배양된 초파리 뇌 외래 식물에서 신경 줄기 세포 재활성화
2022년 5월 18일
배양된 초파리 뇌 외식편에서 정동작 신경줄기세포를 재활성화시키는 방법이 확립되었다. 이 방법을 사용하여, 전신 신호의 역할은 신경 줄기 세포 정지, 출입의 조절에서 조직 내재적 신호로부터 결합되지 않을 수 있다.
우리는 배양된 초파리 뇌 외식편에서 정동작 신경 줄기 세포를 재활성화하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 배양 배지에 외인성 인자를 공급할 수 있고 신경세포 재활성화를 분석할 수 있다. 더 나은 줄기 세포 치료법은 정지 된 줄기 세포가 외인성 단서에 어떻게 반응하고 세포주기에 진입하는지에 대한 더 나은 이해에 의해 개발 될 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 과학자 인 Susan Doyle이 될 것입니다. 조심스럽게 해부 현미경으로 포도 한천 접시에서 약 20 ~ 25 마리의 갓 부화 한 유충을 선택하십시오. 약 두 밀리리터의 PBS로 페트리 접시를 채우고 PBS에 유충이 들어있는 도구의 팁을 두 분 동안 담그십시오.
두 분 후, 바닥에 액체를 풀링하기 위해 접시를 비스듬히 팁하고 작은 페인트 브러시를 사용하여 페트리 접시의 바닥을 위로 액체에서 애벌레를 닦으십시오. 페인트 브러시에있는 모든 유충을 모으고 유충을 PBS가 들어있는 페트리 접시로 다시 옮기기 전에 70 % 에탄올로 간단히 헹구십시오. 작업 영역, 해부 도구, 포셉 및 두 개의 유리 시계 접시에 70 % 에탄올을 뿌리고 벤치에서 말리십시오.
보충 된 슈나이더의 배양 배지 또는 SSM을 만들어 얼음 위에 놓습니다. 각 유리 시계 접시에 매체 한 밀리리터를 피펫하십시오. 멸균 팁이있는 마이크로 피펫을 사용하여 PBS 플레이트에서 갓 부화 한 유충을 첫 번째 유리 시계 접시의 SSM으로 옮깁니다.
해부 현미경으로 포셉을 사용하여 SSM으로 두 번째 유리 시계 접시에 놓인 유충에서 뇌를 해부하고 필요에 따라 배율을 조정하십시오. 하나의 포셉을 사용하여 입 후크를 잡고 다른 하나는 부드럽게 몸을 반쯤 잡고 반대 방향으로 당겨 유충을 두 조각으로 나눕니다. 15~20개의 뇌를 해부한 후 1밀리리터의 SSM을 멸균된 24웰 배양 트레이의 한 웰에 추가합니다.
마이크로 피펫과 멸균 팁을 사용하여 갓 해부 된 뇌를 SSM으로 옮긴 다음 섭씨 25도에서 24 시간 동안 뇌로 매체를 배양합니다. 990 마이크로리터의 SSM과 함께 5-에티닐-2'데옥시우리딘 또는 EDU의 10 밀리몰 스톡의 피펫 10 마이크로리터를 멸균 마이크로원심분리 튜브에 넣고 혼합한 다음, EDU SSM 1밀리리터를 멸균 12-웰 배양 트레이의 한 웰에 피펫팅한다. SSM을 함유하는 웰로부터 멸균 팁이 있는 마이크로피펫을 사용하여 뇌를 EDU SSM 용액을 함유하는 새로운 웰로 옮기고 섭씨 25도에서 한 시간 동안 인큐베이션한다.
다음으로, EDU 라벨이 붙은 뇌를 한 밀리리터의 고정제가 들어있는 동일한 배양 트레이의 다른 웰로 옮기고 뇌가 20 분 동안 고정되도록하십시오. 고정 후 마이크로 피펫을 사용하여 뇌를 72 웰 미니 트레이 웰로 신속하게 옮깁니다. PBT 10 마이크로 리터로 뇌를 세 번 헹구고 각각 10 분 동안 세 번 세척을 반복하여 뇌가 항상 액체로 덮여 있는지 확인하십시오.
뇌에 10 마이크로 리터의 블로킹 용액을 피펫. 트레이를 덮고 가장자리 주위에 파라필름 스트립으로 밀봉하십시오. 이 그림은 인슐린 염색으로 SSM에서 24 시간 배양 한 후 대형 EU 양성 및 데드 팬 양성 신경 세포 세포를 보여줍니다.
인슐린이 없는 슈나이더의 배지에서 24시간 후, 갓 부화한 오리건 R 야생형 뇌는 4개의 버섯 몸 신경아세포와 하나의 심방측성 신경아세포 외에는 큰 크기의 EDU 양성 및 데드팬 양성 신경아세포 세포가 없었다. 공초점 이미징 동안, 외삽 된 뇌 조직의 작은 구멍에서 큰 크기의 구멍과 같은 손상이있는 일부 뇌 반구가 때때로 관찰되었습니다. 구멍이있는 뇌는 분석에 사용되지 않았습니다.
조직 손상을 피하기 위해 조심스럽게 조직을 해부하고 피펫을 부드럽게 해부하십시오. 또한 가능한 한 멸균되고 문화를 오염시키지 않도록 노력하십시오. 배양 배지는 다른 인자를 추가함으로써 쉽게 조작될 수 있기 때문에, 이 기술은 외인성 신호전달 및 신경아세포 정지 진입 및 출구에 관한 미래의 가설을 다루기 위해 사용될 수 있다.
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개요
이 연구는 배양된 Drosophila 뇌 외식물에서 휴면 신경줄기세포를 재활성화하는 방법을 설명합니다. 이 연구는 신경줄기세포 역학에 대한 전신 및 조직 고유 신호의 영향을 조사하며, 특히 이러한 신호가 세포의 휴면, 진입 및 퇴출을 어떻게 조절하는지에 초점을 맞추고 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 줄기 세포 연구
배경
- 신경줄기세포의 휴면은 자가 갱신과 분화 사이의 균형을 유지하는 데 필수적입니다.
- 고유 및 외부 요인이 휴면에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 것은 줄기세포 치료를 향상시킬 수 있습니다.
- Drosophila는 신경줄기세포의 역학을 연구하는 데 귀중한 모델로 사용됩니다.
- 이 연구는 이러한 세포의 재활성화 과정에 대한 지식 격차를 해소합니다.
연구 목적
- 체외에서 휴면 신경줄기세포를 연구할 수 있는 방법을 수립하기 위함입니다.
- 전신 신호 대비 조직 고유 신호의 하위 효과를 분석하기 위함입니다.
- 신경아세포 재활성화 및 휴면 조절에 대한 이해를 향상시키기 위함입니다.
사용된 방법
- 주요 실험 플랫폼으로 배양된 Drosophila 뇌 외식물을 사용했습니다.
- 배양 조건을 조작하여 신경아세포 재활성화를 평가하는 데 중점을 두었습니다.
- 주요 단계로는 유충 뇌의 해부 및 다양한 배양 배지와의 배양이 포함되었습니다.
- 분열하는 세포를 표지하기 위해 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EDU)을 사용했습니다.
- 처리 후 신경아세포 집단의 이미징 및 분석을 실시했습니다.
주요 결과
- 이 연구는 보충된 배양 배지를 사용하여 신경아세포의 성공적인 재활성화를 입증했습니다.
- 배양 환경에서 인슐린의 존재 여부에 따른 신경아세포 반응의 중요한 차이를 확인했습니다.
- 특정 조건에서 신경아세포 중 활발한 증식을 나타내는 EDU 양성 세포를 관찰했습니다.
- 신경줄기세포 행동에 대한 향후 조사를 돕는 명확한 방법론을 수립했습니다.
결론
- 이 방법은 줄기세포 휴면 및 활성화 메커니즘을 탐구하기 위한 견고한 틀을 제공합니다.
- 연구 결과는 신경아세포 역학에 영향을 미치는 신호 전달 경로에 대한 통찰력을 제공하여 줄기세포 치료를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 이 연구의 함의는 외부 신호가 신경 발달 및 재생을 어떻게 조절하는지 이해하는 데 확장됩니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Reactivation of quiescent neural stem cells in Drosophila brain explants enables systematic interrogation of extrinsic cues governing stem cell proliferation. This platform supports predictive confidence in target validation for pathways regulating stem cell quiescence and activation. The method's scalability and manipulability position it as a valuable tool for early discovery and mechanistic de-risking in neuroregeneration research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven testing of extrinsic factors influencing neural stem cell cycle entry.
- Supports functional validation of signaling pathways implicated in stem cell quiescence and activation.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating systemic versus intrinsic regulatory effects.
- Provides a tractable model for prioritizing targets in regenerative medicine research.
Screening & Assay Development
- Permits standardized preparation of explanted brain cultures for high-content screening.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of neuroblast proliferation via EDU labeling.
- Enables scalable screening of candidate extrinsic cues or small molecules affecting stem cell dynamics.
- Supports assay platform reuse for diverse pathway interrogation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms by modeling conserved stem cell regulatory pathways.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of neuroregenerative targets.
- Enables risk-adjusted advancement of candidate pathways for translational biomarker development.
- Offers predictive de-risking for regenerative therapy strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This explant culture method integrates into the early discovery-to-lead identification continuum for neuroregeneration and stem cell modulation programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of extrinsic and intrinsic factors controlling neural stem cell quiescence and activation.
- Screening: Provides a reproducible, quantitative assay for evaluating proliferation-inducing cues or compounds.
- Analytics: Delivers EDU-based proliferation measurements and neuroblast marker analysis for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by leveraging conserved regulatory pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative screening and mechanistic studies across neuroregeneration projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in stem cell regulation.
- Operational Value: Standardizes explant preparation and assay conditions for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of regenerative medicine candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila dissection and neural tissue handling.
- Needs access to sterile culture facilities and confocal imaging infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of explant preparation and assay protocols.
- Adaptation to other model systems may require optimization of culture conditions and markers.
- Careful tissue handling is essential to avoid damage and ensure data integrity.
