Soaked-Bead Assay를 사용한 닭 배아 발생 동안의 세포 분화, Morphogenesis, 및 패터닝 분석

이 분석은 학생이 별개의 배아 영역에 비드를 이식하여 세포 분화 및 형태 형성과 같은 많은 발달 과정에서 특정 분자를 볼 수있게합니다. 이러한 프로토콜은 오가노이드를 포함한 임의의 실험 동물 모델, 세포 배양, 유기형 모델에 적용될 수 있다. 또한, 그것은 학생들에게 기본적인 발달 생물학을 가르치기위한 유용한 교육 도구입니다.

이 절차를 시연하는 것은 실험실의 학부생 인 Alexandra Gonzales-Gonzales입니다. 시작하려면 수정 된 흰색 Leghorn 닭 알을 섭씨 38도 및 상대 습도 70 %의 가습 인큐베이터에서 뾰족한면을 아래로 세로로 배양하십시오. 햄버거와 해밀턴에 따르면 28 단계에 도달하면 인큐베이터에서 계란을 제거하고 70 % 에탄올로 바꿔 공기 건조시킵니다.

그런 다음 작업 영역, 현미경 및 장비를 70 % 에탄올로 소독하십시오. 다음으로, 계란을 촛불로 만들어 혈관을 확인하고 배아를 찾습니다. 배아가없는 난자는 버리십시오.

치아가 없는 집게의 끝을 사용하여 계란의 무딘 끝을 탭하여 창을 열고 한 평방 센티미터 크기의 껍질 부분을 제거하십시오. 그런 다음 달걀을 판지 또는 플라스틱 홀더에 넣고 스테레오 현미경 아래에 놓습니다. 미세한 수술 포셉을 사용하여 배아에 닿을 수있는 작은 달걀 껍질 조각을 제거하고 구멍을 뚫고 당겨 공기 막을 제거하십시오.

다음으로, 미세한 수술 포셉을 사용하여 양수 자루를 약간 찢어서 Chorioallantoic 막의 혈관 구조를 손상시키지 않도록주의하십시오. 배아가 원하는 단계에 있는지 여부를 결정하기 위해 ovo 내에서 배아를 단계화하십시오. Affi-gel 헤파린 비드 제조를 위해 사각형 모양의 파라필름 섹션을 45mm 페트리 접시에 맞게 자릅니다.

페트리 접시의 바닥에 파라 필름을 놓은 후, 치아가 없는 포셉의 끝을 사용하여 각 꼭짓점을 밀어 접시 바닥에 고정시킵니다. 다음으로, 피펫 또는 주걱을 사용하여, 비드를 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 상층액을 침전시키고 피펫팅하도록 함으로써 PBS로 두 번 세척한다. 이어서, 마이크로 피펫을 사용하여, 40 내지 50개의 비드를 파라필름 덮인 페트리 디쉬의 중앙으로 옮긴다.

현미경으로 직경이 100 마이크로 미터 인 Affi-gel 또는 헤파린 비드 30 개를 선택하십시오. 참조로서 28 단계 배아의 세 번째 인터디지트를 사용하여 비드의 크기를 조정한다. 비드는 중간 자릿수보다 작아야 합니다.

선택된 비드를 둘러싸고 있는 과량의 PBS를 조심스럽게 제거한 후, 이를 처리 용액의 두 내지 다섯 마이크로리터에 담그십시오. 비드를 실온에서 30분 동안 용액 중에 인큐베이션한다. 인큐베이션 동안, 비드가 건조되는 것을 방지하기 위해, 비드 주위에 PBS 또는 물을 몇 방울 떨어뜨려 국소 대기를 가습하고 접시를 파라필름으로 덮어 증발을 늦춘다.

AG1X2 비드 준비를 붓는다. 주걱을 사용하여 비드를 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 원하는 최종 농도로 50 마이크로 리터의 처리 용액을 첨가하십시오. 튜브를 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 감싸고 난 후, 천천히 진탕 할 때 비드를 20 분 동안 인큐베이션하십시오.

인큐베이션 후, 피펫을 사용하여, 와류에서 온화한 교반으로 2분 동안 물에 용해된 0.2%페놀 레드로 염색된 처리 용액을 가능한 한 많이 제거하였다. 염색 후, 염료를 제거하고, PBS에서 비드를 두 번 세척한 후 임의의 잔류 염료를 제거하였다. 다음으로, 마이크로 피펫 팁을 사용하여, 40 내지 50개의 AG1X2 비드를 파라폼 덮인 페트리 디쉬의 중앙으로 옮기고 비드를 5마이크로리터의 PBS에 담그었다.

그런 다음 현미경으로 직경 100 마이크로 미터 크기의 약 30 개의 비드를 선택하십시오. 선택된 비드를 실험 용액에 PBS 또는 물 몇 방울을 비드 주위에 담그고 국소 대기를 가습시킨다. 증발을 늦추기 위해 파라 필름으로 접시를 덮으십시오.

배아를 조작하기 전에 벤치 탑에서 서로 옆에 두 개의 스테레오 현미경을 배치하십시오. 그런 다음 치아가 아닌 포셉을 사용하여 나머지 알에 창을 만듭니다. 다음으로, 현미경으로 오른쪽 뒷다리 근처의 양막을 미세한 수술 포셉으로 찢어 버립니다.

미세한 집게를 사용하여 양막으로 배아를 잡고 오른쪽 뒷다리를 노출시킵니다. 그런 다음 미세한 텅스텐 바늘을 사용하여 뒷다리의 세 번째 중간 자릿수의 말단에 구멍을 뚫습니다. 배아와 노출 된 뒷다리를 방출하지 않고 포셉의 팁 중 하나를 사용하여 다른 현미경에서 하나의 처리 된 비드를 가져 가십시오.

하나의 구슬이 그 끝에 달라 붙을 수 있도록 포셉을 열어야합니다. 구슬을 뒷다리 근처의 병아리 배아로 옮겨 중간 구멍 위에 놓습니다. 구멍에 들어갈 때까지 포셉을 닫아 비드에 압력을 가하십시오.

그런 다음 배아를 풀고 달걀 껍질 창을 테이프로 봉인하고 필요한 단계에 도달 할 때까지 알을 인큐베이터로 되돌립니다. 분석 효능을 보장하기 위해, 비드는 일관되고 정확하게 정확한 위치에 배치되어야 합니다. 이 연구에서, 흠뻑 젖은 구슬은 정점 외배엽 능선 아래의 세 번째 중간 숫자의 원거리에 배치되었다.

배아는 해양청색과 알리자린 적색으로 염색하여 골격 요소의 형성을 입증하고 세포 분화에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. 이 분석은 또한 중성 적색 및 유전자 조절을 통한 세포 사멸을 평가하여 C2 혼성화를 구매하는 데 매우 적합합니다. 이 실험 도구의 가장 큰 장점은 젖은 구슬의 시간과 위치를 제어하는 것입니다.

코어 포지셔닝을 정확한 발달 타이밍에 결합하면 세포 분화 과정을 연구 할 수있는 엄청난 가능성을 제공합니다.