Name: 모성 크리스펀트를 사용한 초기 발달에서 모계 발현 유전자의 역할 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 배우세요 CRISPR-Cas9 기법으로 조기 발생에서 모계 효과 유전자를 신속하게 식별하는 방법을 Danio rerio에서. 이 연구는 발생 생물학 연구자들이 모계 발현 유전자의 기능을 단일 세대 내에서 직접 검증할 수 있게 합니다.

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수생 시설을 돌봐 주신 전현직 Pelegri 실험실 축산 직원들에게 감사드립니다. 우리는 또한 Ryan Trevena와 Diane Hanson의 원고에 대한 의견과 통찰력에 감사드립니다. 자금은 FP에 대한 NIH 보조금으로 제공되었습니다 (GM065303).

<ol><li>Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+factors+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Maternal factors in zebrafish development.</a> Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).</li>
<li>Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+interacts+with+Bucky+ball+to+form+germ+cells+and+is+required+to+pattern+the+zebrafish+body+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis.</a> Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).</li>
<li>Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aura+%28mid1ip1l%29+regulates+the+cytoskeleton+at+the+zebrafish+egg-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition.</a> Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).</li>
<li>He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+W-X+%22RNA%22">RNA</a>. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).</li>
<li>Burger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mutagenesis+with+solubilized+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).</li>
<li>Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).</li>
<li>Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reverse+genetic+screening+using+CRISPR+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish.</a> Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).</li>
<li>Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-directed+gene+editing+for+the+generation+of+loss-of-function+mutants+in+high-throughput+zebrafish+F0+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).</li>
<li>Trubiroha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+CRISPR%2FCas-based+mutagenesis+assay+in+zebrafish+for+identification+of+genes+involved+in+thyroid+morphogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5647(2018).</li>
<li>Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+method+for+directed+gene+knockout+for+screening+in+G0+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish.</a> Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).</li>
<li>Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+maternal-effect+genes+in+zebrafish+using+maternal+crispants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants.</a> Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536(2021).</li>
<li>Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+zebrafish+primordial+germ+cells%3A+morphology+and+early+distribution+of+vasa+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).</li>
<li>Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation%2C+segregation%2C+and+dispersal+of+homotypic+germ+plasm+RNPs+in+the+early+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo.</a> Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).</li>
<li>Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionary+conserved+region+in+the+vasa+3%27UTR+targets+RNA+translation+to+the+germ+cells+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish.</a> Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).</li>
<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).</li>
<li>Gagnon, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+mutagenesis+by+Cas9+protein-mediated+oligonucleotide+insertion+and+large-scale+assessment+of+single-guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs.</a> PLoS ONE. 9 (5), 98186(2014).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v2%3A+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v3%3A+expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li>
<li>Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP%3A+a+CRISPR%2FCas9+and+TALEN+web+tool+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).</li>
<li>Moravec, C. E., Pelegri, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+accessible+protocol+for+the+generation+of+CRISPR-Cas9+knockouts+using+INDELs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).</li>
<li>White, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+mRNA+expression+time+course+of+embryonic+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish.</a> eLife. 6, 30860(2017).</li>
<li>Aanes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mRNA+sequencing+deciphers+novelties+in+transcriptome+dynamics+during+maternal+to+zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition.</a> Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).</li>
<li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ensembl+gene+annotation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Database%3A+The+Journal+of+Biological+Databases+and+Curation%22%5BJournal%5D)">The Ensembl gene annotation system.</a> Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).</li>
<li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+and+identification+of+CRISPR%2FCas9-generated+gene+knockouts+in+the+model+system+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969(2018).</li>
<li>Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((efficient+multiple+genome+modifications+induced+by+the+crRNAs%2C+tracrRNA+and+Cas9+protein+complex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish.</a> PloS One. 10 (5), 0128319(2015).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115(2009).</li>
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<li>Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology%3A+Mouse%2C+Zebrafish%2C+and+Chick.+Zebrafish+Microinjection+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques.</a> JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).</li>
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<li>D'Agostino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+cheap+methodology+for+CRISPR%2FCas9+zebrafish+mutant+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening.</a> Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).</li>
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<li>Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+oocyte+culture-based+manipulation+of+zebrafish+maternal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).</li>
<li>Kushawah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas13d+induces+efficient+mRNA+knockdown+in+animal+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos.</a> Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).</li>
<li>Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+haploid+zebrafish+embryos+by+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708(2014).</li>
<li>Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GFP-based+genetic+screen+reveals+mutations+that+disrupt+the+architecture+of+the+zebrafish+retinotectal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection.</a> Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).</li>
<li>Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+Bucky+ball-GFP+transgene+visualizes+germ+plasm+in+living+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%3A+GEP%22%5BJournal%5D)">A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

이 원고에 제시된 프로토콜은 정방향 및 역방향 유전 기술 모두에 필요한 여러 세대 대신 단일 세대에서 모성 효과 표현형의 식별 및 1 차 분자 특성화를 허용합니다. 현재, 많은 모계 발현 유전자의 역할은 알려져 있지 않다. 이러한 지식 부족은 부분적으로 모성 효과 유전자를 식별 할 때 표현형을 시각화하는 데 필요한 추가 세대 때문입니다. 과거에, 제브라피쉬에서 모성 효과 유전자의 신속한 동정은 배양된 난모세포(32)에 번역-차단 모르폴리노 올리고뉴클레오티드를 주입함으로써 달성될 수 있었다. 이 방법은 알려진 여러 모성 효과 유전자를 표현하여 성공적으로 입증되었지만 미성숙 난 모세포를 조작하는 것은 섬세하고 시간이 많이 걸리는 실험 일 수 있습니다. 모체 RNA는 또한 CRISPR-RfxCas13d 복합체를 사용하여 분해를 위해 표적화될 수 있지만, 이들 복합체를 단세포 배아에 주입하는 것은 모계가 제공한 단백질33을 표적화할 수 없다. 보다 최...

모계로 축적된 산물(예: RNA, 단백질 및 기타 생체 분자) 풀은 배아의 접합체 게놈이 활성화될 때까지 모든 초기 세포 과정에 필요합니다1. 난 모세포에서 이러한 생성물의 조기 고갈은 일반적으로 배아 치명적입니다. 발달에서 이러한 유전자의 중요성에도 불구하고, 많은 모계 발현 유전자의 역할은 현재 알려지지 않았습니다. CRISPR-Cas9와 같은 제브라피쉬의 유전자 편집 기술의 발전은 모계에서 발현된 유전자 2,3,4의 표적화를 가능하게 합니다. 그러나 모성 효과 표현형의 식별은 접합 표현형과 비교할 때 추가 세대가 필요하므로 더 많은 자원이 필요합니다. 최근 CRISPR-Cas9의 이중 대립 유전자 편집 능력은 "크리스프 판트"5,6,7,8,9,10으로 알려진 주입 된 (F0) 배아의 체세포 조직에서 배아 표현형을 스크리닝하는 데 사용되었습니다. 크리스펀트 기술은 체세포에서 후보 유전자의 자원 효율적인 스크리닝을 허용하여 발달의 특정 측면에 대한 이해를 용이하게 합니다. 이 논문에 설명된 프로토콜은 단일 세대에서 모성 효과 표현형 또는 "모성 크리스펫"의 식별을 허용합니다11. 이 계획은 가이드 RNA를 단일 유전자로 멀티플렉싱하고 생식계열에서 이대립유전자 편집 이벤트를 촉진함으로써 달성할 수 있습니다. 이들 모체 크리스펀트 배아는 총 형태학적 표현형에 의해 확인될 수 있고, 세포 경계 및 DNA 패터닝(11)에 대한 표지와 같은 1차 특성화를 거친다. 관찰 가능한 표현형과 유도된 INDEL의 기본 분자 특성화의 결합 분석을 통해 초기 발달에서 표적 유전자의 역할을 예측할 수 있습니다.
제브라 피쉬에서는 수정 후 처음 24 시간 (hpf) 동안 작은 세포 그룹이 생식선12,13,14,15의 전구체 인 원시 생식 세포로 발전합니다. F0 암컷이 놓은 클러치에서 회수된 모체 크리스펀트 배아의 비율은 표적 유전자에 이대립유전자 편집 이벤트가 포함된 생식 세포의 수에 따라 달라집니다. 일반적으로 배아에서 편집 사건이 일찍 발생할수록 생식계열에서 CRISPR-Cas9 돌연변이가 관찰될 확률이 높아집니다. 대부분의 경우, 모체 크리스펀트 배아의 표현형은 발달중인 난 모세포에 존재하는 두 개의 모체 대립 유전자의 기능 상실에서 비롯됩니다. 난 모세포가 감수 분열을 마치면 모체 대립 유전자 중 하나가 극체를 통해 배아에서 돌출되고 다른 대립 유전자는 모체 전핵에 통합됩니다. 다수의 모체 크리스펀트 반수체의 시퀀싱은 표현형11에 기여하는 생식계열에 존재하는 돌연변이(삽입 및/또는 결실(INDEL))의 혼합물을 나타낼 것이다.
다음 프로토콜은 모성 효과 유전자에서 CRISPR-Cas9 돌연변이를 생성하고 모체 크리스펀트 접근법을 사용하여 해당 표현형을 식별하는 데 필요한 단계를 설명합니다(그림 1). 섹션 1은 가이드 RNA를 효과적으로 설계하고 생성하는 방법을 설명하고 섹션 2와 3에는 미세 주입으로 산모의 크리스펀트를 만드는 중요한 단계가 포함되어 있습니다. CRISPR-Cas9 혼합물을 주입한 후, 주입된 배아는 PCR을 통해 체세포 편집을 위해 스크리닝됩니다(섹션 4). 주입된 F0 배아가 발달하여 성적으로 성숙되면 F0 암컷을 야생형 수컷으로 교배하고 자손을 대상으로 모성 효과 표현형을 선별합니다(섹션 5). 섹션 6에는 CRISPR-Cas9 유도 INDEL을 식별하기 위해 Sanger 시퀀싱과 결합할 수 있는 모체 크리스펀트 반수체를 만드는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다. 또한 토론에는 이 방법의 민감도와 성능을 높이기 위해 프로토콜에 적용할 수 있는 수정 사항이 포함되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 8.4)</td> <td>Invirogen</td><td>15568025</td><td>PCR 믹스</td></tr><tr><td>용 1.5 mL Eppendorf Tubes</td><td>Any Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>18427013</td><td>Synthesis of gRNA</td></tr><tr><td>100 BP ladder</td><td>Any Maker</td><td></td><td>For gel electrophoresis</td></tr><tr><td>100% RNAse free ethanol</td><td>Any Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% RNAse 무료 에탄올</td><td>Any Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100ml 비커</td><td>IVF용</td><td>Any Maker</td><td></td></tr><tr><td>5 M Ammonium Accetate</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>MEGAshortscript T7 전사 키트에서 발견</td><td>gRNA</td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td>합성 gRNA (에탄올 70 mL + 뉴클레아제 무료 물 30 mL)</td></tr> <tr><td>Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID FHC</td><td>INC</td><td>27-30-1</td><td>Microinjection Bulk</td></tr><tr><td>Pharma Sodium Bicarbonate 35 lbs</td><td>벌크 암초 공급</td><td>255</td><td>Fish 공급</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MiliporeSigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 단백질(NLS 포함</td>) <td>PNABio</td><td>CP01</td><td></td></tr><tr><td>ChopChop</td><td></td><td></td><td>https://chopchop.cbu.uib.no/</td></tr> <tr><td>Constant oligonucleotide</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC</td></tr><tr><td>우울증 유리판</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>13-748B</td><td>IVF</td></tr><tr><td>절제 겸자</td><td>Dumont</td><td>SS</td><td>IVF</td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>미세 과학 도구</td><td>14091-09</td><td>IVF 용</td></tr><tr><td>Steroscope 해부(투과 광원 포함)</td><td>IVF DNA를 위한</td> <td>모든 메이커</td><td></td></tr><tr><td>Clean & Concentrator -5</td><td>Zymo Research</td><td>D4014</td><td>Synthesis of gRNA</td></tr><tr><td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td><td>Any Maker</td><td></td><td>For gel electrophoresis</td></tr><tr><td>EconoTaq DNA Polymerase</td><td>Lucigen</td><td>30032-1</td><td>For PCR mix</td></tr><tr><td>Electropheresis Power Supply</td><td>Any Maker</td><td></td><td>For gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Ensemble</td><td></td><td></td><td>https://useast.ensembl.org/index.html</td></tr><tr><td>에펜도르프&nbsp; Femtotips 마이크로로더 Femtojet 마이크로인젝터</td><td>팁 Thermo Fischer</td>, <td>마이크로주입</td><td></td></tr><tr><td>에탄올을 위한 과학적 E5242956003(200프루프, 뉴클레아제 프리)</td><td>Any Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021</td><td>for Microinjection</td></tr><tr><td>Fish 그물</td><td>Any Maker</td><td></td><td>Fish Supplies</td></tr><tr><td>Frozen Brine Shrimp</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td>생선 공급</td></tr><tr><td>일반 모든 목적 Agarose</td><td>모든 제조사</td><td></td><td>젤 전기영동</td></tr><tr><td>유전자 특이적 올리고뉴클레오티드</td><td>통합 DNA 기술 (IDT)</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG</td></tr><tr><td>장갑</td><td>모든 제조사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td>모든 제조사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인스턴트 오션 솔트</td><td>모든 제조사</td><td></td><td>물고기 용품</td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15-585-011</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MiliporeSigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>MiliporeSigma</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Male & 여성 제브라피시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 전사 키트</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM1354</td><td>gRNA</td></tr><tr><td>메틸렌 블루</td><td>합성 Thermo Fischer Scientific</td><td>AC414240250</td><td>E3</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MiliporeSigma</td><td>7791-18-6</td><td>PCR 믹스</td></tr><tr><td>MgSO2&middot; 7H2O</td><td>MiliporeSigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>미세 사출 플라스틱 금형</td><td>세계 정밀 기기</td> 미세 <td>주입용</td><td>Z-금형</td></tr><tr><td>MicroInjection Micromanipulator</td><td>Microinjection Micropipeter용</td><td>모든 제조업체</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Micropipette</td></tr><tr><td>풀러</td><td>Sutter</td><td>P-87</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>필터가 있는 마이크로피펫터 팁(모든 크기)</td><td>모든 제조사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫터 필터(모든 크기)</td><td>모든 제조사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전자레인지</td><td>모든 제조사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>MiliporeSigma</td><td>m5904-5ml</td><td>마이크로주입</td></tr><tr><td>MS-222(트리카인-D)</td><td>모든 제조사</td><td></td><td>FDA 승인</td></tr><tr><td>Na2 HPO4</td><td>MiliporeSigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MiliporeSigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHC03</td><td>MiliporeSigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Any Maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>MiliporeSigma</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Nonstick, RNase-free 마이크로퓨지 튜브, 1.5 mL</td><td>Ambion</td><td>AM12450</td><td>gRNA</td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물의</td> 합성 <td>모든 제조사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>종이 타월</td><td>모든 제조사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파스트로 피펫</td><td>모든 제조사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 스트립 튜브</td><td>모든 제조사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리 플레이트 직경 100mm</td><td>모든 제조사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 솔루션</td><td>MiliporeSigma</td><td>P0290</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>플라스틱 Pestals</td><td>VWR</td><td>47747-358</td><td>IVF</td></tr><tr><td>플라스틱 숟가락</td><td>모든 메이커</td><td></td><td>IVF</td></tr><tr><td>프리미엄 등급 염수 새우 계란</td><td>염수 새우 직접</td><td></td><td>미세 메쉬</td></tr><tr><td>RNA 젤 로딩 염료</td><td></td><td>MEGAshortscript T7 전사 키트</td><td>젤 전기 영동</td></tr><tr><td>RNAse AWAY</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21-402-178</td><td></td></tr><tr><td>스케일</td><td>모든 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sharpie</td><td>모든 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 주걱</td><td>모든 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 H2O</td><td>모든 메이커</td><td></td><td>PCR 믹스</td></tr><tr><td>T4 DNA 중합 효소</td><td>NEB</td><td>M0203</td><td>gRNA</td></tr><tr><td>테이프</td> 합성 <td>모든 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x</td><td>모든 메이커</td><td></td><td>젤 전기 영동</td></tr><tr><td>차 염색기</td><td>아마존</td><td>IMU-71133W</td><td>생선 공급</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm 두께, 양면 B2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B2-12</td><td>젤 전기영동용</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Owl EasyCast B2 미니 젤 전기 영동 시스템</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>09-528-110B</td><td>젤 전기</td></tr><tr><td>영동 Thermocycler</td><td>모든 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>모든 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transilluminator</td><td>모든 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV 램프</td><td>UVP</td><td>모델 XX-15 (Cat No. UVP18006201)</td><td>IVF</td></tr><tr><td>UV 안전 안경</td><td></td><td></td><td>IVF</td></tr><tr><td>세척 병</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>S39015</td><td>물고기 용품</td></tr><tr><td>제브라 피쉬 짝짓기 상자</td><td>Aqua Schwarz</td><td>SpawningBox1</td><td>물고기 용품</td></tr><tr><td>1.5ml Eppendorf 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-11</td><td></td></tr><tr><td>10 어금니 dNTP Thermo</td><td>Fischer Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>100 BP 사다리</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15628019</td><td></td></tr><tr><td>100% RNAse free ethanol</td><td>any maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5m Ammonium Accetate</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td>70ml 에탄올 및 30ml 뉴클레아제 무함유</td></tr><tr><td>물 수평 젤 박스용 액세서리</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>0.625mm</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>any maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>시그마</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, 이수화물</td><td>시그마</td><td>10035-04-8</td><td>E3 주</td></tr><tr><td>사 바늘 용</td>중간<td>모세관</td><td>튜브 Cole-Parmer</td><td>UX-03010-68</td></tr><tr><td>Cas9 단백질</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A36496</td><td></td></tr><tr><td>ChopChop</td><td>https://chopchop.cbu.uib.no/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>컴퓨터</td><td>모든 제작자</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 Forcepts</td><td>모든 제작자</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>모든 제작자</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>모든 제작자</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 클린 & Concentrator -5</td><td>Zymo Research</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>EconoTaq DNA Polymerenzyme</td><td>Lucigen</td><td>30032-1</td><td></td></tr><tr><td>Ensemble</td><td>https://useast.ensembl.org/index.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader PipetteTips</td><td>Fischer Scientific</td><td>10289651</td><td>20 마이크로리터</td></tr><tr><td>에탄올 (200 proof, nuclease-free)</td> <td>모든 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>Fish Net</td><td>any maker</td><td></td><td>fine mesh</td></tr><tr><td>Frozen Briine Shrimp</td><td>LiveAquaria</td><td>CD-12018</td><td>fish food</td></tr><tr><td>Gel Comb (0.625mm)</td> <td>any maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Electropheresis System</td><td>any maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유전자 특이적 올리고뉴클레오티드</td><td>통합 DNA 기술(IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 모세 바늘</td><td>그레인저</td><td>21TZ99</td><td>https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s& s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!! g!438976 780705!& gucid=N:N:PS:유료 :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231& gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB& gclsrc=aw.ds</td></tr><tr><td>유리 접시</td><td>모든 제조사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>장갑</td><td>모든 제조사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank's Final Working Solution</td><td></td><td></td><td>9.9 ml의 Hank's Premix와 0.1 ml HS Stock #6을 결합합니다</td></tr><tr><td>Hank's Premix</td><td></td><td></td><td>는 다음을 순서대로 결합합니다: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS # 5. 모든 HS 솔로션을 4C</td></tr><tr><td>Hanks Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank's Solution</td><td></td><td></td><td>https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization</td></tr><tr><td>Hank's Stock Solution #1</td><td></td><td></td><td>100ml ddH2O Hank's Stock Solution #2</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>에 8.0g NaCl, 0.4g KCl에 보관0.358g Na2HPO4 무수; 100ml ddH2O</td></tr><tr><td>Hank's Stock Solution #4</td><td></td><td></td><td>중 0.60g K2H2PO4 50ml ddH2O</td></tr><tr><td>Hank's Stock Solution #5</td><td></td><td></td><td>1.23g MgSO47H2O in 50 ml ddH20</td></tr><tr><td>Hank's Stock Solution #6</td><td></td><td></td><td>10.0 ml ddH20 중 0.35g NaHCO3; 새로운 사용 날</td></tr><tr><td>만들기 HCl</td><td>Sigma</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td>any maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인스턴트 오션 솔</td><td></td><td></td>트 <td>어류 물</td></tr><tr><td>In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&trade; 울트라퓨어&트레이드; DNase/RNase-Free 증류수</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td>E3 Medium</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Male and Female zebrafish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mega Short Script T7 Transciption Kit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>메틸렌 블루</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>AC414240250</td><td>E3 매체</td></tr><tr><td>MgSO2-7H2O</td><td>시그마</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 마이크로 매니퓰레이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 사출 플라스틱 금형</td><td>세계 정밀 기기</td><td>Z-Mold</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 인젝터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 니들 슬라이드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipeter (1-10) 팁 포함</td><td>모든 메이커</td><td></td><td>필요 여과 된 p10 팁</td></tr><tr><td>Micropipetter (20-200) 팁 포함</td><td>모든 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropippetter (100-1000) 팁 포함</td><td>모든 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplastic 슬라이드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>전자 레인지</td><td>모든 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiliQ Water</td><td>any 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>시그마 알드리치</td><td>m5904-5ml</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>시그마</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaHC02</td><td>시그마</td><td>223441</td><td></td></tr><tr><td>나노 드롭</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>시그마</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>좁은 주걱</td><td>모든 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>바늘 풀러</td><td>셔터</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>종이 타월</td><td>모든 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파스트로 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>PCR 프라이머 측면 가이드 사이트</td><td>통합 DNA 기술(IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 프라이머 측면 가이드 RNA 절단 사이트</td><td>통합 DNA 기술(IDT)</td><td></td><td>표준 탈염</td></tr><tr><td>PCR 스트립 튜브</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AB0771W</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td>10cm 직경 100mm x 15mm</td></tr><tr><td>페놀 레드</td><td>피셔 사이언</td>스 <td>S25464</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464</td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>모든 메이커</td><td></td><td>10ul, 200ul 및 1000ul 팁</td></tr><tr><td>플라스틱 Pestals</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-364</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 숟가락</td><td>모든 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>프라이머 가이드 사이트</td><td>통합 DNA 기술 (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Uline</td><td>H-595B</td><td></td></tr><tr><td>RNA 젤 메가</td> 쇼<td>트 스크립트 키트에 염료 로딩 (체외 변환 키트)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>RNAse away</td><td>Fisher</td><td>21-402-178</td><td></td></tr><tr><td>RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM12400 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400</td><td></td></tr><tr><td>RNAse free water</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>any maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sharpie</td><td>any maker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨 (cell 배양 테스트)Sigma</td><td></td> <td>S5761</td><td>물고기 물</td></tr><tr><td>브롬화 나트륨 솔로션</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>sanger 시퀀싱 분석</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterlie H2O</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 중합 효소</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td>https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information</td></tr><tr><td>테이프</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B52</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52</td></tr><tr><td>Tea Stainer</td><td>아마존</td><td>IMU-71133W</td><td>대부분의 주방 상점에서 사용 가능</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>전사 피펫</td><td>Uline</td><td>S-24320</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminator</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Tricaine</td>, <td>fisher, scientific</td>, <td>NC0872873</td><td></td></tr>, <tr><td>Tris HCl 7.5</td>, <td>Thermo Fischer, Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr>, <tr><td>Universal Primer</td><td>, Integrated DNA Technologies(IDT)</td><td></td><td>AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC</td></tr><tr><td>UV 램프</td><td>UVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV 안전 안경</td><td>모든 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세척 병</td><td>fisher scientific</td><td>S39015</td><td></td></tr><tr><td>얼룩말 물고기 짝짓기 상자</td><td>모든 메이커</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 버퍼 레시피</td><td>171.12mL 멸균 H20을 추가하십시오. 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M 트리스 -HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262mL 1% 젤라틴. 20분 동안 오토클레이브한 다음 얼음 위에서 솔로션을 식힙니다. 다음으로 3.468mL 100mg/mL BSA를 추가합니다. 0.262mL dATP(100mM), 0.262mL dCTP(100mM); 0.262mL dGTP(100mM); &nbsp; 0.262mL dTTP(100mL). sterile eppendorf tube</td><td></td><td></td>에 대한 Alliquote</tr></tbody></table>

모성 크리스펀트를 사용한 초기 발달에서 모계 발현 유전자의 역할 결정

Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants

초기 발달은 접합체 게놈 활성화까지 발달에 필요한 모든 세포 기능을 수행하는 난자 형성 동안 성숙한 난모세포에 통합된 모체 인자 풀에 의존합니다. 일반적으로 이러한 모성 인자의 유전 적 표적화는 모성 효과 표현형을 식별하기 위해 추가 세대를 필요로하며, 발달 중에 모성 발현 유전자의 역할을 결정하는 능력을 방해합니다. CRISPR-Cas9의 이중 대립 유전자 편집 능력의 발견은 주입 된 배아 또는 "크리스펫"의 체세포 조직에서 배아 표현형을 스크리닝 할 수있게하여 발달 프로그램에서 접합 발현 유전자가하는 역할에 대한 이해를 높였습니다. 이 문서에서는 크리스펀트 방법의 확장인 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법에서, 생식 세포의 이중 대립 유전자 편집은 단일 세대 또는 "모체 크리스펫"에서 모성 효과 표현형의 분리를 허용합니다. 단일 표적에 대한 가이드 RNA를 멀티플렉싱하면 모체 크리스펀트의 효율적인 생산을 촉진하는 반면, 모체 크리스펀트 반수체의 서열 분석은 모체 효과 표현형을 생성하는 유전적 병변을 확증하는 간단한 방법을 제공합니다. 모체 크리스펀트의 사용은 필수 모계 발현 유전자의 신속한 식별을 지원하여 조기 발달에 대한 이해를 용이하게합니다.

이 프로토콜에 설명된 실험적 접근 방식을 사용하면 모성 효과 표현형을 빠르고 자원 효율적인 방식으로 식별할 수 있습니다(그림 1).
모성 크리스펀트 생성: 단일 후보 모성 효과 유전자를 표적으로 하는 4개의 가이드 RNA를 설계할 때 가이드 RNA가 DNA에 결합하는 위치를 특별히 고려해야 합니다. 일반적으로, 이들은 모두 첫 번째 예측된 단백질 도메인의 시작 부분에서 가이드 RNA 사이에 최소 또는 전혀 겹치지 않는 영역으로 함께 클러스터링되어야 합니다(그림 2A). 이 도메인에 대한 가이드 RNA를 표적으로 삼으면 프레임 내 및 프레임 외 INDEL이 단백질의 기능에 영향을 미칠 가능성이 높아집니다. 가이드 RNA를 설계할 때 고려해야 할 다른 변수는 절단 효율성과 게놈의 표적 외 부위 수입니다.
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초기 개발은 모계 유전 제품에 의존하며 이러한 제품 중 많은 부분의 역할은 현재 알려져 있지 않습니다. 여기에서는 CRISPR-Cas9를 사용하여 단일 세대에서 모성 효과 표현형을 식별하는 프로토콜을 설명했습니다.

Early development depends on a pool of maternal factors incorporated into the mature oocyte during oogenesis that perform all cellular functions necessary ...

초기 발달 과정에서 많은 모계로 발현 된 유전자의 역할은 현재 알려져 있지 않습니다. 이 모성 CRISPR 기술은 모성 효과 유전자와 발달에서의 역할을 신속하게 식별 할 수있게합니다. 가이드 RNA를 단일 유전자로 멀티플렉싱하면 연구자가 단일 세대에서 새로운 모성 효과 표현형을 식별할 수 있습니다.이 연구는 초기 배아 발생에 필요한 배우자에서 mRNA 전사체의 기능을 이해하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 핵심은 한 세포 단계 초기에 배아를 미세 주입하고 대부분의 가이드 RNA가 주입된 배아에서 체세포 돌연변이를 만들 수 있는지 확인하는 것입니다. 각 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드에 대한 가이드 RNA 주형을 만들기 위해, 상수 올리고뉴클레오티드에 분석물을 넣고 오버행을 T4 DNA 중합효소로 채운다.4개의 가이드 RNA 주형을 조립한 후 DNA 클린업 및 농축기 키트를 사용하여 함께 정제하고 농축합니다. 풀링가이 RNA 주형으로부터 sgRNA 혼합물을 합성하고, 시험관내 T7 전사 키트를 사용하여, 원고에 기재된 바와 같이 시험관내 전사를 수행한다. sgRNA의 무결성을 확인하기 위해 밀리리터당 1%아가로스 0.5마이크로그램, 에티듐 브로마이드 트리스-붕산염-EDTA 겔을 주조하십시오.응고된 겔을 트리스-보레이트-EDTA 실행 완충액에 넣는다. 1 마이크로 리터 sgRNA 혼합물과 1 마이크로 리터 RNA 겔 로딩 완충액을 혼합한다. 이 샘플을 젤에로드하고 100 볼트에서 5 분 동안 젤을 실행하십시오.자외선을 사용하여 밴드를 시각화합니다. 야생형 십자가와 제브라 피쉬 짝짓기 상자를 설치하십시오. 수컷과 암컷 물고기를 같은 탱크에 보관하되 짝짓기 상자 칸막이를 사용하거나 여기에 표시된대로 암컷을 알을 낳는 삽입물 안에 넣어 분리하십시오.주입 칵테일을 조립 한 후 짝짓기 상자 칸막이를 제거하거나 여기에 표시된대로 암컷과 동일한 알을 낳는 삽입물에 수컷을 놓아 수컷과 암컷이 짝짓기하도록합니다. 배아를 동기화하려면 플라스틱 여과기를 사용하여 10 분 후에 배아를 수집하고 1XE3 배지를 사용하여 페트리 접시로 헹굽니다. 10-15개의 배아를 제거하고 별도의 페트리 접시에 넣어 주입되지 않은 대조군으로 보관합니다.나머지 배아를 주입 판 우물로 옮깁니다. 하나의 나노리터 단백질 sgRNA 용액을 하나의 세포 배아의 발달 중인 배반주에 주입합니다. 집게를 사용하여 막힌 바늘의 끝을 부러뜨리고 바늘을 다시 보정하여 1나노리터 볼루스를 배출합니다.주사 후 다음날, 주입되지 않은 플레이트에서 6 개의 건강한 주입 배아와 2 개의 대조 배아를 수집합니다. 각 배아를 PCR 스트립 튜브의 단일 웰에 개별적으로 놓고 튜브 상단에 레이블을 지정합니다. CRISPR-Cas9 표적 부위를 포함하는 100-110개의 염기쌍 DNA 단편을 증폭하기 위해 각 가이드 부위에 고유한 스크리닝 프라이머를 설계합니다.가능하면 표적 부위를 증폭된 단편의 중간에 배치하여 더 큰 결실을 식별할 수 있습니다. 4개의 가이드 표적 부위 각각에 대해 준비된 단일 배아유전체 DNA 5개와 PCR 믹스 20마이크로리터를 사용하여 8개의 25마이크로리터 PCR 반응을 설정하고, 가이드 특이적 스크리닝 프라이머 혼합물을 사용하여 표적 부위의 체세포 돌연변이를 확인합니다. 약 0.625cm 너비의 웰을 만드는 빗을 사용하여 2.5% 아가로오스, 밀리리터당 0.5마이크로그램의 에티듐 브로마이드 트리스-붕산염-EDTA 젤을 주조합니다.그런 다음 응고된 겔을 트리스-붕산염-EDTA 실행 완충액이 포함된 전기영동 챔버에 넣습니다. PCR 산물에 5마이크로리터의 6X 로딩 염료를 추가합니다. 이 혼합물 25마이크로리터를 겔에 로드하여 주입된 샘플과 대조군 샘플이 동일한 겔 행에서 실행되도록 합니다.모든 샘플이 로딩 된 후 트리스-붕산염-EDTA 실행 버퍼 1 리터당 5 마이크로 리터의 에티듐 브로마이드를 젤 상자의 양극 끝에 추가합니다. DNA 금지가 해결되거나 DNA가 차선 끝에 접근 할 때까지 120 볼트에서 젤을 실행하십시오. 모체 효과 표현형과 모체 CRISPR의 배아를 식별하려면 실험 전 오후에 표준 얼룩말 물고기 짝짓기 상자에서 야생형 수컷에 대해 F0 주입 암컷을 설정하고 야생형 교배를 제어했습니다.수컷과 암컷 물고기를 같은 탱크에 넣되 짝짓기 상자 칸막이로 분리하거나 암컷을 알을 낳는 삽입물 안에 넣으십시오. 실험 아침에 짝짓기 상자 칸막이를 제거하거나 수컷을 암컷과 같은 알을 낳는 삽입물에 넣어 수컷과 암컷이 짝짓기를 시작하도록합니다. 알을 낳는 삽입물을 신선한 시스템 물이 들어있는 새로운 짝짓기 탱크 바닥으로 옮겨 10 분마다 배아를 수집하고 개별 F0 암컷을 식별하는 태그로 탱크에 라벨을 붙입니다.오래된 짝짓기 탱크를 가져 와서 T- 스트레이너를 통해 물을 부어 한 개인의 10 분 클러치에서 배아를 수집합니다. 초월 광원으로 해부 현미경으로 매시간, 처음 6-8 시간 동안, 그리고 다음 5 일 동안 매일 발달중인 배아를 관찰하십시오. 잠재적인 모체 CRISPR 배아를 1XE3 배지가 포함된 페트리 접시로 옮기고 수정 후 24시간에 형태학적 표현형을 분석하고 수정 후 5일에 생존력을 분석합니다.실험 전날 오후, 야생형 수컷을 암컷과 물리적으로 분리하거나 짝짓기 상자 분배기를 사용하거나 암컷을 알을 낳는 삽입물에 넣어 F0 암컷의 짝짓기 쌍을 설정합니다. 실험 아침에 물리적 파티션을 제거하여 짝짓기를 시작하십시오. 알을 낳는 첫 징후가 나타나면 수컷과 F0 암컷을 분리하여 번식을 중단하고 분리 된 F0 암컷을 개별 짝짓기 상자에 보관하십시오.체외 수정 후, 모체 CRISPR 표현형이 관찰 될 때까지 반수체 배아가 발달하도록하고 그 배아를 다른 페트리 접시에 넣습니다. 모체 CRISPR 반수체 배아가 확인되면 수정 후 최소 6시간 동안 발달하도록 합니다. 최소 10개의 모체 CRISPR 반수체 배아에서 게놈 DNA를 추출하려면 단일 반수체 배아를 PCR 스트립 튜브의 개별 웰에 넣고 웰에서 과도한 E3 배지를 제거한 다음 50마이크로리터의 50밀리몰 수산화나트륨을 추가합니다.배아를 섭씨 95도에서 20 분 동안 배양하고 섭씨 4도까지 식힌다. 그런 다음 pH 7.5의 1 몰 트리스 염산 5 마이크로 리터를 넣고 5-10 초 동안 와동시킵니다. 어떤 가이드 부위에 인델이 포함되어 있는지 식별하려면 시퀀싱 프라이머를 설계하여 4개의 CRISPR/Cas9 표적 부위를 모두 포함하는 DNA 단편을 증폭합니다.준비된 게놈 DNA 5 마이크로리터 및 시퀀싱 프라이머를 사용하여 배아 당 2개의 25 마이크로리터의 PCR 반응을 설정합니다. PCR이 완료된 후 DNA 클린업 및 농축기 키트를 사용하여 두 샘플을 정제 및 농축하고 정방향 및 역방향 시퀀싱 프라이머를 사용하여 DNA 단편을 Sanger 시퀀싱에 제출합니다. 가이드 RNA는 모두 모계 CRISPR 생성 동안 가이드 RNA 사이에 겹치는 영역이 거의 또는 전혀 없이 함께 클러스터링되어야 합니다.indels가 생성 된 경우, 아가 로스 겔에 주입 된 샘플에서 얼룩이 관찰되어야하지만 주입되지 않은 대조군에서는 관찰되지 않아야합니다. 모성 CRISPR 방법은 가지각색, tmi 및 기운과 같은 알려진 모성 효과 돌연변이를 표현형화하는 데 사용할 수 있습니다. 산모의 CRISPR 표현형에 기여하는 유전적 병변을 확인하기 위해 UV 처리된 정자와 체외 수정을 결합하여 산모의 CRISPR 반수체를 만듭니다.반수체의 생성은 모체 대립 유전자의 Sanger 시퀀싱과 모체 CRISPR indels의 식별을 허용합니다. 모성 효과 표현형을 식별 할 때 표현형이 표적을 벗어나거나 비특이적 효과가 아닌 기능 상실로 인해 발생할 확률을 높이기 때문에 여러 F0 여성에서 관찰 할 수 있어야합니다. 모체 효과 표현형이 확인된 후, 모체 CRISPR 배아는 부비동 골격 또는 DNA 분리와 같은 초기 배아 발생의 다양한 측면에 대한 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.이를 통해 연구자들은 표현형의 분자 원인을 이해할 수 있습니다. 이 방법은 단일 세대에서 알려지지 않은 모계로 발현 된 유전자의 기능을 직접 테스트하여 초기 배아 발생 중에 작용하는 과정에 대한 이해를 촉진합니다.

determining-role-maternally-expressed-genes-early-development-with

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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Blastomere Explants는 배아 개발하는 동안 세포 운명의 헌신에 대해 테스트 할

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조작 및<em&gt; 체외</em의&gt; 성숙<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em세포질 내 정자 주입에 이어&gt; 난 모세포, 배아 발달을 연구하는

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Mouse In Vivo Placental 표적 CRISPR 조작

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zpc:cas9 Knock-in 제브라피시를 사용한 모계 돌연변이 생성

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초기 임신 모체 면역 활성화 마우스 모델 생성을 통해 태아 염증이 신경발달에 미치는 영향을 평가한다

배우세요 CRISPR-Cas9 기법으로 조기 발생에서 모계 효과 유전자를 신속하게 식별하는 방법을 Danio rerio에서. 이 연구는 발생 생물학 연구자들이 모계 발현 유전자의 기능을 단일 세대 내에서 직접 검증할 수 있게 합니다.

모성 크리스펀트를 사용한 초기 발달에서 모계 발현 유전자의 역할 결정

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