어있는 새로운 짝짓기 탱크 바닥으로 옮겨 10 분마다 배아를 수집하고 개별 F0 암컷을 식별하는 태그로 탱크에 라벨을 붙입니다.

오래된 짝짓기 탱크를 가져 와서 T- 스트레이너를 통해 물을 부어 한 개인의 10 분 클러치에서 배아를 수집합니다. 초월 광원으로 해부 현미경으로 매시간, 처음 6-8 시간 동안, 그리고 다음 5 일 동안 매일 발달중인 배아를 관찰하십시오. 잠재적인 모체 CRISPR 배아를 1XE3 배지가 포함된 페트리 접시로 옮기고 수정 후 24시간에 형태학적 표현형을 분석하고 수정 후 5일에 생존력을 분석합니다.

실험 전날 오후, 야생형 수컷을 암컷과 물리적으로 분리하거나 짝짓기 상자 분배기를 사용하거나 암컷을 알을 낳는 삽입물에 넣어 F0 암컷의 짝짓기 쌍을 설정합니다. 실험 아침에 물리적 파티션을 제거하여 짝짓기를 시작하십시오. 알을 낳는 첫 징후가 나타나면 수컷과 F0 암컷을 분리하여 번식을 중단하고 분리 된 F0 암컷을 개별 짝짓기 상자에 보관하십시오.

체외 수정 후, 모체 CRISPR 표현형이 관찰 될 때까지 반수체 배아가 발달하도록하고 그 배아를 다른 페트리 접시에 넣습니다. 모체 CRISPR 반수체 배아가 확인되면 수정 후 최소 6시간 동안 발달하도록 합니다. 최소 10개의 모체 CRISPR 반수체 배아에서 게놈 DNA를 추출하려면 단일 반수체 배아를 PCR 스트립 튜브의 개별 웰에 넣고 웰에서 과도한 E3 배지를 제거한 다음 50마이크로리터의 50밀리몰 수산화나트륨을 추가합니다.

배아를 섭씨 95도에서 20 분 동안 배양하고 섭씨 4도까지 식힌다. 그런 다음 pH 7.5의 1 몰 트리스 염산 5 마이크로 리터를 넣고 5-10 초 동안 와동시킵니다. 어떤 가이드 부위에 인델이 포함되어 있는지 식별하려면 시퀀싱 프라이머를 설계하여 4개의 CRISPR/Cas9 표적 부위를 모두 포함하는 DNA 단편을 증폭합니다.

준비된 게놈 DNA 5 마이크로리터 및 시퀀싱 프라이머를 사용하여 배아 당 2개의 25 마이크로리터의 PCR 반응을 설정합니다. PCR이 완료된 후 DNA 클린업 및 농축기 키트를 사용하여 두 샘플을 정제 및 농축하고 정방향 및 역방향 시퀀싱 프라이머를 사용하여 DNA 단편을 Sanger 시퀀싱에 제출합니다. 가이드 RNA는 모두 모계 CRISPR 생성 동안 가이드 RNA 사이에 겹치는 영역이 거의 또는 전혀 없이 함께 클러스터링되어야 합니다.

indels가 생성 된 경우, 아가 로스 겔에 주입 된 샘플에서 얼룩이 관찰되어야하지만 주입되지 않은 대조군에서는 관찰되지 않아야합니다. 모성 CRISPR 방법은 가지각색, tmi 및 기운과 같은 알려진 모성 효과 돌연변이를 표현형화하는 데 사용할 수 있습니다. 산모의 CRISPR 표현형에 기여하는 유전적 병변을 확인하기 위해 UV 처리된 정자와 체외 수정을 결합하여 산모의 CRISPR 반수체를 만듭니다.

반수체의 생성은 모체 대립 유전자의 Sanger 시퀀싱과 모체 CRISPR indels의 식별을 허용합니다. 모성 효과 표현형을 식별 할 때 표현형이 표적을 벗어나거나 비특이적 효과가 아닌 기능 상실로 인해 발생할 확률을 높이기 때문에 여러 F0 여성에서 관찰 할 수 있어야합니다. 모체 효과 표현형이 확인된 후, 모체 CRISPR 배아는 부비동 골격 또는 DNA 분리와 같은 초기 배아 발생의 다양한 측면에 대한 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

이를 통해 연구자들은 표현형의 분자 원인을 이해할 수 있습니다. 이 방법은 단일 세대에서 알려지지 않은 모계로 발현 된 유전자의 기능을 직접 테스트하여 초기 배아 발생 중에 작용하는 과정에 대한 이해를 촉진합니다.