Name: 광유전학을 사용하여 신경 가소성을 역전시키고 쥐에서 코카인 추구를 억제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 배우세요 광유전학을 사용하여 쥐의 코카인 추구 행동을 억제하는 방법을. 시상-편도체 회로에서 장기억제를 유도하여 약물 재발을 촉진하는 신경 가소성을 역전시키는 기술입니다.

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저자는 USPHS 보조금 K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) 및 펜실베니아 보건부의 지원을 인정하고자합니다.

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</ol>

공개 할 것이 없습니다.

위에서 설명한 것처럼 적절한 실험 결과를 얻는 데 중요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이 프로토콜은 코카인자가 투여를 적절하게 획득 한 동물에서만 효과적 일 수 있으며 현재까지는 위에 설명 된 매개 변수를 사용하여 테스트되었습니다. 코카인 복용량, 강화 일정 및 큐 매개 변수는 행동 결과에 거의 영향을 미치지 않고 수정 될 수 있지만, 2 차 강화 일정은 편도체 독립적 인 코카인 탐색으로 이어질 수 있다는 점을 제외하고는 절차의 효능을 감소시킬 수 있지만 직접 테스트되지는 않았지만14 . 프로토콜 전반에 걸쳐 광섬유의 적절한 구성과 기능을 검증하는 것이 성공적인 광학 자극을 보장하는 데 도움이 되는 몇 가지 사항이 있습니다. 헤드 캡의 손실을 방지하고 광섬유 연마를 위해 페룰을 적절하게 채점하고 임플란트를 통한 광 출력 손실이 30 %를 초과하지 않는지 테스트해야합니다9. 또한 레이저 자극 매개 변수는 중요한 고려 사항입니다. 레이저는 상...

약물 남용은 미국과 전 세계적으로 매우 심각한 공중 보건 문제입니다. 수십 년간의 집중적인 연구에도 불구하고 효과적인 치료 옵션은 거의 없습니다 1,2. 치료의 주요 차질은 만성 약물 사용이 환경 단서와 약물 자체 사이에 장기적인 연관 기억을 생성한다는 사실입니다. 약물 관련 단서에 다시 노출되면 지속적인 약물 사용과 재발을 유발하는 생리적 및 행동적 반응을유도합니다3. 새로운 치료 전략은 약물 큐 연관성을 조절하는 데 관련된 회로를 조작하는 것을 목표로하는 기억 기반 치료법을 제정하는 것입니다. 최근에, 측면 편도체 (LA)의 시냅스, 특히 시상의 내측 생식기 핵 (MGN)에서 발생하는 시냅스는 반복적 인 큐 관련 코카인자가 투여에 의해 강화되며,이 강화는 코카인 추구 행동 4,5를 지원할 수 있음이 관찰되었습니다. 따라서 MGN-LA 시냅스에서 가소성을 역전시킴으로써 큐 유도 복원이 감쇠 될 수 있다고 제안되었습니다.
특정 뇌 회로의 시냅스 가소성을 정확하게 표적화하는 능력은 이 분야의 주요 과제였습니다. 전통적인 약리학 적 도구는 재발 행동을 줄이는 데 어느 정도 성공했지만 개별 시냅스를 조작 할 수 없기 때문에 제한적입니다. 그러나 최근 생체 내 광유전학의 개발은 이러한 한계를 극복하고 시간적 및 공간적 정밀도로 신경 경로를 제어하는 데 필요한 도구를 제공했습니다6,7,8. 특정 뇌 회로에서 빛에 민감한 옵신을 표현함으로써 레이저 광을 사용하여 회로를 활성화하거나 억제 할 수 있습니다. 주파수 의존적 광 자극은 행동하는 동물에서 회로의 시냅스 가소성을 구체적으로 조작하는 데 활용 될 수 있습니다.
이 원고는 생체 내 광유전학을 사용하여 행동적으로 관련된 MGN-LA 회로를 조작하기 위해 취한 절차를 간략하게 설명합니다. 먼저, 흥분성 옵신 oChIEF를 MGN에서 발현시키고 광섬유를 LA에 양측으로 이식하였다. 그런 다음 동물들은 MGN-LA 경로를 강화하는 큐 의존적 방식으로 코카인을자가 투여하도록 훈련 받았습니다. 다음으로, 473nm 레이저 광을 사용한 지속적인 저주파 자극을 사용하여 회로 별 LTD를 생성했습니다. 코카인 사용으로 유도 된 가소성을 역전시키는 것은 마약 추구 행동과 관련된 행동을 유발하는 단서의 능력을 오래 지속시키는 감소를 일으켰습니다.

<table><tbody><tr><td>0.9% 식염수</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0291799</td><td></td></tr><tr><td>A.M.P.I. 자극 아이솔레이터</td><td>Iso-Flex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato</td><td>Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien)</td><td>#268</td><td>See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014</td></tr><tr><td>AAV5.hSyn.tdTomato (Control)</td><td>Duke Viral Vector Core Control</td><td></td><td>Lin et al., 2009 참조; Nabavi et al., 2014</td></tr><tr><td>Artificial Tears (Ophhalmic Ointment)</td><td>Covetrus</td><td>70349</td><td></td></tr><tr><td>ATP 마그네슘 소금</td><td>Fisher Scientific</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Butler Schein</td><td>38250</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>염화 세슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>289329</td><td></td></tr><tr><td>세슘 수산화물</td><td>Fisher Scientific</td><td>516988</td><td></td></tr><tr><td>세슘 메탄설포네이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>코카인 HCl</td><td>NIDA 약물 공급 센터</td><td>9041-001</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>라이카</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>D-글루코스</td><td>시그마-알드리치</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP231-1</td><td></td></tr><tr><td>듀얼 채널 온도 컨트롤러</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>피츠버그 대학교 화학 창고</td><td>200C5000</td><td></td></tr><tr><td>페룰 먼지 캡</td><td>Thor Labs</td><td>CAPL</td><td>1.25mm 페룰</td></tr> 페<tr><td>룰 짝짓기 슬리브</td><td>Doric 렌즈</td> 용 흰색 플라스틱 먼지 캡 <td>F210-3011</td><td>Sleeve_BR_1.25, 청동, 1.25 mm ID</td></tr><tr><td>페룰</td><td>정밀 섬유 제품</td><td>MM-FER2007C-2300</td><td>&Oslash; 1.25 mm 다중 모드 LC/PC 세라믹 페룰, &Oslash; 230 &뮤; m 구멍 크기</td></tr><tr><td>광섬유</td><td>Thor Labs</td><td>FP200URT</td><td>200 &mu; m core 다중 모드 광섬유 (0.5 NA)</td></tr> <tr><td>광섬유 로터리 조인트</td><td>Prizmatix</td> <td>(아마존에서 주문)</td> <td>직경 18mm, 광섬유</td></tr><tr><td>스트리핑 도구</td> 용 FC-FC 커넥터 <td>Thor Labs</td><td>T12S21</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield with DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Henry Schein</td><td>6913</td><td></td></tr><tr><td>GTP 나트륨 염</td><td>Fisher Scientific</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 주사기</td><td>해밀턴</td><td>80085</td><td>10 &mu; L 볼륨, 26 게이지, 2 인치, 포인트 스타일 3</td></tr><tr><td>히트 건</td><td>Allied Electronics</td><td>972-6966</td><td>250 V, 750-800 &deg; F</td></tr><tr><td>열경화 에폭시</td><td>정밀 섬유 제품</td><td>PFP-353ND-8OZ</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Henry Schein</td><td>55737</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Fisher Scientific</td><td>219405490</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>케타민 HCl</td><td>Henry Schein</td><td>55853</td><td>케타민은 규제 물질이므로 기관 지침에 따라 취급해야 합니다</td></tr><tr><td>. s</td><td>Henry Schein</td><td>9846</td><td></td></tr><tr><td>레이저, 드라이버 및 레이저-광섬유 커플러</td><td>OEM 레이저 시스템</td><td>BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0</td><td>100 mW, 473-nm, 다이오드 펌핑 고체 레이저(1가지 옵션)</td></tr><tr><td>L-글루타티온</td><td>Fisher Scientific</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>리도카인</td><td>버틀러 Schein</td><td>14583</td><td></td></tr><tr><td>광 센서</td><td>Thor Labs</td><td>PM100D</td><td>디지털 디스플레이가 있는 소형 에너지 미터 콘솔</td></tr><tr><td>록타이트 순간 접착제</td><td>Grainger</td><td>5E207</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td><td>시그마-알드리치 203726</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미세 전극 증폭기/데이터 수집</td><td>분자 장치</td><td>MULTICLAMP700B / Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>마이크로인젝터 펌프</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4501</td><td>이중 주사기</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200/ROE-200</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>전기생리학용 직립 현미경</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>BX61VS</td><td>에피 형광 슬라이드 스캐닝 현미경</td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td></td></tr><tr><td>Orthojet 치과 시멘트, 액체</td><td>Lang Dental</td><td>1504BLK</td><td>블랙</td></tr><tr><td>Orthojet 치과 시멘트, 파우더</td><td>Lang Dental</td><td>1530BLK</td><td>컨템포러리 파우더, 블랙</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>패치 케이블</td><td>Thor Labs</td><td>FP200ERT</td><td>멀티모드, FT030 튜빙</td></tr><tr><td>픽크로톡신</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>AC131210010</td><td></td></tr><tr><td>연마 디스크</td><td>Thor Labs</td><td>D50FC</td><td></td></tr><tr><td>연마 패드</td><td>Thor Labs</td><td>NRS913</td><td>9" x 13"</td></tr> <tr><td>연마지</td><td>Thor Labs</td><td>LFG5P</td><td>5 &mu; m 그릿</td></tr><tr><td>연마지</td><td>Thor Labs</td><td>LFG3P</td><td>3 &mu; m 그릿</td></tr><tr><td>연마지</td><td>토르 연구소</td><td>LFG1P</td><td>1 &mu; m 그릿</td></tr><tr><td>연마지</td><td>토르 연구소</td><td>LFG03P</td><td>0.3 &mu; m grit</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼</td><td>륨 Fisher Scientific</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>메탄설포네이트 칼륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>83000</td><td></td></tr><tr><td>QX-314-Cl</td><td>Alomone Labs</td><td>Q-150</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (Carprofen)</td><td>Henry Schein</td><td>24751</td><td></td></tr><tr><td>Self-Administration 챔버 / 소프트웨어</td><td>Med Associates</td><td>MED-NP5L-D1</td><td></td></tr><tr><td>중탄산 나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>수산화 나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>1064980500</td><td></td></tr><tr><td>L- 아스코르브 산</td><td>나트륨 시그마 - 알드리치</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>펜토 바르비탈 나트륨</td><td>헨리 샤인</td><td>24352</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 인산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 포스포크레아틴</td><td>Fisher Scientific</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루베이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 기계 나사</td><td>WW Grainger</td><td>&nbsp; 6GB25</td><td>M2-0.40mm 기계 나사, 팬, 필립스, A2 스테인리스 스틸, 일반, 페룰용 3mm 길이</td></tr><tr><td>입체 어댑터</td><td>Thor Labs</td><td>XCL</td><td></td></tr><tr><td>입체 프레임</td><td>스톨팅</td><td>51603</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마-알드리치</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>봉합사</td><td>미세 과학 도구</td><td>18020-50</td><td>실크 실; 크기 : 5/0, 직경 : 0.12 mm</td></tr><tr><td>TEA-Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond 조직 접착제</td><td>Covetrus</td><td>001505</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Butler Schein</td><td>33198</td><td></td></tr></tbody></table>

광유전학을 사용하여 신경 가소성을 역전시키고 쥐에서 코카인 추구를 억제

Using Optogenetics to Reverse Neuroplasticity and Inhibit Cocaine Seeking in Rats

이 프로토콜은 광유전학적 도구를 사용하여 시상-편도체 회로에서 코카인 유발 가소성을 역전시켜 쥐의 후속 코카인 탐색 행동을 줄이는 데 필요한 단계를 보여줍니다. 우리의 연구에서, 우리는 쥐가 시청각 신호와 쌍을 이루는 정맥 내 코카인을자가 투여 할 때, 시상 (MGN)의 내측 생식기 핵에서 측면 편도체 (LA)의 주요 뉴런으로의 입력에서 형성된 시냅스가 큐 - 코카인 연관성이 학습됨에 따라 더 강해진다는 것을 발견했습니다. 우리는이 시냅스에서 코카인으로 유도 된 가소성의 역전이 단서 동기 부여 코카인 추구 행동을 감소시킬 것이라고 가정했다. 생체 내에서 이러한 유형의 신경 조절을 달성하기 위해 MGN-LA 시냅스의 강도를 감소시키는 시냅스 장기 우울증 (LTD)을 유도하고자했습니다. 이를 위해 우리는 빛을 사용하여 뇌 회로의 신경 조절을 허용하는 광유전학을 사용했습니다. 흥분성 옵신 oChiEF는 oChiEF를 포함하는 AAV를 MGN에 주입하여 LA의 시냅스 전 MGN 말단에서 발현되었습니다. 그런 다음 광섬유를 LA에 이식하고 473nm 레이저 광을 1Hz의 주파수에서 15분 동안 펄스하여 LTD 및 역 코카인 유도 가소성을 유도했습니다. 이 조작은 마약 추구 행동을 유도하는 코카인과 관련된 단서의 능력을 오래 지속적으로 감소시킵니다.

실험 순서를 요약한 타임라인이 그림 1에 나와 있습니다. 행동 실험 전반에 걸쳐 코카인 주입 횟수와 활성 레버에 대한 반응 수는 코카인 추구 행동의 강도를 측정하는 역할을합니다. 코카인자가 투여의 초기 일 동안, 활성 반응의 수는 두 번째 주 동안 안정화되기 전에 각 획득 일에 걸쳐 점차적으로 증가해야합니다. 반대로, 비활성 레버 반응은 실험 전체에서 낮게 유지되어야 합니다(그림 2A). 도구 멸종 첫날에는 예기치 않은 코카인 결핍으로 인해 코카인 추구 행동이 확대되기 때문에 일반적으로 적극적인 레버 반응의 수가 증가합니다. 그러나 이 반응은 쥐가 새로운 우발 상황을 알게 됨에 따라 후속 세션에서 점차 감소하여 6-10d 내에서 낮고 안정적인 수의 활성 레버 반응을 초래합니다(그림 2B). 실험의자가 투여 또는 도구 멸종 단계에서 지정된 획득 기준에 도달하지 못한 쥐는 ...

여기에 설명 된 방법은 쥐의 행동 관련 회로에서 코카인으로 유도 된 가소성을 광학 유전 학적으로 역전시키는 데 사용되는 절차를 설명합니다. 시상 편도체 시냅스의 지속적인 저주파 광 자극은 장기 우울증 (LTD)을 유도합니다. 코카인 경험이 있는 쥐에서 생체내 광유전학적으로 유도된 LTD는 단서-동기 약물 탐색의 후속 감쇠를 초래하였다.

This protocol demonstrates the steps needed to use optogenetic tools to reverse cocaine-induced plasticity at thalamo-amygdala circuits to reduce ...

이 프로토콜은 광유전학 기술의 새로운 발전과 약물 남용의 전임상 모델을 사용하여 재발을 촉진하는 신경 회로의 가소성을 역전시키기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 깨어있는 동물에서 시냅스 활동의 회로 특이 적 조작을 허용한다는 것인데, 이는 미래의 단서 동기 부여 코카인 추구 행동에 오래 지속되는 억제 효과가 있습니다. 이 방법은 행동적으로 관련된 신경 가소성을 구체적으로 조작하기 위해 다른 많은 시스템과 회로에서 활용 될 수 있습니다.26게이지 스테인리스 스틸 주입 캐뉼러를 1마이크로리터의 농축 AAV 용액으로 채워진 해밀턴 주사기에 연결하여 수술 준비를 시작합니다. 동물을 마취 한 후 수술 부위를 면도하고 텍스트 원고에 설명 된대로 건조를 방지하기 위해 눈을 윤활하십시오. 다음으로, 진통제 인 카프로 펜의 체중을 등 상부의 피부를 통해 피하 주사하고, 허리의 피부를 통해 5 밀리리터의 젖산 링거 용액을 피하 주사한다.그런 다음 정맥 카테터 이식을 수행하십시오. 카테터 이식 직후, 쥐를 입체 프레임에 고정시켜 아데노 관련 바이러스 주사를 수행한다. 국소 적으로 마취하기 위해 두개골 위의 피부를 통해 리도카인 덩어리를 피하 주사 한 다음 두개골의 앞쪽에서 뒤쪽으로 0.5mm 절개를합니다.두개골 표면을 노출시키기 위해 위에 놓인 조직을 제거하십시오. 쥐의 머리를 앞쪽 후축을 따라 수평을 맞추고 브레그마에 대한 입체 좌표를 0으로 만든 다음 작은 드릴 비트가 장착 된 dremel 도구를 사용하여 두개골을 통해 3 개의 작은 구멍을 뚫고 드라이버로 스테인레스 스틸 나사를 제자리에 장착하십시오. AAV 주입의 경우 내측 생식기 핵 또는 MGN의 경우 "쥐 뇌 아틀라스"의 좌표를 기반으로 양측 구멍을 뚫습니다.bregma에 대해 사용되는 좌표는 전방 후축에서 마이너스 5.4mm, 내측 측면 축에서 3mm, 등쪽 복부 축에서 마이너스 6.6mm입니다. 캐뉼러가 MGN에 적절하게 위치 할 때까지 분당 약 4 밀리미터로 주입 캐뉼러를 천천히 내리고 분당 0.1 마이크로 리터의 속도로 농축 된 AAV 용액을 주입합니다. 주입이 완료된 후 주사 캐뉼러를 5분 동안 그대로 두어 바이러스가 캐뉼라에서 멀리 퍼질 수 있도록 한 다음 뇌에서 캐뉼라를 천천히 빼냅니다.다음으로, 내측 생식기 핵 측면 편도체 말단을 표적으로 하는 시섬유의 이식을 진행한다. dremel 도구를 사용하여 원고에 설명 된대로 좌표에서 측면 편도체 위의 양측 구멍을 뚫습니다. 집게를 사용하여 광섬유 임플란트의 페룰을 잡고 페룰을 정위 어댑터에 고정합니다.섬유 끝이 LA의 등쪽 부분에 앉을 때까지 분당 2mm의 속도로 섬유를 천천히 내립니다. 페룰을 피부에 고정하고, 먼저 Loctite 순간 접착제의 얇은 층을 사용한 다음 치과 용 시멘트를 사용합니다. 치과 용 시멘트가 충분히 건조되면 페룰 슬리브와 먼지 커버로 페룰을 덮으십시오. 수술 절차 후, 쥐를 개별적으로 수용하고 겐타 마이신 밀리리터 당 5 밀리그램과 헤파린 밀리리터 당 30 USP 단위를 함유 한 식염수로 매일 카테터를 플러시합니다.행동 실험 시작 24 시간 전에 음식은 쥐를 자유 먹이 체중의 90 %로 제한합니다. 쥐를 조작 챔버에 넣고 코카인 밀리리터 당 2 밀리그램의자가 투여를위한 매일 1 시간의 훈련 세션을 고정 된 비율의 강화 일정에 따라 받는다. 챔버에서 쥐가 레버 프레스를 허용하십시오.지정된 활성 레버를 누르면 킬로그램 당 1 밀리그램의 코카인 주입과 복합 조명 및 톤 큐가 10 초 동안 표시됩니다. 지정된 비활성 레버를 눌러도 프로그래밍된 효과가 없습니다. 쥐가 연속 3 일 동안 하루에 적어도 8 회 주입을 성공적으로 얻을 때까지 적어도 10 일 동안자가 투여 실험을 계속하십시오.20일까지 획득 기준에 도달하지 못하면 연구에서 제외됩니다. 획득 기준이 성공적으로 충족되면 쥐가 조작 챔버에서 자유롭게 프레스를 사용할 수 있도록 하여 6일에서 10일 동안 쥐에게 1시간의 도구 멸종 세션을 실시합니다. 연속 이틀 동안 평균 최대 25 개의 레버 프레스가 발생할 때까지 매일 기기 소멸을 계속하십시오.장기 우울증 또는 LTD의 광유전학적 유도의 경우 깨끗한 표준 설치류 하우징 케이지 위에 매달린 회전 조인트를 통해 패치 케이블을 473나노미터 청색 레이저 다이오드에 연결합니다. 작동 지침에 따라 레이저를 켜고 레이저를 펄스 발생기에 연결하십시오. 쥐에게 1 헤르츠에서 2 마이크로 초의 900 펄스의 빛을 제공하도록 설정을 조정하십시오.광 센서를 사용하여 패치 코드를 통한 광 출력을 측정하고 패치 케이블을 통한 광 출력이 약 5-7밀리와트가 되도록 레이저 강도를 조정합니다. 쥐를 깨끗한 하우징 케이지에 넣고 페룰을 노출시키는 먼지 덮개와 페룰 슬리브를 제거합니다. 그런 다음 패치 코드를 각 페룰에 양측으로 연결합니다.제대로 설정되면 설치류는 광유전 자극 중에 케이지 주위를 자유롭게 움직일 수 있습니다. 쥐가 3 분 동안 환경을 탐험하도록 허용 한 후 펄스 발생기를 켜서 광유전 자극을 시작하십시오. 장기 우울증 유도 후, 쥐를 3 분 동안 새장에 머물게했다가 다시 케이지에 넣습니다.생체 내 광유전학적 자극 24시간 후, 쥐를 조작적 컨디셔닝 챔버에 다시 넣고 코카인 추구 행동을 평가하기 위해 1시간 표준 큐 유도 복원 세션을 거칩니다. 활성 레버를 누르면 빛과 톤 큐가 10초 동안 표시됩니다. 첫 번째 검사 후 최소 일주일 후에 두 번째 복원 검사를 실시하여 광유전학 LTD 유도가 코카인 탐색을 장기간 억제하는지 확인하십시오.대표적인 분석에서, 코카인자가 투여의 획득 및 멸종이 보여진다. 코카인 주입과 능동 레버 반응은 획득 전반에 걸쳐 증가했으며 비활성 레버 반응은 거의 없었습니다. 코카인자가 투여 기간 동안, 활성 반응의 수는 두 번째 주 동안 안정화되기 전에 각 획득 일에 걸쳐 점차적으로 증가했습니다.멸종 첫날, 레버 프레스의 초기 부스트가 관찰된 후 두 레버의 반응이 감소했습니다. 도구 적 멸종 이후, 단서의 재 도입은 적극적인 레버 반응의 수의 증가로 대표되는 코카인 탐색을 복원했습니다. Optical LTD는 컨트롤에 비해 액티브 레버 프레스를 크게 줄였습니다.7일 후, 랫트를 다시 시험하였다. 이전에 MGN-LA LTD를받은 동물은 대조군에 비해 능동적 레버 프레스가 현저히 감소하여 광학 LTD가 코카인 탐색을 장기간 감소 시켰음을 보여주었습니다. 생체 외 전기 생리 학적 기록은 광학 LTD에 이어 LA 뉴런에서 광학적으로 유발 된 흥분성 시냅스 후 전류의 진폭의 감소를 보였다.또한, 흥분성 시냅스 후 전위의 상승 기울기는 가짜 자극을 받은 동물에서 뉴런의 생체 외 광학 자극에 의해 감소되었지만 생체 내 광학 LTD를 가진 동물의 뉴런에서는 감소하지 않았습니다. 광섬유 임플란트의 배치 및 바이러스 발현은 측면 편도체 및 MGN에서 조직학적으로 확인되었다. 코카인 추구 행동을 성공적으로 줄이려면 광섬유 임플란트를 통해 적절한 광 출력을 얻고 지속적인 저주파 자극을 사용하여 장기적인 우울증을 촉진하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 신경 기록 기술을 사용하여 신경 활동의 변화를 결정할 수 있으며 코카인 추구 또는 기타 학습 된 행동에 대한 다른 행동 테스트를 수행 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Rich, MT, et al. 광유전학을 사용하여 신경가소성을 역전시키고 쥐의 코카인 탐색을 억제합니다. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 광유전학을 사용하여 내측 슬상 핵에서 외측 편도체(MGN-LA) 시냅스에 장기 우울증(LTD)을 유도하여 쥐 모델에서 단서 유발 마약 추구 행동을 약화시키는 방법을 보여줍니다. 외과적으로 광섬유를 이식하고 빛에 민감한 이온 채널을 발현하기 위해 바이러스 형질도입된 쥐는 저주파 광펄스로 광유전학적 자극을 받아 신경 전달 물질 방출과 시냅스 약화를 유발합니다. 이 과정은 신경 전달 물질 수용체 내재화를 통해 MGN-LA 시냅스 전달을 감소시켜 궁극적으로 단서와 약물 추구 행동 사이의 연관성을 방해합니다.

쥐의 마약 추구 행동 억제를 위한 장기 우울증의 광유전학적 유도

유전학과 광학을 결합 신경 과학 도구의 최근 개발, 공간 및 시간 해상도의 전례없는 수준의 신경 회로의 활동을 제어 할 수 있습니다, "optogenetics"라고. 여기에서 우리는 전두엽 피질과 subicular 피라미드 뉴런의 유전 정의 된 부분 집합의 optogenetic 조작과 생체 녹화에 통합하기위한 프로토콜을 제공합니다.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

이 문서에서는 마우스의 뇌에 바이러스 벡터를 microinject하고 수집, 멸종 위기 및 회복 단계를 포함하는 에어컨 장소 환경 패러다임에서 테스트하는 방법에 대해 설명합니다.

크레 재조합이 코카인 컨디셔닝 장소 환경에있는 표적 유전자의 역할을 연구하는 표현 바이러스 성 벡터의 정위 미세 주입

광유전학은 행동 신경과학 실험에 사용할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다. 이 프로토콜은 레이저 시스템의 설계 및 설정에 대한 단계별 가이드를 제공하며, 대부분의 설치류 행동 테스트 패러다임과 호환되는 다중 및 동시 생체 내 광유전학적 자극을 수행하기 위한 전체 프로토콜을 제공합니다.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

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여기에서 우리는 마우스에 있는 optogenetics를 사용하여 장소 환경 설정 패러다임에 대한 2개의 따르기 쉬운 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이러한 두 가지 설정을 사용하여, 선호도 및 회피 거동은 높은 공간 및 시간 선택성을 가진 동일한 장치 내에서, 그리고 간단한 방식으로 단단히 평가될 수 있다.

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특정 신경 인구 또는 뇌 영역의 광유전학 적 조작으로, 행동은 자유롭게 움직이는 동물에 있는 높은 시간 및 공간 해상도로 수정될 수 있습니다. 만성 이식 된 광섬유와 함께 다른 광유전학 도구를 사용하여 다양한 신경 변조 및 행동 테스트를 수행 할 수 있습니다.

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

본 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스에서 숙련 된 운동 거동의 성능에 관여하는 신경 회로를 특성화하기 위해 단일 펠릿 도달 - 투 - 파악 작업에서 고속 비디오 그래피와 결합 된 무선 광유전학을 사용하는 방법을 설명합니다.

생체 내 숙련 된 운동 행동의 무선 광유전학 제어

배우세요 광유전학을 사용하여 쥐의 코카인 추구 행동을 억제하는 방법을. 시상-편도체 회로에서 장기억제를 유도하여 약물 재발을 촉진하는 신경 가소성을 역전시키는 기술입니다.

광유전학을 사용하여 신경 가소성을 역전시키고 쥐에서 코카인 추구를 억제

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