Name: 치킨 재조합 사지 분석은 모르포겐, 패터닝 및 세포 분화의 초기 단계를 이해하기 위한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 학습하세요 닭 재조합 사지 분석을 통해 세포 분화와 패턴 형성 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기술은 다양한 생물체의 줄기세포에 적용 가능하여 발생생물학 연구에 활용됩니다.

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그림 2의 이미지를 주신 Estefania Garay-Pacheco와 작품에 대한 Maria Valeria Chimal-Montes de Oca에게 감사드립니다. 이 작품은 Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [보조금 번호 IN211117 및 IN213314] 및 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [보조금 번호 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia]가 JC-M에 수여했습니다. JC M-L은 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887)로부터 박사후 펠로우십을 받았다.

이 연구는 Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexico)의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 기관 검토위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다. 이 프로토콜의 일반적인 단계에 대한 개략적인 순서도가 그림 1A에 나와 있습니다.
1. 배아 배양 및 생존력 결정
<ol><li>수정 된 닭 알을 22 HH 단계에 도달 할 때까지 약 38 ° C 및 60 % 상대 습도에서 약 3 일 반 동안 배양하십시오 (Hamilton and Hamburger, 1951에 따르면)16. 참고 : 갓 수정 된 닭고기 달걀은 최대 일주일 동안 15 ° C에서 보관할 수 있습니다.<ol>
<li>수정 된 난자를 배양하려면 뾰족한면을 가습 인큐베이터에 수직으로 놓습니다. 발달하는 배아가 껍질 막에 달라 붙는 것을 막을 필요가 있으므로 배양 중에 알을 회전시킵니다. 참고 : 수정 된 암탉 알은 지역 농장에서 얻을 수 있습니다. 수정 된 화이트 레그혼 닭 알은 일반적으로 후기 배아에서 깃털의 색소 침착을 피하기 위해 사용됩니다. (1) 사지 중배엽 세포, (2) 사지 외배엽 및 (3) RL을 이식하기 위해 공여체 배아의 세 가지 구조를 얻기 위해 충분한 난자를 별도로 배양하는 것을 고려하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>배양 후 삼 일 반 후에 인큐베이터에서 알을 제거하고 70 % 에탄올로 면봉하고 공기 건조시킵니다.</li>
	<li>발달중인 배아가 난자를 움켜쥐고 혈관을 관찰하고 배아를 찾습니다. 배아가없는 난자는 버리십시오. 참고 :이 시점에서 알을 분배하여 중배엽 세포, 외배엽 및 RL에 대한 숙주를 얻습니다.</li>
</ol>2. 외배엽을 채우기 위해 사지 중배엽 세포 얻기
참고 : 조작을 시작하기 전에 작업 영역, 현미경 및 모든 도구를 70 % 에탄올 용액으로 면도하여 소독하는 것이 좋습니다.
<ol><li>무딘 포셉의 끝으로 달걀 껍질의 무딘 끝을 탭하여 창을 열고 포셉을 사용하여 약 1cm x 1cm의 껍질을 제거하십시오.</li>
	<li>계란을 플라스틱 또는 판지 홀더로 옮기고 스테레오 현미경 아래에 하나씩 놓습니다. 공기 막을 확인한 다음 혈관이 발견되지 않는 작은 구멍을 선택하여 제거하십시오. 미세한 수술 포셉의 도움으로이 부위를 당기십시오. 참고 : 공기 막은 달걀을 창으로 만든 직후에 관찰 된 흰색과 불투명 한 막으로 식별 할 수 있습니다.<ol>
<li>배아와 접촉 할 수있는 작은 달걀 껍질 조각을 제거하십시오. 참고: 프로토콜을 시작하기 전에 배아가 22 HH 단계에 있는지 확인하십시오. 초기 단계의 배아는 달걀 껍질 창을 테이프로 밀봉 한 후 인큐베이터로 되돌릴 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미세한 수술 포셉을 사용하여 양수를 찢어서 양수 낭을 완전히 엽니 다( 자료 표 참조). 참고 : 양수는 배아를 밀접하게 덮고 양수로 채워진 투명한 막으로 식별 될 수 있습니다.</li>
	<li>한 쌍의 무딘 포셉을 사용하여 난자로부터 배아를 조심스럽게 제거한 다음 빙냉 인산염 완충 식염수 용액 (1x PBS)이 들어있는 멸균 페트리 접시로 옮깁니다. 나머지 계란에 대해이 단계를 반복하십시오. ~ 8-10 개의 배아 만이 중배엽 세포를 얻기에 충분하다고 생각하십시오.</li>
	<li>배아를 빙냉 1x PBS로 한 번 세척하고, 입체 현미경 ( 표 참조)의 도움으로 남아있는 막을 철회하십시오. 뒷다리 새싹을 찾으십시오. 참고 : 사지 새싹은 옆구리에서 돌출부로 배아의 전후 축을 따라 위치한 둥근 구조입니다. 뒷다리는 앞다리보다 뒤쪽에 더 많이 위치합니다.</li>
	<li>배아를 깨끗한 1x PBS로 유지하고, 한 쌍의 미세한 수술 포셉을 사용하여, 각 뒷다리 새싹을 세로로 저격한다. 배아의 옆구리에 매우 가깝게 새싹을 잘라 전체 뒷다리 새싹을 해부하십시오. 나머지 배아와 함께이 단계를 반복하십시오.</li>
	<li>플라스틱 이송 피펫을 사용하여 사지 새싹을 빈 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>피펫 팁을 사용하여 1x PBS의 과량을 제거하고 PBS를 500 μL의 0.5% 트립신 용액으로 대체 한다(표 참조). 사지 새싹을 37°C에서 7분 동안 열블록으로 인큐베이션한다.</li>
	<li>트립신 용액을 제거하고 행크스 밸런스드 소금 용액 ( 재료 표 참조)에서 2 mg / mL의 콜라게나제 유형 IV 500 μL로 교체 한 다음 37 °C의 온도 블록에서 8 분 동안 배양하십시오. 참고: 트립신 인큐베이션은 외배엽을 약간 분리하는 반면, 콜라게나제는 중배엽 세포를 분해합니다.</li>
	<li>배양 후, 가능한 한 많은 콜라게나제를 제거하고 10% 우태아 혈청(FBS)이 보충된 차가운 둘베코 변형 이글 배지(DMEM-HG) 배지 1mL로 교체하여 효소를 불활성화시킨다. 혼합물을 부드럽게 ~ 10 번 피펫하십시오.</li>
	<li>세포를 함유하는 현탁액을 70 μm의 세포 스트레이너로 여과하여 외배엽을 남긴다. 참고 : 여과는 소화되지 않은 사지 새싹을 제거하여 단일 세포의 현탁액을 남깁니다.</li>
	<li>여과 후, 현탁액을 다시 5-10회 피펫하고, 실온에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리한 다음, 상층액을 버린다.</li>
	<li>10% FBS가 보충된 DMEM-HG 1ml를 사용하여 과량의 콜라게나제를 세척하십시오. 현탁액을 실온에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리한다.</li>
	<li>피펫팅으로 배지를 조심스럽게 버린 다음 튜브 바닥의 세포를 방해하지 않고 10% FBS가 보충된 신선한 DMEM-HG 1mL로 교체합니다.</li>
	<li>세포가 열블록 중에서 37°C에서 1-1.5시간 동안 인큐베이션한 후 조밀한 펠릿(재응집)을 형성하도록 허용한다. 참고 : 중배엽 세포가 펠렛을 형성하는 동안, 사지 외배엽을 얻는 것이 편리합니다.</li>
</ol>3. 사지 외배엽 얻기
<ol><li>외배엽을 얻기 위해 선택된 다른 22개의 HH 닭 배아와 별도로 섹션 2의 1-6단계를 반복한다. 참고: 이 목적을 위한 배아의 수는 원하는 RL의 최종 수에 비례합니다. 2:1 외배엽-RL의 비율이 적절하다.</li>
	<li>뒷다리 새싹을 얻은 후 플라스틱 피펫을 사용하여 빈 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 임의의 과량의 1x PBS를 제거하고 멸균된 1x PBS 중의 0.5% 트립신 500 μL로 교체한다. 상기 혼합물을 37°C에서 30분 동안 열블록으로 인큐베이션한다.</li>
	<li>효소 소화 후, 사지 새싹이 들어있는 트립신 용액을 멸균 페트리 접시에 옮깁니다.</li>
	<li>마이크로피펫을 사용하여 과량의 트립신을 가능한 한 많이 제거하고; 모든 사지 새싹이 덮일 때까지 FBS의 10 %가 보충 된 얼음처럼 차가운 1x PBS로 페트리 접시에 홍수를 일으 킵니다. 참고 : FBS는 말 혈청을 대체 할 수 있습니다.</li>
	<li>입체 현미경으로 사지 새싹을 확인; 외배엽을 사지 중배엽 세포로부터 약간 분리된 투명한 막으로 확인한다(도 1B).</li>
	<li>미세한 수술 포셉의 도움으로 사지 새싹의 가장 근위 끝을 잡고 조심스럽게 다른 포셉을 사용하여 외배엽 층을 분리하고 분리하십시오. 참고 : 외배엽을 얻는 것은 중배엽 세포가 뭉쳐서 외배엽에 부착되어 끈적 거리기 때문에 어려울 수 있습니다. 페트리 접시의 외배엽 만 유지하기 위해 중배엽 세포를 지속적으로 버리는 것이 좋습니다.</li>
	<li>외배엽을 얼음처럼 차가운 1x PBS-10% FBS 용액으로 유지하십시오. 참고: 외배엽은 재응집된 중배엽이 준비되지 않은 경우 4°C에서 보관할 수 있습니다. 그러나, 펠렛의 인큐베이션 시간을 외배엽 수득과 함께 조정하는 것이 바람직하다.</li>
</ol>4. 외배엽 덮개 안쪽에 중배엽 세포 조립
참고 : 이를 위해서는 중배엽 세포의 형성된 펠렛을 포함하는 멸균 된 1x PBS-10 % FBS 용액이있는 페트리 접시에 빈 외배엽이 있어야합니다.
<ol><li>펠렛이 형성된 후(섹션 2 참조), 피펫팅에 의해 튜브로부터 ∼600 μL의 배지를 버린다.</li>
	<li>피펫 팁을 사용하여 펠렛을 바닥에서 조심스럽게 분리하고 부수거나 파괴하지 마십시오.</li>
	<li>펠릿이 튜브 바닥에서 완전히 분리되면 튜브를 거꾸로 돌려 펠렛을 빈 외배엽이 들어있는 페트리 접시로 옮깁니다 (그림 1C).</li>
	<li>한 쌍의 미세 수술 포셉의 도움으로 펠렛의 작은 조각을 자르고 외배엽에 가능한 한 가깝게 놓습니다.</li>
	<li>가방 인 것처럼 외과 용 포셉으로 외배엽을 열고 펠릿 조각을 외피 덮개에 가능한 한 단단히 넣으십시오. 원하는 만큼 많은 RL에 대해 이 단계를 반복합니다(그림 1D). 참고: 펠렛의 조각을 하나씩 자르고, 외배엽을 채워 1x PBS-10% FBS 용액을 깨끗하게 유지한다. 펠릿의 크기는 각 외배엽에 해당해야합니다.</li>
	<li>외배엽과 중배엽이 실온에서 ~ 30 분 동안 함께 치유되도록 한 다음 배아 숙주에 이식하십시오. 사용하지 않은 외배엽과 중배엽은 버리십시오.</li>
</ol>5. 채워진 외배엽을 숙주 배아에 이식 
 
참고 : 외배엽을 이식하기 전에 벤치 탑에서 서로 옆에 두 개의 입체 현미경을 배치하십시오.이 현미경은 배아 조작 및 RL 이식을위한 것입니다. 다른 하나는 채워진 외배엽을 배아로 옮길 준비가되어있는 상태로 유지하기위한 것입니다.
<ol><li>채워진 외배엽을 이식하기 위해 원하는 알의 수를 선택하십시오.</li>
	<li>무딘 포셉의 끝을 사용하여 22 HH 숙주 배아의 달걀 껍질을 탭하여 창을 엽니 다. 공기 막을 확인하고 한 쌍의 미세 수술 포셉을 사용하여 완전히 제거하십시오.</li>
	<li>앞다리 근처의 양수 낭을 열어 배아의 오른쪽 측면을 노출시킵니다. 절차를 수행하는 데 필요한 금액 만 엽니 다.</li>
	<li>앞다리 위치에 따라 텅스텐 바늘 ( 재료 표 참조)으로 상처를 긁어 내고 2-3 개의 somites의 길이로 상처를 긁어 내고 출혈이 생길 때까지 중배엽을 약간 손상시킵니다.</li>
	<li>채워진 외배엽 (RL)을 병아리 배아 내로 개별적으로 옮기고 재조합 사지의 기저부를 소마이트 상처 위에 놓습니다. 참고 : RL 전송은 플라스틱 피펫 또는 각진 슬릿 나이프로 수행 할 수 있습니다.</li>
	<li>직경 0.025mm와 길이 0.5-1mm의 팔라듐 와이어 두 개로 RL을 올바르게 고정 합니다(재료 표 참조). RL의 기저부를 상처와 정렬하여 숙주 배아의 옆구리에 부착되고 혈관화되도록 한다(도 1E).</li>
	<li>창문을 테이프로 봉인하고 계란을 인큐베이터로 돌려 보내십시오. 분석을 위해 원하는 시점에서 배아를 수집하십시오.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

일반적으로, RL 프로토콜은 다섯 단계로 나눌 수 있다: (1) 배아 배양, (2) 외배엽을 채우기 위한 사지 중배엽 세포 획득, (3) 외배엽을 얻는 것, (4) 외배엽 덮개 내부에 중배엽 세포를 조립하는 것, 및 (5) 채워진 외배엽을 숙주 배아로 이식하는 것. RL 기술의 주요 한계는 길고 상세한 프로토콜이며, 이는 적절하게 수행하기 위해 인내심이 필요한 많은 중요한 포인트를 가지고 있습니다. 프로토콜을 성공적으로 완료하려면 중요한 순간을 식별해야 합니다. 중배엽 세포 조달 동안, 세포의 완전성과 생존 가능성은 필수적입니다. 세포 사멸은 적절한 RL 발달을 방해할 것이다. 비슷한 맥락에서 중배엽과 외배엽 세포 간의 상호 작용을 보장하기 위해 올바른 외배엽 조작이 필요합니다. 외배엽이 채워질 때, 중배엽 세포는 AER 아래의 원위 외배엽에 가능한 한 가까이 있어야 한다. 중배엽 및 외배엽 조달을 위해서는 기증자 배아의 발달 단계도 중요합니다. 중배엽 세포는 발달 단계에 따라 차별적으로 반응 할 것이라고 생각해야합니다. 그러나...

척추동물 사지는 세포 분화, 세포 증식, 세포 사멸, 패턴 형성 및 형태형성 1,2를 연구하기 위한 강력한 모델이다. 발달 동안, 팔다리는 측방 플레이트 중배엽1에서 유래 된 세포로부터 팽창으로 나타난다. 사지 새싹은 외배엽으로 덮인 중배엽 세포의 중심 코어로 구성됩니다. 이 초기 구조에서 전체적으로 잘 형성된 팔다리가 나타납니다. 사지 새싹이 발생한 후, (1) 근위 원위 축 ([PD] 어깨에서 손가락까지), (2) 등 - 복부 축 ([DV]손등에서 손바닥까지), (3) 전방 - 후부 ([AP] 엄지 손가락에서 손가락까지)의 세 축이 인식됩니다. 근위 - 원위 축은 사지 새싹의 원위 끝에 위치한 정점 외배엽 능선 (AER)에 달려 있습니다. AER은 신호2,3을 수신하는 세포의 성장, 생존 유지, 증식 및 미분화 상태에 요구된다. 한편, 편광 활동 영역(ZPA)은 전후 패터닝(4)을 제어하고, 등쪽 및 외배엽은 등쪽 패터닝(7,8)을 제어한다. 입체 패터닝의 통합은 이 세 축 사이의 복잡한 누화를 의미한다5. 사지 발달 중 분자 경로를 이해했음에도 불구하고, 전체 사지를 형성하기 위해 패턴화와 적절한 성장을 조절하는 메커니즘에 대한 열린 질문은 여전히 답이 없습니다.
Edgar Zwilling 는 1964 년에 재조합 사지 (RL) 시스템을 개발하여 사지 중간엽 세포와 외배엽 사이의 상호 작용을 연구했습니다6. RL 시스템은 해리된 재응집된 사지 새싹 중배엽을 배아 사지 외배엽으로 조립하여 공여체 병아리 배아의 등쪽 부분으로 이식한다. 외배엽에 의해 제공되는 신호는 시공간 방식으로 분화 유전자 및 패터닝 유전자의 발현을 유도하고, 따라서 사지 발달 동안 발생하는 세포 프로그램을 재편성할 수 있는 사지 유사 구조의 형성을 유도한다 7,8,9.
RL 모델은 사지 성분의 특성과 중배엽 및 외배엽 세포 사이의 상호작용을 이해하는데가치가 있다6. RL은 외배엽 커버(6) 내부의 사지 새싹 중배엽 세포를 실험적으로 조립 또는 재결합함으로써 생성된 사지 유사 구조로서 정의될 수 있다. RL의 형태형성은 외배엽 패터닝 신호에 반응할 중배엽 세포(또는 다른 유형)의 특성에 의존한다. 이 실험 시스템의 장점 중 하나는 다재다능하다는 것입니다. 이 특성은 중배엽 세포의 공급원, 예를 들어 다른 발달 단계의 세포, 사지를 따라 다른 위치에서, 또는 전체 (해리되지 않은) 또는 재응집 된 세포 7,8,9,10을 변화시킴으로써 다중 조합의 생성을 허용한다. 또 다른 예는 닭 이외의 종, 예를 들어, 거북이11, 메추라기, 또는 마우스12로부터 배아 외배엽을 수득하는 능력이다.
이러한 의미에서, RL 기술은 진화론적 관점에서 사지 발달과 사지 중간엽과 외배엽 세포 사이의 상호작용을 연구하는 데 도움이 된다. 이 기술은 또한 배아 외배엽12,13,14에 의해 제공된 신호를 이용함으로써 사지 유사 구조로 분화하는 선조 세포의 상이한 공급원의 능력을 분석하는 데 큰 잠재력을 갖는다. 시험관내 배양과는 달리, RL은 발달하는 사지(9,15)로부터의 배아 신호를 해석함으로써 세포 집단의 분화 및 형태형성 잠재력을 평가할 수 있게 한다.
이 프로토콜에서, 재응집된 중배엽 사지 새싹 세포와 함께 성공적인 RL을 수행하기 위한 단계별 가이드가 제공되고, 따라서 재응집된 세포의 상이한 공급원 또는 심지어 상이한 외배엽 공급원과 함께 이 프로토콜을 적응시킬 수 있는 가능성을 열어준다.

<table><tbody><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A5268</td><td></td></tr><tr><td>각진 슬릿 나이프</td><td>Alcon</td><td>2.75mm DB</td><td></td></tr><tr><td>무딘 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 IV 유형</td><td>Gibco</td><td>1704-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>계란 부화기</td><td>Incumatic de Mexico</td><td>Incumatic 1000</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco</td><td>16000069</td><td></td></tr><tr><td>Fine 수술용 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>9115-10</td><td></td></tr><tr><td>행크스 균형 잡힌 소금 용액</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>팔라듐 와이어</td><td>GoodFellow</td><td>7440 05-3</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>둥지</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>crmglobe</td><td>PF1016</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>테이프</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>트립신 돼지</td><td>Merck</td><td>9002 07-7</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 바늘</td><td>GoodFellow</td><td>E74-15096/01</td><td></td></tr></tbody></table>

치킨 재조합 사지 분석은 모르포겐, 패터닝 및 세포 분화의 초기 단계를 이해하기 위한

Chicken Recombinant Limbs Assay to Understand Morphogenesis, Patterning, and Early Steps in Cell Differentiation

세포 분화는 조직 및 장기 발달 동안 다양한 특수 세포 유형의 형성으로 이어지는 세포 투입의 미세 조정 과정입니다. 이 과정은 성인기에 적극적으로 유지됩니다. 세포 분화는 장기의 발달 및 항상성 동안 진행중인 과정입니다. 세포 분화의 초기 단계를 이해하는 것은 형태 형성과 같은 다른 복잡한 과정을 아는 데 필수적입니다. 따라서, 재조합 닭 팔다리는 배아 패터닝 신호 하에서 세포 분화 및 패턴 생성의 연구를 허용하는 실험 모델이다. 이 실험 모델은 생체내 환경을 모방하고; 그것은 초기 사지 새싹에서 얻은 외배엽 덮개로 재결합 된 세포를 조립합니다. 나중에, 외배엽은 병아리 배아 수용체에 옮겨지고 이식되어 발달을 허용합니다. 이 분석은 주로 중배엽 사지 새싹 세포를 평가하기 위해 사용되었다; 그러나, 다른 줄기 또는 다른 유기체로부터의 전구 세포에 적용될 수 있다.

잘 수행 된 재조합 사지를 인식 이식 후, 조작된 배아를 인큐베이터로 복귀시켜 RL이 발달할 수 있도록 하였다. 배양 시간은 실험의 요구 사항과 상관 관계가 있습니다. 그럼에도 불구하고, RL은 이식 12시간 후에 쉽게 구별될 수 있다. 이식이 적절한지 여부를 결정하기 위해, RL을 공여체 배아의 중배엽 벽에 단단히 부착시킨 돌출부로서 관찰하였다(도 2A). 반대로, 세포 생존성 및/또는 이식편이 실패하였든, RL은 중배엽 벽으로부터 분리되거나 거친 형태를 나타내었다(도 2B).
재조합 팔다리의 형태 학적 및 패턴 검사 형태학적 검사를 위해, RL을 Alcian blue17 로 염색하여 골격 요소의 형성과 이들의 패터닝을 관찰하였다. 절차 중에 RL이 누락되지 ...

재조합 팔다리는 배아 신호의 영향으로 세포 분화 과정과 패턴 생성을 연구 할 수있는 강력한 실험 모델입니다. 이 프로토콜은 상이한 유기체로부터 수득된 다른 세포 유형에 적응할 수 있는 닭 사지-중배엽 세포로 재조합 사지를 생성하는 상세한 방법을 제시한다.

Cell differentiation is the fine-tuned process of cell commitment leading to the formation of different specialized cell types during the establishment of ...

재조합 팔다리는 생체 내 환경에서 배아 신호의 영향 하에서 세포 분화 및 동력 형성 과정에서 연구를 위한 강력한 모델이다. 이 분석은 닭 사지 발달 생물학에 국한되지 않고 잠재적 인 적용을 허용하는 여러 변형을 허용합니다. 그것은 다른 줄기 또는 다른 유기체로부터의 선조에 적용될 수 있다.시작하려면 사흘 반 후에 인큐베이터에서 알을 제거하고 70 % 에탄올로 면봉 한 다음 공기 건조에 두십시오. 다음으로, 난자를 캔들링하고 혈관을 관찰하여 발달중인 배아를 확인하고 찾습니다. 배아가없는 난자는 버리십시오.한 쌍의 무딘 포셉 끝이있는 달걀 껍질의 무딘 끝을 탭하여 창을 열고 포셉을 사용하여 껍질의 약 한 평방 센티미터를 제거하십시오. 그런 다음 계란을 플라스틱 또는 판지 홀더로 옮기십시오. 계란을 입체 현미경 아래에 하나씩 놓습니다.공기 막을 확인하고 용기가없는 지역의 작은 구멍을 선택하여 제거하십시오. 미세한 외과 용 포셉의 도움으로이 부위를 꺼내고 배아와 접촉하는 달걀 껍질 조각을 제거하십시오. 미세한 수술 포셉으로 양수 낭을 찢어 버립니다.무딘 포셉으로 계란에서 배아를 조심스럽게 제거하고 얼음처럼 차가운 1x PBS가 들어있는 멸균 페트리 접시에 옮깁니다. 배아를 빙냉 1x PBS로 1회 세척하고 입체현미경으로 남아있는 막을 회수한다. 그런 다음 뒷다리 새싹을 찾으십시오.각 뒷다리 새싹을 세로로 자르고 미세한 수술 포셉으로 배아 측면에 매우 가깝게 자릅니다. 배아를 1x PBS로 유지한다. 그런 다음 사지 새싹을 플라스틱 이송 피펫이있는 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다.다음으로, PBS를 500 마이크로리터의 0.5% 트립신 용액으로 교체한다. 사지 새싹을 섭씨 37도에서 7 분 동안 온도 차단에 배양하십시오. 그런 다음 트립신 용액을 HBSS에서 밀리리터 콜라게나제 유형 네 개당 두 밀리그램의 500 마이크로리터로 교체하고 또 다른 8분 동안 써모블록에서 인큐베이션한다.가능한 한 많은 콜라게나제를 제거하고 효소를 불활성화시키기 위해 10 % FBS가있는 차가운 고 포도당 DMEM 1 밀리리터로 대체하십시오. 혼합물을 약 10 배 부드럽게 피펫하십시오. 세포를 포함하는 현탁액을 70 마이크로미터 세포 스트레이너로 여과하여 외배엽을 남긴다.현탁액을 다시 약 5 내지 10회 정도 피펫하고, 실온에서 5분 동안 200배 g에서 원심분리한다. 그런 다음 상청액을 버리십시오. 과량의 콜라게나제를 한 밀리리터의 배지로 세척한 다음, 현탁액을 원심분리하고 배지를 조심스럽게 버린다.다음으로, 세포를 방해하지 않고 1.5 밀리리터의 배지를 첨가하고 온도 블록에서 섭씨 37도에서 1 ~ 1.5 시간 동안 배양하여 세포가 컴팩트 한 펠렛을 형성 할 수있게하십시오. 뒷다리 새싹을 얻은 후 플라스틱 피펫이있는 빈 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 과량의 1x PBS를 제거하고 멸균 1x PBS에서 0.5 % 트립신 500 마이크로 리터로 교체하십시오.혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 열블록으로 인큐베이션한다. 사지 새싹이있는 트립신 용액을 멸균 된 페트리 접시에 옮기십시오. 그런 다음 가능한 한 많은 양의 과도한 트립신을 제거하고 모든 사지 새싹이 덮일 때까지 얼음처럼 차가운 1x PBS로 페트리 접시에 10 % FBS를 넘깁니다.입체 현미경으로 사지 새싹을 확인하십시오. 다음으로, 외배엽을 사지 중배엽 세포로부터 약간 분리된 투명한 막으로 확인한다. 미세한 수술 포셉으로 사지 새싹의 가장 근위 끝을 유지하는 포셉으로 외배엽을 분리하고 분리하십시오.이전 단계에서 중배엽 펠렛을 가져 와서 약 600 마이크로 리터의 배지를 버리십시오. 그런 다음 조심스럽게 피펫 팁으로 펠렛을 부수지 않고 분리하십시오. 튜브를 거꾸로 뒤집어 펠릿을 빈 외배엽이 들어있는 페트리 접시로 옮깁니다.한 쌍의 미세 수술 포셉으로 펠릿의 작은 조각을 자르고 가능한 한 외배엽에 가깝게 놓습니다. 외과 용 포셉으로 외배엽을 열고 펠렛을 가능한 한 단단히 외피 홀에 넣으십시오. 앞다리 근처의 양수 낭을 열어 배아의 오른쪽 측면을 노출시킵니다.앞다리 위치에 따라 텅스텐 바늘로 상처를 긁어 두세 개의 소미트 길이로 긁어 내고 출혈이 생길 때까지 중배엽을 약간 손상시킵니다. 재조합 팔다리를 병아리 배아로 개별적으로 옮기고 소마이트 상처 위에 그 기초를 놓습니다. 팔라듐 와이어 두 조각으로 재조합 사지를 올바르게 고정하십시오.재조합 사지의 기저부를 상처와 정렬하십시오. 테이프로 창을 봉인하고 계란을 인큐베이터로 되돌립니다. 성공적인 이식에서, 재조합 사지는 공여체 배아의 중배엽 벽에 단단히 부착된 돌출부로서 관찰되었다.반대로, 재조합 사지는 중배엽 벽으로부터 분리되거나 세포 생존성 또는 이식편이 실패했을 때 거친 형태학을 제시하였다. 알시안 블루 염색은 육일 닭, 닭 재조합 사지에서 골격 요소를 입증했다. 알시안 블루를 클리어하기 전에, 에탄올 중의 이미지들이 형태학적 및 정량적 측정을 위해 얻어졌다.H&E 염색 또는 염색되지 않은 팔다리를 슬라이스하여 조직 및 세포를 관찰하였다. 이 기술은 생체 내에서 사지 오가노이드를 개발하고 다른 공급원 또는 종의 줄기 세포를 사용하여 세포 분화 또는 형태 형성 과정을 연구 할 수 있습니다.

chicken-recombinant-limbs-assay-to-understand-morphogenesis

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 현장 하이브리드화, 2 개의 다른 유전자의 공간과 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 배아에서 시각 될 수있는 방법 2 색 전체 마운트를 보여줍니다. 이 방법은 원래 데이비드 윌킨슨, 도밍고스 헨리크, 필 잉엄 데이비드 이쉬 - Horowicz에 의해 도입되었다.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

신경 유도는 뇌의 형성의 첫 단계입니다. 그것은 Hensen의 노드 (주최자), 신경 운명을 채택할에 인접한 조직을 지시하는 메커니즘이며, 신경 계통을 일으키다하는 즉. 이 비디오는 여자의 배아에서 신경 유도에 대한 분석을 보여줍니다.

칙의 배아에서 신경 유도에 대한 분석

이 문서는 craniofacial 개발 중에 신호 및 표면 두부 ectoderm의 patterning 속성을 테스트하도록 설계되었습니다 조직 이식 기술을 설명합니다.

Craniofacial 개발 과정 Ectodermal 상피 조직의 신호 특성을 평가

초기 여자는 배아에서 Morphogenetic 조직 Deformations 추적

성장 인자 또는 신호 전달 경로의 특정 억제제에 적신 구슬을 발달 중인 배아에 접목함으로써 생체 내에서 그 효과를 직접 테스트할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 비드를 사지 싹에 이식하여 이러한 분자가 유전자 발현 및 신호 전달에 미치는 영향을 확인합니다.

유전자 발현에 영향을 미치는 신호 전달 진학을 확인하기 위해 닭 배아 사지 개발에 구슬의 접목

사지 형성에 필요한 병아리 배아에서 본체 축과 측면 조직 사이의 유도 이벤트를 차단하기 위해 불침투성 장벽을 사용하는 프로토콜이 설명되어 있습니다. 후보 유도 신호에 적신 구슬은 장벽 배치의 영향을 극복하는 데 사용되며 유전자 발현 분석을 통해 이를 확인할 수 있습니다.

후보 인자 젖 구슬과 결합하여 불 침투성 장벽의 응용 프로그램은 병아리에서 유도 신호를 공부하기

침지된 비드 분석은 세포 분화 및 형태형성의 조절을 연구하기 위해 임의의 발달 시점에서 시험 시약의 표적화된 전달을 포함한다. 세 가지 다른 유형의 침지 된 구슬을 준비하고 닭 배아의 교차 숫자에 이식하기위한 모든 실험 동물 모델에 적용 가능한 상세한 프로토콜이 제시됩니다.

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줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

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