Name: 배양된 초파리 뇌 외래 식물에서 신경 줄기 세포 재활성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: 배우세요 Drosophila 뇌 외래 식물에서 휴지 신경 줄기 세포 재활성화 방법을. 배양 조건 조작과 EDU 라벨링을 통해 신경모세포 증식을 분석하고 줄기 세포 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 LSAMP Bridges to Doctorate 프로그램 (CNK)과 NIH / NIGMS (R01-GM120421 및 R35-GM141886)를 인정합니다. 그림 1에 대해 Conor Sipe 박사님께 감사드립니다. 우리는 또한 모든 Siegrist 실험실 회원들에게 지속적인 지원과 멘토링에 감사드립니다. 우리는 특히 Chhavi Sood와 Gary Teeters에게 원고를주의 깊게 읽고 의견을 제공 해 주신 것에 감사드립니다.

<ol><li>Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+clinical+applications+of+stem+cells+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).</li>
<li>Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine%3A+challenges+and+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).</li>
<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+and+the+evolving+notion+of+cellular+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stem cells and the evolving notion of cellular identity.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 20140376(2015).</li>
<li>Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing%3A+A+cellular+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Wound healing: A cellular perspective.</a> Physiological Reviews. 99, 665-706 (2019).</li>
<li>van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+quiescence%3A+Dynamism%2C+restraint%2C+and+cellular+idling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling.</a> Cell Stem Cell. 24, 213-225 (2019).</li>
<li>Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+coordination+of+T+cell+quiescence+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Metabolic coordination of T cell quiescence and activation.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 55-70 (2020).</li>
<li>Wosczyna, M. N., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+muscle+stem+cell+support+group%3A+Coordinated+cellular+responses+in+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration.</a> Developmental Cell. 46, 135-143 (2018).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139, 4297-4310 (2012).</li>
<li>Kang, K. H., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+neural+stem+cell+self-renewal+and+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila.</a> Cell and Tissue Research. 359, 33-45 (2015).</li>
<li>Chell, J. M., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition-responsive+glia+control+exit+of+neural+stem+cells+from+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence.</a> Cell. 143, 1161-1173 (2010).</li>
<li>Sousa-Nunes, R., Yee, L. L., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+cells+reactivate+quiescent+neuroblasts+via+TOR+and+glial+insulin+relays+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fat cells reactivate quiescent neuroblasts via TOR and glial insulin relays in Drosophila.</a> Nature. 471, 508-512 (2011).</li>
<li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila%3A+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125, 2149-2158 (1998).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremes+of+lineage+plasticity+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain.</a> Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).</li>
<li>Sipe, C. W., Siegrist, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyeless+uncouples+mushroom+body+neuroblast+proliferation+from+dietary+amino+acids+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila.</a> Elife. 6, 26343(2017).</li>
<li>Speder, P., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+and+local+cues+drive+neural+stem+cell+niche+remodelling+during+neurogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila.</a> Elife. 7, 30413(2018).</li>
<li>Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dilp-2-mediated+PI3-kinase+activation+coordinates+reactivation+of+quiescent+neuroblasts+with+growth+of+their+glial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche.</a> PLoS Biology. 18, 3000721(2020).</li>
<li>Colombani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nutrient+sensor+mechanism+controls+Drosophila+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth.</a> Cell. 114, 739-749 (2003).</li>
<li>Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+insulin+secretion+by+fat+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila.</a> Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).</li>
<li>Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culturing+of+whole%2C+developing+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270(2012).</li>
<li>Bostock, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immobilization+technique+for+long-term+time-lapse+imaging+of+explanted+drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094(2020).</li>
<li>Datta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+neuroblast+proliferation+in+explant+culture+of+the+Drosophila+larval+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS.</a> Brain Research. 818, 77-83 (1999).</li>
</ol>

저자는 경쟁 관심사가 없습니다.

뇌 외식편을 배양하기 위해 여기에 기술된 방법은 대부분의 실험실 환경에서 수행될 수 있다. 필요한 도구와 절차 및 데이터 수집은 간단하고 간단합니다. 이 방법을 이용하면, NB 재활성화 및 증식을 조절하는 세포 신호전달 캐스케이드 및 외인성 인자와 관련된 것들을 포함하는 다양한 가설을 시험할 수 있다. 여기에서, 야생형 OregonR 동물을 사용하여, 우리는 외인성 인슐린이 다른 동물 특이적 전신 단서와 무관하게 정지로부터 NB를 재활성화시키기에 충분하다는 것을 발견했다. GAL4 / UAS 시스템을 사용하여 NB 재활성화에서 PI3 키나제 신호 전달의 역할을 더 잘 이해하기 위해 세포 유형 별 방식으로 인슐린 경로 구성 요소를 녹다운하거나 과발현 할 수도 있습니다. 유전학을 사용하는 것 외에도, 매체의 구성 요소는 NB 재활성화 및 증식을 촉진하는 외인성 단서 또는 신호를 추가로 테스트하도록 조작 될 수 있습니다. 예를 들어, 스테로이드 호르몬 ecdysone의 첨가가 배양에서 NB 재활성화 및 증식의 비율을 증가시킬 것이라는...

줄기 세포는 재생 의학 1,2에 사용할 수있는 잠재력 때문에 큰 관심이 있습니다. 많은 동물, 특히 오래 사는 동물은 성인 조직 내에서 줄기 세포를 유지합니다. 이러한 상주 줄기 세포는 조직 항상성을 유지하는 기능을 하며 신체적 상해 또는 질병 3,4 이후의 복구에 활용된다. 성체 동물에서 대부분의 줄기 세포는 정지, 성장 신호 전달의 세포 주기 정지 및 불활성화를 특징으로 하는 비교적 휴면 상태이다 5. 외인성 단서에 반응하여 줄기 세포는 정지에서 빠져 나와 세포주기에 들어가 조직 유형에 특유한 딸 자손을 생성하기 시작합니다. 예를 들어, 효과적인 면역 반응을 탑재하기 위해, 항원-제시 세포는 정지된 나이브 T 세포가 세포 주기로 진입하도록 유도하고 clonally 확장6. 골격근 손상에 반응하여, 근육 위성 줄기 세포는 세포주기에 들어가 손상된 myofibrils 5,7을 대체하기 위해 딸 근아세포를 생성합니다. 정지 줄기 세포가 외인성 신호에 반응한다는 것은 분명하지만, 많은 경우 외인성 단서의 본질은 큐 유도 줄기 세포 활성화의 메커니즘뿐만 아니라 불분명하다. 정지 된 줄기 세포가 외인성 단서에 어떻게 반응하고 세포주기에 진입하는지에 대한 더 나은 이해를 얻는 것은 클리닉에서 더 나은 줄기 세포 치료법의 개발에 도움이되고 과학적 지식을 증가시킬 것입니다.
수십 년 동안 모델 유기체는 발달 및 성인기에 줄기 세포 증식을 조절하는 유전자 및 세포 신호 전달 경로를 밝히는 데 사용되어 왔습니다. 초파리에서 신경 줄기 세포 (NBs)로 알려진 신경 줄기 세포 (NSCs)는 발달 전반에 걸쳐 분열하여 궁극적으로 통합되는 모든 뉴런과 글리아교를 생성하여 뇌 기능에 필요한 신경 회로를 형성합니다 8,9. 다른 줄기 세포와 마찬가지로, NB는 비대칭적으로 분열하여 자기 갱신하고, 어떤 경우에는 대칭적으로 줄기 세포 풀을 확장합니다. NB는 배아 발생 중에 지정되며 대부분은 모성 영양소 저장소의 감소와 함께 끝까지 정지에 들어갑니다 (그림 1). 배아 발생이 완료되면 애벌레가 부화하여 먹이를 먹기 시작합니다. 동물 먹이에 대한 응답으로, NBs는 정지로부터 재활성화되고 세포 분열을 재개한다 10,11,12,13,14,15,16. 초파리 CNS는 비교적 간단하고 NB가 정해진 시간에 정해지기 때문에 초파리를 사용하여 정지, 출입 조절을 조사하는 것이 이상적임이 입증됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63189/63189fig01.jpg"> 그림 1: 발달 시간 동안 CB NB(중추 뇌 신경아세포, 적색) 및 MB NB(버섯체 신경아세포, 파란색)의 상대적 증식. 배아 발생이 끝나면 대부분의 NB (빨간색 선)는 증식을 멈추고 정지에 들어갑니다. 갓 부화 한 애벌레가 첫 번째 완전한 식사를 섭취 할 때까지 정지가 계속됩니다. 이 방법론의 초점 지점은 빨간색 원 (1, 정지 및 2, 재활성화)으로 표시됩니다. MB NB (파란색)는 발달 기간 동안 지속적으로 분열하는 중추 뇌 NB의 하위 집합입니다 (뇌 반구 당 4 개). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63189/63189fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
동물 먹이에 대한 응답으로, PI3-키나제 및 TOR 성장 신호전달 경로는 NB와 그들의 신경교 및 기관 틈새10,11,15,16에서 활성화된다. 식이 영양소가 철회되거나 PI3-키나아제 수치가 감소하면 NB가 재활성화되지 않고 아교세포와 기관의 성장도10,11,15,16 감소합니다. 현재의 모델은 NB 재활성화가 지방 체내에 의한 애벌레 성장에 결합되며, 이는 동물 먹이12,17,18에 대한 반응으로 전신 신호를 방출한다고 가정한다. 이 신호는 여전히 애매한 상태로 남아 있으며, 뇌에서 초파리 인슐린 유사 펩티드 (Dilps)의 발현과 방출을 촉진하여 NB에서 PI3-kinase의 하류 활성화와 신경교 및 기관 틈새 시장으로 이어집니다. 전신 단서의 본질을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 배양 된 뇌 외식에서 정동작 NB를 재활성화하는 방법을 개발했습니다. 이 방법을 사용하면 NB의 재활성화는 전체 동물 전신 단서가없는 상태에서 분석 할 수 있습니다. 외인성 인자는 티미딘 유사체, EdU의 혼입에 기초한 배양 배지 및 NB 재활성화 검정에 재공급될 수 있다. 이 방법을 사용하여, 우리는 외인성 인슐린이 뇌 외식식물에서 정동작 NB를 재활성화시키기에 충분하다는 것을 결정했다. 앞으로의 연구는 다시 추가 될 때 뇌 외식에서 NB 정지를 긍정적으로 또는 부정적으로 조절하는 추가 요인을 확인하는 것을 목표로합니다.

<table><tbody><tr><td>10 & 마이크로; L 피펫 팁</td><td>Denville Sci</td><td>P2102</td><td></td></tr><tr><td>1000 &마이크로; L 피펫 팁</td><td>Denville Sci</td><td>P2103-N</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L 피펫터</td><td>Gilson</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드(10 x 10 mL)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>2912.60.0000</td><td>애벌레 뇌의 고정에 사용</td></tr><tr><td>20 &마이크로; L 피펫</td><td>Gilson</td><td>P20</td><td></td></tr><tr><td>200 &마이크로; L 피펫 팁</td><td>Denville Sci</td><td>1158U56</td><td></td></tr><tr><td>24-웰 멀티웰 배양 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-197-4477</td><td></td></tr><tr><td>35mm 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td>포도 플레이트 성분</td></tr><tr><td>4 &deg; C 냉장고</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>항체 용액에서 >24시간 배양을 위한 이상적인 온도 제공</td></tr><tr><td>63x Objective</td><td>Lecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>활성 건조 효모</td><td>대부분의 슈퍼마켓</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agarose Fisher Scientific</td><td>214010</td><td>포도 접시 성분</td></tr><tr><td>이미징용 Click-iT EdU 세포 증식 키트, Alexa Fluor 647 염료</td><td>Thermo Fisher </td><td>증식 세포를 라벨링하는</td>Scientific <td>C10340</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm, 4 oz Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-544-10</td><td>두 개의 커버 슬립은 현미경 슬라이드의 끝에 매우 접착되어 있습니다. 이것은 뇌가 이미지화되는 동안 안티페이드로 떠다닐 수 있는 공간을 만듭니다.</td></tr><tr><td>커버슬립, 22mm x 50mm x 1mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545E</td><td>커버슬립은 현미경 슬라이드의 두 개의 정사각형 커버슬립에 배치되어 이미징하는 동안 페이드 방지 뇌가 움직이지 않도록 합니다.</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof(100%), Decon Labs, 1갤런 병</td><td>Fisher Scientific</td><td>2701</td><td>배양 배지에서 24시간 보류 전에 유충을 씻어내는 데 사용</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (10%)</td><td>세포</td><td>배양 배지용</td> Sigma <td>F4135-100ML</td> 보충제.</tr><tr><td>해부를 위한 미세한 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-20</td><td>절제에 사용되는 셉트. 그들은 날카롭게 할 때 가장 잘 작동합니다.</td></tr><tr><td>Genessee Scientific</td><td>32-130</td>을 <td>건너기 위한 플라이 병</td><td>이 병은 파리가 포도 접시에 알을 낳을 수 있도록 하는 용기로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>유리 해부 접시 (3 well)</td> <td>더 이상 사용할 수</td><td></td><td></td>없습니다</tr><tr><td>글루타티온</td><td>시그마</td><td>G6013</td><td>세포 배양 중 산화 보호 기능을 제공합니다.</td></tr><tr><td>염소 세럼</td><td>시그마</td><td>G9023- 10ML</td><td>차단제</td></tr><tr><td>포도 플레이트</td><td>집에서</td><td>제작</td><td>갓 부화한 알을 수집하기 위한 포도 주스/아가로스 플레이트</td></tr><tr><td>이미지 J</td><td>Imagej.net/fiji/downloads</td><td>무료 다운로드:&nbsp; 세포</td><td>및 Edu 재활성화</td>인큐베이터를 세는 데 사용되는 https://fiji.sc 이미징 플랫폼</tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>실험 전반에 걸쳐 온도, 습도 및 빛 노출이 정확히 동일한지 확인합니다.</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마</td><td>I0516</td><td>실험의 독립 변수</td></tr><tr><td>층류 후드</td><td></td><td></td><td>분취 배양 배지용</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>시그마</td><td>G7513</td><td>세포 배양 중 지원</td></tr><tr><td>제공 Nunc 72-웰 마이크로웰 미니 트레이</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-154</td><td>이 트레이에서 면역염색 단계가 수행됩니다</td></tr>. 파라<tr><td>필름</td><td>증발</td>을 <td>방지하기 위해 플레이트를 밀봉하는 데 사용되는</td>Fisher Scientific <td>S37440</td> 필름</tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma</td><td>P4458-100ml</td><td>배양 중 세포의 박테리아 오염을 방지하는 데 사용되는 항생제.</td></tr><tr><td>인산염 완충액, pH7.4</td><td>Made</td><td>in house 제조</td><td>솔벤트 단계 고정 및 염색 후 뇌를 세척하는 데 사용</td></tr><tr><td></td><td>Pick Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td>포도 플레이트에서 유충을 제거하는 데 사용</td></tr><tr><td>프로피온산 Fisher</td><td>Scientific</td><td>A-258</td><td>포도 플레이트 성분</td></tr><tr><td>Rabbit 405</td><td>Abcam</td><td>ab175653</td><td>면역 염색</td></tr><tr>에 사용되는 항체<td>Rat 555</td><td>Abcam</td><td>ab150166</td><td>면역 염색에 사용되는 항체</td></tr><tr><td>Rb Scribble</td><td>Chris Doe</td><td></td><td></td>의 선물</tr><tr><td>Rt Deadpan</td><td>Abcam</td><td>ab195173</td><td>면역 염색에 사용되는 항체</td></tr><tr><td>Schneiders Culture Medium</td><td>Life Tech</td><td>21720024</td><td>세포의 성장과 증식을 돕는 영양소가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL)</td><td>Life Tech</td><td>S36963</td><td>페이딩 형광단에 대한 보호를 제공하는 시약</td></tr><tr><td>멸균수</td><td>오토클레이브 집에서</td><td></td> 만든 Milli-Q 물 <td>용액에 필요</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher</td><td>S2-12</td><td>포도 접시 성분</td></tr><tr><td>Superfrost 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td>대부분의 슈퍼마켓</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td>포도 플레이트 성분</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284-100ML</td><td>PBT</td></tr><tr><td>Welch's 100% 포도 포도 주스</td><td>대부분의 슈퍼마켓</td><td></td><td>포도 플레이트 성분</td></tr></tbody></table>

배양된 초파리 뇌 외래 식물에서 신경 줄기 세포 재활성화

Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

신경 줄기 세포 (NSCs)는 증식, 분화, 아폽토시스를 겪고, 심지어 정지를 출입 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 이러한 과정의 대부분은 NSC 내재적 유전 프로그램과 NSC 외인성 인자, 국소 및 전신 간의 복잡한 상호 작용에 의해 제어됩니다. 유전 모델 유기체에서, Drosophila melanogaster, NSCs, 신경 세포 (NBs)로 알려진, 정지에서 증식 동안 배아에서 애벌레로 전환. 이 기간 동안 애벌레는 달걀 껍질에서 나와서식이 영양소를 찾아 기어 다니기 시작합니다. 동물 먹이에 대한 반응으로, 지질 저장 능력을 가진 내분비 기관 인 지방 몸체는 순환하는 용혈림프로 전신적으로 방출되는 신호를 생성합니다. 지방 신체 유래 신호 (FBDS)에 반응하여 초파리 인슐린 유사 펩티드 (Dilps)가 생성되어 뇌 신경 분비 뉴런 및 글리아교에서 방출되어 NB와 그 아교 및 기관 틈새 시장에서 PI3-키나제 성장 신호 전달의 하류 활성화로 이어집니다. 이것이 NB가 정지에서 확산으로 전환하는 방법에 대한 현재 모델이지만, FBDS 외인성 큐의 본질은 여전히 애매합니다. NB 외인성 전신 단서가 정지로부터의 출구를 조절하는 방법을 더 잘 이해하기 위해, 동물 먹이를 먹기 전에 시험관 내에서 초기 애벌레 뇌를 배양하는 방법이 개발되었습니다. 이 방법을 이용하면, 외인성 인자가 배양 배지에 공급될 수 있고 NB는 정지 분석으로부터 빠져나갈 수 있다. 우리는 외인성 인슐린이 전뇌 외식식물에서 정지로부터 NB를 재활성화시키기에 충분하다는 것을 발견했습니다. 이 방법은 대규모 스크린에 매우 적합하기 때문에 NB 정지 대 증식 결정을 조절하는 추가적인 외인성 단서를 식별하는 것을 목표로합니다. NSC 증식 결정을 조절하는 유전자와 경로가 진화적으로 보존되기 때문에, 이 분석의 결과는 클리닉에서 재생 요법을 개선하는 데 대한 통찰력을 제공할 수 있다.

갓 부화한 오레곤R 야생형 뇌를 해부하고 인슐린으로 보충된 슈나이더 배지(SSM)에서 24시간 동안 배양하였다. Tissues는 프로토콜에 따라 고정되고 염색되었다. NBs를 검출하기 위해 데드판(Dpn)에 대해 생성된 일차 항체와 세포막을 표지하기 위한 낙서가 사용되었다. 티미딘 유사체 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(Edu)을 첨가하여 S상 진입 및 NB 재활성화를 검출하였다. 우리는 배양물에서 24 시간 후에 큰 크기의 Edu 양성 및 Dpn 양성 NB를 발견했습니다 (그림 6A-C). 다음으로, 갓 부화한 OregonR 야생형 뇌를 인슐린이 없는 보충된 슈나이더스 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 배양에서 24시간 후, 우리는 네 개의 버섯체 NBs와 하나의 심방측성 NB를 제외한 큰 크기의 에듀포지티브 및 Dpn 양성 NB를 발견하지 못하였다(도 6D-F<...

배양된 초파리 뇌 외식편에서 정동작 신경줄기세포를 재활성화시키는 방법이 확립되었다. 이 방법을 사용하여, 전신 신호의 역할은 신경 줄기 세포 정지, 출입의 조절에서 조직 내재적 신호로부터 결합되지 않을 수 있다.

Neural stem cells (NSCs) have the ability to proliferate, differentiate, undergo apoptosis, and even enter and exit quiescence. Many of these processes ...

우리는 배양된 초파리 뇌 외식편에서 정동작 신경 줄기 세포를 재활성화하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 배양 배지에 외인성 인자를 공급할 수 있고 신경세포 재활성화를 분석할 수 있다. 더 나은 줄기 세포 치료법은 정지 된 줄기 세포가 외인성 단서에 어떻게 반응하고 세포주기에 진입하는지에 대한 더 나은 이해에 의해 개발 될 수 있습니다.이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 과학자 인 Susan Doyle이 될 것입니다. 조심스럽게 해부 현미경으로 포도 한천 접시에서 약 20 ~ 25 마리의 갓 부화 한 유충을 선택하십시오. 약 두 밀리리터의 PBS로 페트리 접시를 채우고 PBS에 유충이 들어있는 도구의 팁을 두 분 동안 담그십시오.두 분 후, 바닥에 액체를 풀링하기 위해 접시를 비스듬히 팁하고 작은 페인트 브러시를 사용하여 페트리 접시의 바닥을 위로 액체에서 애벌레를 닦으십시오. 페인트 브러시에있는 모든 유충을 모으고 유충을 PBS가 들어있는 페트리 접시로 다시 옮기기 전에 70 % 에탄올로 간단히 헹구십시오. 작업 영역, 해부 도구, 포셉 및 두 개의 유리 시계 접시에 70 % 에탄올을 뿌리고 벤치에서 말리십시오.보충 된 슈나이더의 배양 배지 또는 SSM을 만들어 얼음 위에 놓습니다. 각 유리 시계 접시에 매체 한 밀리리터를 피펫하십시오. 멸균 팁이있는 마이크로 피펫을 사용하여 PBS 플레이트에서 갓 부화 한 유충을 첫 번째 유리 시계 접시의 SSM으로 옮깁니다.해부 현미경으로 포셉을 사용하여 SSM으로 두 번째 유리 시계 접시에 놓인 유충에서 뇌를 해부하고 필요에 따라 배율을 조정하십시오. 하나의 포셉을 사용하여 입 후크를 잡고 다른 하나는 부드럽게 몸을 반쯤 잡고 반대 방향으로 당겨 유충을 두 조각으로 나눕니다. 15~20개의 뇌를 해부한 후 1밀리리터의 SSM을 멸균된 24웰 배양 트레이의 한 웰에 추가합니다.마이크로 피펫과 멸균 팁을 사용하여 갓 해부 된 뇌를 SSM으로 옮긴 다음 섭씨 25도에서 24 시간 동안 뇌로 매체를 배양합니다. 990 마이크로리터의 SSM과 함께 5-에티닐-2'데옥시우리딘 또는 EDU의 10 밀리몰 스톡의 피펫 10 마이크로리터를 멸균 마이크로원심분리 튜브에 넣고 혼합한 다음, EDU SSM 1밀리리터를 멸균 12-웰 배양 트레이의 한 웰에 피펫팅한다. SSM을 함유하는 웰로부터 멸균 팁이 있는 마이크로피펫을 사용하여 뇌를 EDU SSM 용액을 함유하는 새로운 웰로 옮기고 섭씨 25도에서 한 시간 동안 인큐베이션한다.다음으로, EDU 라벨이 붙은 뇌를 한 밀리리터의 고정제가 들어있는 동일한 배양 트레이의 다른 웰로 옮기고 뇌가 20 분 동안 고정되도록하십시오. 고정 후 마이크로 피펫을 사용하여 뇌를 72 웰 미니 트레이 웰로 신속하게 옮깁니다. PBT 10 마이크로 리터로 뇌를 세 번 헹구고 각각 10 분 동안 세 번 세척을 반복하여 뇌가 항상 액체로 덮여 있는지 확인하십시오.뇌에 10 마이크로 리터의 블로킹 용액을 피펫. 트레이를 덮고 가장자리 주위에 파라필름 스트립으로 밀봉하십시오. 이 그림은 인슐린 염색으로 SSM에서 24 시간 배양 한 후 대형 EU 양성 및 데드 팬 양성 신경 세포 세포를 보여줍니다.인슐린이 없는 슈나이더의 배지에서 24시간 후, 갓 부화한 오리건 R 야생형 뇌는 4개의 버섯 몸 신경아세포와 하나의 심방측성 신경아세포 외에는 큰 크기의 EDU 양성 및 데드팬 양성 신경아세포 세포가 없었다. 공초점 이미징 동안, 외삽 된 뇌 조직의 작은 구멍에서 큰 크기의 구멍과 같은 손상이있는 일부 뇌 반구가 때때로 관찰되었습니다. 구멍이있는 뇌는 분석에 사용되지 않았습니다.조직 손상을 피하기 위해 조심스럽게 조직을 해부하고 피펫을 부드럽게 해부하십시오. 또한 가능한 한 멸균되고 문화를 오염시키지 않도록 노력하십시오. 배양 배지는 다른 인자를 추가함으로써 쉽게 조작될 수 있기 때문에, 이 기술은 외인성 신호전달 및 신경아세포 정지 진입 및 출구에 관한 미래의 가설을 다루기 위해 사용될 수 있다.

neural-stem-cell-reactivation-in-cultured-drosophila-brain-explants

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 동영상은 늦게 무대 Drosophila pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 라이브 문화의 전망 Fura - 2를 사용하여 칼슘 수준의 neurite의 파생물 및 이미징을 보여줍니다.

늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화

이 동영상은 midgastrula 무대 Drosophila의 배아에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 라이브 문화의 전망 중탄산염 기반 정의 매체 성장 2 일 후에 도금과 차별화된 뉴런 후 세포를 1 시간 보여줍니다. 뉴런은 전기 고르기하고 시냅스 연결을 형성합니다.

Midgastrula 스테이지 Drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비

이 문서 하나가 모방 수있는가하는 방법을...

전체의 전의 생체내의 Culturing, 개발 Drosophila의 뇌는

이 비디오는 초파리 뇌 신경 줄기 세포의 정지 상태에서 재활성화를 시작하는 외인성 인자를 식별하는 프로토콜을 보여줍니다. 갓 부화한 유충을 해부하여 뇌를 분리한 다음, 신경 줄기 세포의 재활성화 및 증식을 유도하는 호르몬의 잠재력을 평가하기 위해 테스트 호르몬이 있거나 없는 배지에서 배양합니다.

배양된 초파리 뇌 외식에서 신경 줄기세포 재활성화 분석

중추 신경계 재생 및 수리를 조사 Drosophila 애벌레의 복부 신경 코드를 사용하여 부상 패러다임이 설명되어 있습니다. 의도적으로 개발 한 소프트웨어 및 유전학과 정량 분석​​과 함께 시간 경과 및 고정 표본에서 공 촛점 현미경을 스캔 레이저, 다음 찌른 곳은 CNS 재생 및 수리의 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용됩니다.

에 중추 신경 시스템 복구를 조사하기 위해 상해 패러다임<em&gt; Drosophila</em

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)는 암이 침습적이 될 수 있도록 합니다. EMT를 조사하기 위해 혈청과 효소가 없는 신경줄기세포(NSC) 기반 체외 모델을 설명합니다. 이 표준화된 시스템을 통해 세포 이동, 유전자 및 단백질 발현에 대한 정량적 및 정성적 평가를 수행할 수 있습니다. 이 모델은 신약 개발에 적합합니다.

약 발견에 적합 EMT 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델

이 프로토콜의 목표는 ex vivo 초파리 애벌레 뇌 문화를 장기 형광 시간 경과 영상 분자 circadian 리듬을 모니터링 하기 위해 최적화 설정입니다. 이 방법의 약리학 분석 응용 프로그램 또한 토론 된다.

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

여기, 우리로 초파리 감각 신경- vivo에서 결합 하는 수지상 arborization (다) 신경 부상 모델, 라이브 영상, 2 광자 레이저 axotomy/dendriotomy, 그리고 강력한 비행 유전 도구 상자, 를 사용 하 여 프로토콜을 제시 잠재적인 발기인 및 neuroregeneration의 억제제 상영을 위한 플랫폼.

주변에 Neuroregeneration 중앙 신 경계를 연구 하 고 대 한 Vivo에서 초파리 부상 모델

이 문서는 성인 Drosophila 에 관통 외상성 뇌 손상을 입히고 결과 신경 발생을 검사하기위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

Drosophila 중앙 두뇌에 있는 성인 신경 발생을 자극하고 분석합니다

여기에서 우리는 생리학적 조건에서 세포 및 세포 내 역학을 관찰하기 위해 Drosophila melanogaster 세 번째 instar 유충에서 살아있는 외식편 뇌를 준비, 해부, 장착 및 이미지화하는 워크플로에 대해 논의합니다.

Drosophila melanogaster Third Instar 애벌레 뇌의 생세포 이미징

배우세요 Drosophila 뇌 외래 식물에서 휴지 신경 줄기 세포 재활성화 방법을. 배양 조건 조작과 EDU 라벨링을 통해 신경모세포 증식을 분석하고 줄기 세포 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

배양된 초파리 뇌 외래 식물에서 신경 줄기 세포 재활성화

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