Name: 과분극 1-13C 피루브산 및 13C / 31P NMR 분광법을 사용하여 분리 된 관류 마우스 심장에서 심장 대사 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: 배우세요 과분극 [1-13C]피루브산과 31P NMR 분광법을 활용하여 분리된 관류 마우스 심장에서 실시간 심장 대사를 조사하는 방법을. 이 기법은 심장 에너지학과 대사 흐름을 정량화하여 건강한 상태와 질병 상태의 심장 생리를 연구하는 데 활용됩니다.

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이 프로젝트는 보조금 계약 번호 1379/18에 따라 이스라엘 과학 재단으로부터 자금을 받았습니다. 직접 박사 과정 학생을위한 응용 및 공학 과학을위한 이스라엘 과학 기술부의 Jabotinsky 장학금 번호 3-15892 DS; 보조금 계약 No. 858149(AlternativesToGd)에 따른 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램.

히브리 대학교와 하다사 메디컬 센터의 공동 윤리 위원회(IACUC)는 동물 복지를 위한 연구 프로토콜(MD-19-15827-1)을 승인했습니다.
1. Krebs-Henseleit 완충액 준비
<ol><li>실험 하루 전에 Krebs-Henseleit 완충액(KHB)26의 수정된 버전을 준비합니다. 처음에, 118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 0.5 mM 피루브산, 1.2 mMMgSO4, 25 mM NaHCO3, 및 1.2 mM KH2PO4를 이중-증류된 H2O에 용해시킨다.</li>
	<li>이 혼합물을 95%/5% O 2/CO2로 20분 동안 버블링한 다음 1.2mM CaCl2를 추가합니다.</li>
	<li>HCl 또는 NaOH로 완충액의 pH를 7.4로 조정합니다.</li>
	<li>실험 당일 1.2단계에서 제조한 KHB에 10mM 포도당과 72U/L 인슐린을 첨가한다. 참고: 인슐린은 Kolwicz et al.26의 연구에 설명된 대로 관류 완충액에 첨가되며 인슐린이 수축 기능(27)과 과분극된 [13C]중탄산염 신호(28)의 강도를 증가시킨다고 보고한 이전 연구와 일치합니다.</li>
</ol>2. 관류 시스템 준비
<ol><li>200°C의 수조에 40mL의 KHB 저장소를 보관하고 심장 관류 전에 95시간 동안 5L/min의 유속으로 2%/4% O2/CO1로 버블링합니다. 실험 내내 이 가스 혼합물로 버퍼가 지속적으로 버블링되도록 합니다.<ol><li>먼저 수조를 40°C로 설정합니다. KHB 저장소를 삽입합니다. 연동 펌프( 재료 표 참조)와 의료용 확장 튜브를 사용하여 7.5mL/min의 일정한 유속으로 버퍼 저장소와 10mm NMR 튜브 사이의 KHB를 재순환시킵니다.</li>
		<li>3개의 백금 경화 실리콘 튜브(내경 3mm)를 펌프에 연결합니다(KH 버퍼용 유입 튜브 1개와 유출 튜브 2개). 유출 및 유입 라인을 가열된 KH 버퍼에 삽입합니다. 그런 다음 가열된 KH 버퍼에 산소 라인을 삽입합니다.</li>
		<li>얇은 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK, 재료 표 참조) 라인을 사용하여 완충액과 과분극제가 분광계의 구멍 내에서 NMR 튜브로 흐르도록 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>온도가 37-37.5 °C로 유지되는지 확인하십시오. 아래 단계를 따르십시오.</li>
	<li>42°C로 설정된 가열 테이프로 유입 라인(버퍼 저장소에서 NMR 튜브까지)을 감쌉니다.</li>
	<li>분광계에 의해 조절되는 따뜻한 공기 흐름으로 분광계 내부의 NMR 튜브를 가열합니다.</li>
	<li>NMR 호환 온도 센서( 재료 표 참조)를 사용하여 NMR 튜브 내부의 온도를 측정합니다. 온도는 37-37.5 °C로 조정됩니다.</li>
</ol>3. 획득을 위한 NMR 분광계의 교정 및 준비
<ol><li>실험 당일, 1,4-디옥산(재료 표)을 함유한 13C 표준 샘플을 분광계에 삽입하고, 13C에 대한 NMR 프로브를 조정하고 일치시킨다. 그런 다음 너트화 각도가 90°인 1,4-디옥산의 열 평형 신호를 나타내는 스펙트럼을 얻습니다.</li>
	<li>이제 13C표준 샘플을D2O에 105mM의 ATP를 함유하는 31P표준 샘플(재료 표)로 교환한다. 참고: 열 평형 인산염 신호를 보여주는 스펙트럼은 50°의 너트화 각도로 얻어집니다.</li>
	<li>유입선, 유출선, 온도 프로브를 10mm NMR 튜브에 삽입한 다음 튜브를 마그네틱 보어에 삽입합니다. 가열 테이프를 42 °C로 조정합니다.</li>
	<li>50°의 너트화 각도와 1.1초(1,640 수집)의 TR로 30분 동안 해당 실험에 사용할 순환 KH 버퍼의 31PNMR 스펙트럼을 획득합니다.</li>
</ol>4. NMR 튜브에서 동물의 준비, 수술 절차 및 심장 관류
<ol><li>유도 챔버에서 가스 마취 시스템(재료 표)을 사용하여 실내 공기(재료 표)에 3.3% 이소플루란이 있는 수컷 HSD:ICR(CD-1) 마우스를 340mL/min으로 5분 동안 마취합니다.</li>
	<li>전신 마취 유지를 위해 2.9% 이소플루란으로 비강 마취를 사용하십시오. 알림: 동물의 통증과 불편함을 최소화하기 위해 주의를 기울입니다.</li>
	<li>테이프로 동물의 팔다리를 고정하고 부정적인 페달 통증 반사를 확인한 다음 300IU의 헤파린 나트륨을 복강 내 주사하십시오.</li>
	<li>마우스의 흉벽과 복부를 70% 알코올로 완전히 적셔 청결을 유지하고 수술 중 모발 오염이나 방해를 방지합니다.</li>
	<li>헤파린 주사 후 1 분에 작은 가위로 복강의 피부와 근육을 자릅니다.</li>
	<li>작은 구부러진 턱 지혈제 잠금 모기 클램프를 xiphoid process와 흉부 피부 사이에 놓아 가슴을 들어 올리고 횡격막을 노출시킵니다. 다이어프램의 오른쪽 엽에 구멍을 뚫고 자릅니다.</li>
	<li>정중선을 가로 질러 가슴을 자르고 측면으로 후퇴 한 다음 제거하십시오.</li>
	<li>혈액 응고를 방지하기 위해 200IU의 헤파린 나트륨으로 심장의 좌심실을 주사하십시오. 그런 다음 앞서 설명한 대로 0.1mL의 얼음처럼 차가운 0.5mol/L KCl을 주입하여 심정지를 일으킵니다(25). 심장 마비는 심장을 캐뉼러 할 수 있어야합니다.</li>
	<li>흉선을 확인하고 가위로 제거하여 대동맥을 노출시킵니다. 잔여 흉곽 조직을 제거합니다.</li>
	<li>대동맥궁을 확인하고 구부러진 집게를 사용하여 상행 대동맥 주위에 3-0 실크 봉합사(재료 표)로 느슨한 매듭을 놓습니다. 3mL의 KHB를 좌심실에 주입하여 대동맥에서 혈전을 제거합니다.</li>
	<li>상행 대동맥을 더 잘 시각화하기 위해 구부러진 집게를 사용하여 심장을 아래쪽으로 수축시킵니다.</li>
	<li>22G 정맥 카테터(재료 표)로 현장 캐뉼라 삽입을 수행합니다. 캐뉼러드 영역에 시아노아크릴레이트 접착제를 도포한 다음 이중 봉합사 묶기를 수행합니다. 추가 KH 버퍼를 심장에 주입하고 캐뉼레이션 튜브를 통해 흐르는지 확인합니다.</li>
	<li>구부러진 집게를 제거합니다. 심장을 주변 내장에서 분리하고 정맥 카테터를 통해 얼음처럼 차가운 KHB(4°C)로 역행합니다.</li>
	<li>정맥 카테터를 통해 관류 시스템의 유입 라인에 심장을 연결합니다. 7.5mL/min의 따뜻한 완충액(37-37.5°C)으로 관류를 시작하면 심장이 자발적으로 뛰기 시작합니다.</li>
	<li>박동 심장, 유출선 및 온도 프로브로 NMR 튜브를 고정하고 분광계의 구멍에 삽입하여 심장이 NMR 프로브의 중심에 있는지 확인합니다.</li>
</ol>5. 심장 에너지 및 pH에 대한 데이터 수집
<ol><li>50°의 플립 각도와 1.1초의 TR로 약 1시간 동안 31P스펙트럼을 획득합니다.</li>
</ol>6. DNP 스핀 분극 및 용해
<ol><li>[1-13C] 피루브산의 28.5 mg 제형을 준비한다. 이러한 제제는 11.1 mM 내지 14.0 mM 산의 OX063 라디칼로 이루어진다.</li>
	<li>4mL의 용해 배지를 준비합니다. 용해 매질은 11.2 mM NaH2PO4, 38.8 mMNa2HPO4, 33 mM TRIS 및 2 mM HCl을 함유하는 TRIS-포스페이트 완충액으로 구성된다. 이 배지 조성은 이 완충액 4mL에 [1-13C]피루브산 제제 28.5mg을 첨가할 때(용해 단계에서) 결과 용액의 pH가 7.4가 되도록 조정됩니다.</li>
	<li>제조자의 지시에 따라 dissolution-DNP(dDNP) 스핀 편광 장치에서 스핀 분극 및 빠른 용해를 수행한다(표 of Materials). 약 1.5시간 동안 1.45K에서 1.55K의 [1-13C]피루브산 제형의 편광을 위해 94.110GHz의 주파수에서 마이크로파 조사를 적용합니다.</li>
	<li>dDNP 장치에서 얻은 4mL의 과분극 배지를 과분극 용해 배지를 보완하는 잘 산소화된 용액과 빠르게 혼합하여 관류 배지와 거의 일치하는 조성을 얻습니다. 참고: 14mM 과분극[1-13C]피루브산으로 과분극 주사하는 동안 심장을 관류하는 배지의 최종 부피는 26mL입니다. 주입된 배지의 최종 조성(혼합 후)은 4.7mM KCl, 1.2mM MgSO4, 70mM NaCl, 25mMNaHCO3, 1.2mM KH2PO4, 10mM 포도당, 1.2mM CaCl2 및72U/L 인슐린을 포함합니다.</li>
	<li>연속 흐름 설정29를 사용하여 분리된 심장에 과분극된 [1-13C]피루브산 함유 배지를 투여합니다. 참고: 이것은 실험 중 어느 시점에서든 심장 관류가 방해받지 않고 과분극 배지가 알려진 속도로 알려진 기간 동안 투여되도록 하기 위해 수행됩니다.</li>
</ol>7. 과분극 13C분광법
<ol><li>이전에 설명된 바와 같이, 2.5 ms 카디널 사인(Sinc) 펄스를 적용하여 생성물-선택성 포화-여기 펄스(15)를 사용하여 과분극된 13C데이터를 획득한다(15,16). [1-13C]젖산물과 [13 C]중탄산염을 6초 간격으로 연속적으로 선택적으로 여기시켜 각 대사 산물에 대해 12초 간격을 얻습니다.</li>
	<li>[1-13C]젖산 검출의 경우, 선택적 Sinc 펄스를 [1-13 C]피루브산 수화물 주파수(179.4ppm)로 중앙에 배치하여 [1-13 C]피루브산의C1 신호에 대한 신호 강도 비율(lac)이 0.113이 됩니다.</li>
	<li>[13C] 중탄산염 검출의 경우 선택적 Sinc 펄스를 157.7ppm으로 중앙에 배치하며, 이는 [13C] 중탄산염 신호(161.1ppm)의 214Hz 다운필드입니다. 그 결과 [1-13C]피루브산과 [13C]중탄산염의C1신호에 대해 신호 강도비(bic)가 0.139가 됩니다.</li>
</ol>8. 조직 습윤 중량 및 부피 측정
<ol><li>실험이 끝나면 관류 시스템에서 심장을 분리하고 티슈 페이퍼로 부드럽게 건조시킵니다. 이어서, 심장의 무게를 측정하여 조직 습윤 중량을 구한다.</li>
	<li>마우스 심장(30)에 대해 이전에 결정된 바와 같이, 1.05 g/cm3의 밀도 계수를 사용하여 심장의 부피를 결정한다.</li>
</ol>9. ATP 함량 정량화
<ol><li>ATP 표준 샘플의 단일 획득과 분리된 심장의 30분 획득(TR 1.1초 및 1,640 획득)의 γ-ATP 신호를 통합합니다.</li>
	<li>심장의 γ-ATP 신호의 적분을 표준(재료 표)의 적분과 비교하여 심장의 ATP 함량을 정량화하고, 후자는 알려진 농도(105mM)를 가지며, 획득 및 이완 효과의 수를 수정합니다.</li>
</ol>10. 심장의 Pi 신호 해결
참고: 조직 pH를 평가하려면 먼저 총 Pi 신호(Pit)의 신호에서 심장의 Pi 신호를 디컨볼루션해야 합니다. 이것은 Pit의 신호에서 KHB Pi(PiKH)의 신호를 생략하여 수행됩니다.
<ol><li>단일 Pi 신호(PiKH를 보여주는 KHB의 31P스펙트럼, 그림 1A)에서 Excel(재료 표)을 사용하여 PiKH 신호를 로렌치안 함수에 맞춥니다.</li>
	<li>NMR 프로브에 보이는 부피(Vp, 1.375 mL)는 샘플 튜브가 심장을 포함하지 않을 때 더 많은 KHB를 함유한다. 이 충전 효과를 보정하려면 식 1A를 사용하여 감쇠 버퍼 신호(Pib)를 계산하십시오. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq01.jpg" style="margin: auto;">식 1A 여기서VH 는 8단계에서 결정된 심장의 부피입니다.</li>
	<li>식 1B에 따라 Pit 에서 이 신호를 빼서 관류된 심장에서만 발생하는 Pi 신호를 얻습니다(Pih, 그림 1B). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq02.jpg" style="margin: auto;">식 1B</li>
</ol>11. 다중 파라미터 pH 분석
<ol><li>식 231을 사용하여 PCr의 화학적 이동을 참조하여 pH로의Pih 신호 화학적 이동 분포의 변환을 수행한다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq03.jpg" style="margin: auto;">식 2 여기서 Δδ는 화학적 이동 차이이고, pKa는 6.72이고, 유리 염기는 5.69 δ, δ유리 산은 3.27이며, 앞서 설명한 바와 같이(31).</li>
	<li>Lutz et al.32에 따라 Pih 화학적 이동 척도와 pH 척도 사이의 비선형성에 대한 결과 pH 분포 곡선을 수정합니다. 이 계산으로 인한 일반적인 pH 분포는 그림 1C에 나와 있습니다.</li>
	<li>Lutz et al.의 연구에 따라 7가지 통계 매개변수를 사용하여 다중 매개변수 접근 방식으로 조직 pH 분포를 분석합니다. 32. 이들 파라미터 중 4개는 조직 pH를 가장 잘 설명하는 것으로 보이기 때문에 여기에 제시되어 있다: 1) 전체 최대 pH; 2) 가중 평균 pH; 3) 가중 중간 pH; 및 4) pH 플롯의 왜도(도 1C).</li>
</ol>12. LDH 및 PDH 활동 계산
참고: 과분극 대사 산물 [1-13C]젖산염 및 [13C]중탄산염의 생성 속도는 각각 LDH 및 PDH 활성을 계산하는 데 사용됩니다. 생성물 선택적 포화-여기 접근법(15)에서, 새로 합성된 과분극 대사산물만이 각각의 선택적 여기에 의해 검출된다.
<ol><li>과분극 [1-13C] 피루브산 신호를 참조로 사용하여 해당 대사 산물 생산 수준을 결정합니다.<ol><li>과분극 매질로 관류하는 동안 NMR 튜브의 [1-13C]피루브산 농도가 증가하고(세척), 고원(최대 농도 14mM에서), 감소(세척)됩니다.</li>
		<li>피루브산 농도가 일정한 수준(고원)에 도달한 시점을 식별하기 위해, 유효 이완 상수Teff를 사용하여T1 이완 및 RF 맥동으로 인한 신호 감쇠에 대한 [1-13C]피루브산 신호를 수정합니다.</li>
		<li>각 주입에 대해 이 유동 역학을 보여주기 위해 [1-13C]피루브산 붕괴 곡선을 수정하는 능력에 기초하여 Teff를 정의합니다(Eq.3). <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq04.jpg" style="margin: auto;">식 3 여기서 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq05.jpg" style="margin: auto;"> 는 [1-13C]중탄산염 획득 동안 획득된 [1-13C]피루브산 신호입니다. 본원에 기재된 실험에서 평균Teff 는 35.8 s ± 2.3 s (n=5 hearts)인 것으로 밝혀졌다.</li>
		<li>추가 분석을 위해 농도가 최대 보정된 [1-13C]피루브산 신호의 10% 이내인 데이터 포인트를 선택합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>대사산물 신호의 SNR이 2(분석 임계값)보다 큰 경우 대사산물 생성 속도를 계산하기 위해 12.1단계에서 선택한 시점에 대한 [1-13C]젖산염 및 [13C]중탄산염 생산의 해당 데이터를 사용하십시오. 이러한 시점 선택의 전형적인 예가 도 2B (강조된 시간 윈도우)에 도시되어 있다.</li>
	<li>식 4A 및 식 4B를 사용하여 선택된 각 데이터 포인트의 생산 속도를 계산합니다. <img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq17.jpg" style="margin: auto;">식 4A <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq06.jpg" style="margin: auto;">식 4B 여기서 <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq07.jpg" style="margin: auto;"> 와 는 각각 각 시점에서 [1-13 C] 젖산 또는 [13 C] 중탄산염의 생산 속도입니다. [1-13 C] 피루 베이트와 <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq08.jpg" style="margin: auto;"> 생성물 [1-13 C] 젖산 또는 [13C] 중탄산염의 상대적 여기를 나타내는 인자입니다.<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq09.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq10.jpg" style="margin: auto;"> 이들 인자는 이전에 각각 0.113 및 0.139로 결정되었다29. Vp는 NMR 프로브(1.375mL)에 의해 검출되는 부피이고, TR은 2개의 연속적인 생성물 선택적 포화 여기(각 생성물에 대해 12초) 사이의 시간 간격을 나타내며, 는 각각 [1-13C]젖산염 및 [13C]중탄산염의 신호이고 <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq14.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq13.jpg" style="margin: auto;">, <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq11.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq12.jpg" style="margin: auto;"> 는 [1-13C]젖산염 및 [13C]젖산염 및 [13C]피루브산의 신호이다 C] 중탄산염 여기, 각각. [Pyr]은 [1-13C]피루브산 농도로, 고원기 동안 14mM이었습니다.<ol><li>각 지점에 대한 속도를 결정한 다음 과분극 주입당 평균을 결정합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

공개가 없습니다.

우리는 분리된 마우스 심장 모델에서 과분극된 [1-13C]피루브산 대사, 조직 에너지 및 pH를 조사하도록 설계된 실험 설정을 보여줍니다.
프로토콜 내의 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 완충액의 pH가 7.4인지 확인하고; 2) 버퍼의 모든 성분이 포함되도록 하는 것; 3) 헤파린 주사에 의한 심장 혈관의 혈액 응고를 피하십시오. 4) 대사 활성을 감소시킴으로써 심장에 대한 허혈성 손상을 피하는 것(KCl 주사 및 얼음-냉 완충액); 5) 절차의 어느 시점에서든 심장에 기포가 유입되는 것을 피하십시오. 6) 짙은 빨간색에서 밝은 분홍색으로 변하는 조직의 색에 의한 대동맥의 성공적인 캐뉼라 삽입을 검증합니다. 7) 심장이 따뜻한 완충액으로 이동하면 관류가 연속적인지 확인합니다. 8) 심장 옆 분광계에서 NMR 튜브 내부의 온도를 면밀히 모니터링하고 37°C로 유지합니다. 9) 측정을 통해 자기장 균질성을 확인하는 단계; 10) RF 펄스에 대해 정확하고 업...

심장 대사의 변화는 다양한 심근병증과 관련이 있으며 종종 근본적인 병태생리학적 메커니즘의 기초를 형성합니다1. 그러나 대부분의 생화학적 분석에는 조직의 균질화와 세포 용해 및/또는 방사능 추적이 필요하기 때문에 살아있는 조직의 대사를 연구하는 데는 많은 장애물이 있습니다. 따라서 생체 조직에서 심근 대사를 조사하기 위한 새로운 도구가 절실히 필요합니다. 과분극된 13C-표지 기질의 자기 공명(MR)은 표지된 부위의 MR 신호 대 잡음비(SNR) 비율을 몇 배나 증가시킴으로써 이온화 방사선을 사용하지 않고 생체 조직2의 대사를 실시간으로 측정할 수있습니다. 여기에서 우리는 분리된 마우스 심장의 빠른 대사를 연구하기 위한 실험 설정, 획득 접근 방식 및 분석적 접근 방식을 설명하고 동시에 일반적인 조직 에너지 및 산도의 지표를 제시합니다. 심장 pH는 심근 허혈, 부적응 비대, 심부전과 같은 심장 질환 및 상태의 초기 단계에서 산-염기 균형이 깨지기 때문에 중요한 지표이다6.
과분극 [1-13C]젖산염 및 [13C]과분극 [1-13C]피루브산으로부터의 중탄산염 생산은 젖산 탈수소효소(LDH) 및 피루브산 탈수소효소(PDH)의 생성 속도를 결정하는 데 도움이 됩니다. 분리된 설치류 심장에서 과분극된 기질을 사용하여 수행된 대부분의 이전 연구는 LDH 및 PDH의 효소 활성을 도출하기 위해 복잡한 동역학 모델을 사용하거나, 실제 효소 활성률을 계산하지 않고 기질에 대한 과분극 생성물의 신호 강도 비율을 보고했습니다 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. 여기서, 본 발명자들은 생성물 선택적 포화-여기 접근법(15)을 사용하였으며, 이는 모델-없는 방식으로 효소 활성의 모니터링을 가능하게 한다15,16. 이러한 방식으로, 절대 효소 비율 (즉, 단위 시간당 생산 된 생성물의 몰 수)이 결정되었다. 31 P 분광법은 무기 인산염(Pi), 인산(PCr) 및 아데노신 삼인산(ATP)의 신호를 관찰하는 데 사용되었습니다. 조직의 Pi 신호에서 이질적인 화학적 이동에 의해 입증된 바와 같이 심장의 pH 분포를 특성화하기 위해 다중 매개변수 분석이 사용되었습니다.
역행성 관류된 마우스 심장(Langendorff heart)17,18,19은 온전한 박동 심장에 대한 생체 외 모델입니다. 이 모델에서, 심장 생존율 및 pH는 적어도 80분 동안 보존된다20, 그리고 장기간 허혈성 손상 후 회복 가능성을 보여주었다21,22. 그럼에도 불구하고 미세 수술 중 부주의한 가변성은 심장 전체의 조직 생존력에 가변성을 초래할 수 있습니다. 이전 연구에서는 시간이 지남에 따라 이 심장의 악화에 대해 보고했습니다19; 예를 들어, 시간당 5%-10%의 수축 기능 감소가 관찰되었다18. 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP) 신호는 이전에 심근의 에너지 상태와 생존력에 대해 보고하는 것으로 나타났다23. 여기에서 우리는 관류된 심장이 중단 없는 관류 및 산소 공급이 있었음에도 불구하고 ATP 함량에 의해 입증된 바와 같이 때때로 생존 수준에서 의도하지 않은 변동성을 보일 수 있음을 언급했습니다. 우리는 여기에서 LDH 및 PDH 비율을 심장의 ATP 함량으로 정규화하면 이러한 비율의 심장 간 변동성이 감소한다는 것을 보여줍니다.
다음 프로토콜에서는 NMR 분광계에서 심장 캐뉼라 삽입, 분리 및 그에 따른 관류에 사용되는 수술 절차를 설명합니다. 주목할 점은, 마우스 심장을 분리하고 관류하는 것을 목표로 하는 다른 외과적 접근법이 이전에 기술되었다는것이다 24,25.
박동 심장의 효소 속도(13C 분광법 및 과분극[1-13C]피루브산 사용) 및 심장의 생존력 및 산도(31PNMR 분광법 사용)와 관련된 데이터를 수집하는 데 사용되는 방법론도 설명되어 있습니다. 마지막으로, 대사 효소 활성과 조직 생존력 및 산도를 결정하기 위한 분석 방법론을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyperSense DNP 편광</td><td>옥스포드 기기</td><td>52-ZNP91000</td><td>HyperSense, 3.35 T, 전임상 용해-DNP 극분광</td></tr><tr><td>NMR 분광계&nbsp;</td><td>RS2D</td><td></td><td>NMR 큐브, 5.8 T, 10 mm 광대역 프로브</td></tr><tr><td>연동 펌프가</td> 장착되어 있습니다.<td>Cole-Parmer</td><td>07554-95</td><td></td></tr><tr><td>온도 프로브</td><td>Osensa</td><td>FTX-100-LUX+</td><td>NMR 호환 온도 프로브</td></tr><tr><td>Somnosuite 저유량 마취 시스템</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lines, 튜빙, 봉합사</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platinum 경화 실리콘 튜브</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-96119-16</td><td>L/S 16 I.D. 3.1 mm& 주의;</td></tr><tr><td>얇은 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK) 라인</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>id. 0.040"</td></tr><tr><td>정맥 카테터&nbsp;</td><td>BD 의료</td><td>381323</td><td>22 G</td></tr><tr><td>실크 봉합사</td><td>Ethicon</td><td>W577H</td><td>와이어 직경 3-0</td></tr> <tr><td>< > 화학 물질 및 제약 < / 강력 ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>[1-13 C] 피루브 산</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-8077-1</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>21074</td><td>CAS : 10043-52-4</td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td>당 <td>시그마-알드리치</td><td>G7528</td><td>CAS: 50-99-77</td></tr><tr><td>헤파린 나트륨</td><td>로텍스메디카</td><td>HEP5A0130C0160</td><td></td></tr><tr><td>염산 37%</td><td>시그마-알드리치</td><td>258148</td><td>CAS: 7647-01-0</td></tr><tr><td>인슐린 아스파르트(NovoLog)</td><td>Novo Nordisk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>테렐</td><td></td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘</td><td>시그마-알드리치</td><td>793612</td><td>CAS : 7487-88-9</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마-알드리치</td><td>P4504</td><td>CAS : 7447-40-7</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td><td>성 시그마-알드리치</td><td>P9791</td><td>CAS : 7778-77-0</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Gadot 그룹</td><td></td><td>CAS : 144-55-8</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9625</td><td>CAS : 7647-14-5</td></tr><tr><td>나트륨 수산화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>655104</td><td>CAS : 1310-73-2</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기</td><td>성 시그마-알드리치</td><td>S7907</td><td>CAS : 7558-79-4</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 이수화물</td><td>Merck</td><td>6345</td><td>CAS : 13472-35-0</td></tr><tr><td>TRIS (생명 공학 등급)</td> <td>Amresco</td><td>0826</td><td>CAS : 77-86-1</td></tr><tr><td>트리틸 라디칼 OX063</td><td>GE 헬스케어 AS</td><td>NC100136</td><td>OX063</td></tr><tr><td>NMR 표준</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13C 표준 샘플</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-72A</td> 벤젠-D631P 표준 샘플<td>의 40% p-dioxane</td></tr> D<tr><td></td><td>2<Ostrong>Software</strong에서 120mM</td><td></td> 페닐포스폰산으로 <td>제작되었습니다</td></tr><tr><td>></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNova</td><td>Mestrelab Research</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

과분극 [1-13c] 피루브산 및 13c / 31p nmr 분광법을 사용하여 분리 된 관류 마우스 심장에서 심장 대사 조사

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

신진 대사는 세포 생활에서 중요한 과정의 기초입니다. 생체 조직에서 대사 네트워크가 어떻게 기능하는지 특성화하면 질병의 메커니즘을 이해하고 치료법을 설계하는 데 중요한 정보를 얻을 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 역행성 관류된 마우스 심장에서 세포 내 대사 활동을 실시간으로 연구하기 위한 절차와 방법론을 설명합니다. 심장은 심근 허혈을 최소화하기 위해 심정지와 함께 현장에서 분리되었고 핵자기 공명(NMR) 분광계 내부에서 관류되었습니다. 분광계에서 그리고 연속 관류 하에서, 과분극 [1-13 C] 피루브산이 심장에 투여되었고, 후속 과분극 [1-13 C] 젖산 및 [13C] 중탄산염 생성 속도는 실시간으로 젖산 탈수소 효소 및 피루 베이트 탈수소 효소 생산 속도를 결정하는 역할을했습니다. 과분극된 [1-13C]피루브산의 이러한 대사 활성은 생성물 선택적 포화-여기 획득 접근법을 사용하여 모델 자유 방식으로 NMR 분광법으로 정량화되었습니다. 31 P 분광법은 심장 에너지 및 pH를 모니터링하기 위해 과분극 획득 사이에 적용되었습니다. 이 시스템은 건강하고 병든 쥐의 심장에서 대사 활동을 연구하는 데 매우 유용합니다.

KHB로 관류된 마우스 심장으로부터 그리고 완충액 단독으로부터 기록된 31P스펙트럼이 도 1A에 제시되어 있다. α-, β-, γ-ATP, PCr 및 Pi의 신호가 심장에서 관찰되었습니다. Pi 신호는 두 가지 주요 구성 요소로 구성되었습니다 : 더 높은 필드 (신호의 왼쪽)에서 Pi 신호는 대부분 pH 7.4의 KHB로 인한 것입니다. 하단 필드(신호의 오른쪽)에서 Pi 신호는 더 산성 환경으로 인해 더 넓고 덜 균질했습니다. 후자의 패턴은 심장 조직에서 발생합니다. 심장 조직 Pi 신호는 KHB의 Pi 신호를 빼서 추출한 다음(그림 1B) ppm 척도에서 pH 척도로 변환합니다(그림 1C). pH는 가중 평균, 가중 중앙값, 전체 최대값 및 왜도를 계산하여 조직 Pi 신호의 다중 모수 분석을 사용하여 조사됩니다(<strong class="xfig"...

우리는 연속 관류 모드에서 과분극된 13C표지 대사산물을 분리된 관류된 마우스 심장에 투여하기 위한 실험 설정을 설명합니다. 전용 13C-NMR 획득 접근법을 통해 대사 효소 활성을 실시간으로 정량화할 수 있었고, 다중모수 31P-NMR 분석을 통해 조직 ATP 함량 및 pH를 측정할 수 있었습니다.

과분극 [1-13C] 피루브산 및 13C / 31P NMR 분광법을 사용하여 분리 된 관류 마우스 심장에서 심장 대사 조사

Metabolism is the basis of important processes in cellular life. Characterizing how metabolic networks function in living tissues provides crucial ...

이 비디오를 Hi.In 관류된 마우스 심장의 과분극 MR 연구를 수행하는 방법을 배우게 됩니다. 연구실의 MD/PhD 학생인 David Shaul이 다양한 기술과 절차를 안내합니다. 오늘 우리는 31P NMR 분광법과 결합된 과분극 탄소-13 피루브산 대사를 연구하기 위한 프로토콜을 배웁니다.피루브산 대사는 호기성 대사와 혐기성 대사의 교차로에 있습니다. 따라서 심장의 다양한 상태를 연구하는 데 큰 가치가 있습니다. 자, 시작하겠습니다.마우스 심장은 10mm NMR 튜브 내에서 Krebs-Hensleit 버퍼로 분리되고 관류됩니다. 그런 다음 심장을 NMR 분광계에 삽입합니다. 거기에서 31P 스펙트럼이 기록되어 아데노신 삼인산, 인산 및 무기 인산염의 공명을 관찰하여 심장 에너지 및 pH를 관찰합니다.한편, 첫 번째 위치에서 탄소 -13으로 표지 된 피루브산 샘플은 과분극됩니다. 그리고 용해가 발생한 후 심장에 주입하여 젖산, 무기물 및 피루브산을 실시간으로 조직화된 활동을 측정할 수 있습니다. 실험 하루 전에 400 밀리리터의 변형 된 Krebs-Henseleit 완충액을 준비하십시오.첫 번째 단계로, 우리는 이중 증류수에서 이러한 성분을 해결합니다. 그런 다음 이 용액을 이 산소 혼합물로 20분 동안 거품을 낸 다음 염화칼슘을 첨가합니다. pH를 7.4로 조정합니다.실험 당일에 포도당과 인슐린을 첨가하십시오. 수조를 섭씨 40도로 설정합니다. 200 밀리리터의 KH 버퍼가있는 중간 병을 욕조에 넣습니다.연동 펌프를 사용하여 KH 버퍼를 재활용하십시오. 하나의 유입 라인과 두 개의 유출 라인을 연결하십시오. 가열된 KH 버퍼에 유입 및 유출 라인을 삽입합니다.95% O2 및 5% CO2의 산소 혼합기를 사용하십시오. 그런 다음 가열된 KH 버퍼에 산소 라인을 삽입합니다. 연동 펌프를 켜고 분당 7.5밀리리터의 일정한 유량 무게로 조정합니다.심장을 도입하기 전에 시스템을 보정하고 싶습니다. 따라서 유입 및 유출 라인을 10mm NMR 튜브에 삽입하고 NMR과 호환되는 광학 온도 프로브를 삽입합니다. NMR 튜브를 자석 구멍에 삽입합니다.가열 탱크를 섭씨 42도로 조정하고 NMR 가열을 사용하여 자석 내부 온도를 섭씨 37도로 조정합니다. NMR 온도는 NMR 호환 온도 코어를 사용하여 자석 내부의 KH 버퍼에서 실제로 모니터링됩니다. 이제 31P 분광법을 사용하여 완충액 내부의 무기 인산염 신호를 관찰할 수

investigating-cardiac-metabolism-isolated-perfused-mouse-heart-with

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

함께 Langendorff 모드 절연 심장...

를 사용하여 절연 마우스 마음에 심장 기능 및 에너 지학 평가 31 P NMR 분광학

다중 구획 동적 팬텀은 hyperpolarized magnet resonance agents를 사용하여 대사 연구를 위한 일부 관심 생물학을 시뮬레이션하는 데 사용됩니다.

과분극 자기 공명 에이전트의 연구 다중 구획 동적 단일 효소 팬텀의 사용

다음 프로토콜은 분리된 작동 랫드 심장에서 포도당 및 지방산 산화 속도의 정량적 측정을 위한 완충액의 준비 및 활용을 설명합니다. 샘플 분석 및 데이터 해석에 사용되는 방법도 논의됩니다.

격리 된 작업 쥐의 심장에서 포도당과 지방산 산화의 가격의 결정 방법

후속 샘플 용해를 통한 동적 핵 분극은 생물학적 시스템의 신진대사에 대한 실시간 연구를 가능하게 했습니다. 과분극[1-13C]피루브산은 in vitro에서 전립선 암종 세포주에서 젖산 탈수소효소 활성을 연구하는 데 사용되었습니다.

과분극 (13) C 대사 자기 공명 분광학 및 이미징

여기에서 우리는 심혼에 있는 심실 광학 카테터를 심장 벽을 가로질러 흡광도 분광학을 능력을 발휘하기 위하여 공류된 심혼에 이용하는 방법을 소개합니다. 얻은 데이터는 조직 산소 장력뿐만 아니라 기질 활용 및 멤브레인 잠재력에 대한 강력한 정보를 이 유비쿼터스 제제에서 심장 성능 측정과 동시에 제공합니다.

교란 성 포유류 심장의 경부 흡광도 분광학을 사용하여 세포 대사를 모니터링하기위한 심장 내 측 발사 라이트 카테터

우리는 빠른 필드 사이클 이완을 사용하여 동적 핵 편광에 의해 과분극 13C 농축 화합물의 스핀 격자 이완 시간의 자기장 의존성을 측정하는 프로토콜을 제시한다. 구체적으로, 우리는[1-13C] pyruvate로 이것을 입증했습니다, 그러나 프로토콜은 그밖 과극화한 기판으로 확장될 수 있었습니다.

과분극[1-13C] 피루바테의 스핀 격자 이완 자기장 의존도 측정

이 프로토콜은 맞춤형 생물반응기 시스템을 과분극 ¹³C NMR 분광법과 통합하여 살아있는 세포의 실시간 피루브산 대사를 측정함으로써 대사 연구 및 약물 스크리닝 응용 분야의 재현성과 운동 정확도를 개선합니다.

과분극 13CNMR을 사용한 살아있는 세포의 실시간 대사 검출

이 문서 potentiometric 염료 (DI - 8 - ANEPPS)를 사용 Langendorff - perfused 쥐 심장의 표면에 광학 이미지 조치 가능성이 운동에 높은 시간적 및 공간적 해상도 기법을 설명합니다.

Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

다음 프로토콜은 환기를 분리하고 오른쪽 심실 afterload에 혈액의 흐름, 공기 흐름,기도 변화와 혈관 변화의 효과를 계량하기 위해서는 안정이나 타악기 폐동맥 혈관 압력 유량 관계를 측정하는 마우스 폐가 instrumenting 과정을 설명합니다.

절연, 환기 및기구 마우스 폐의 특성화는 타악기 흐름 Perfused

전자 상자 성체의 공명 (EPR) 분광학은 철 (II)-N-메틸-D-glucamine dithiocarbamate, 철 (MGD)를 사용하여 인간 neutrophils에서 소 대동맥 내피 세포와 초과 산화물 라디칼 음이온에서 질소 산화물을 감지하기 위해...

질소 산화물과 세포로부터 전자 상자 성체의 프로그램 공명 분광학에 의한 초과 산화물 음이온 급진적가 탐지 스핀 트랩을 사용하여

배우세요 과분극 [1-13C]피루브산과 31P NMR 분광법을 활용하여 분리된 관류 마우스 심장에서 실시간 심장 대사를 조사하는 방법을. 이 기법은 심장 에너지학과 대사 흐름을 정량화하여 건강한 상태와 질병 상태의 심장 생리를 연구하는 데 활용됩니다.

과분극 [^1-13C] 피루브산 및 ¹³C / ³¹P NMR 분광법을 사용하여 분리 된 관류 마우스 심장에서 심장 대사 조사

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