Name: 일시적 발현 시스템을 사용한 포유류 세포에서 전장 인간 헌팅틴 변이체의 효율적이고 확장 가능한 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 학습하세요 HEK293 세포에서 전장 헌팅틴 단백질 변이체를 효율적으로 생산하고 정제하는 방법을. 이 프로토콜은 헌팅턴병 연구에 필수적인 고순도 단백질 확보를 가능하게 합니다.

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HTT의 MS 분석을 수행 한 버팔로에있는 뉴욕 주립 대학의 제약 과학과에 감사드립니다. 이 작업은 CHDI 재단과의 공동 노력이었습니다. 엘리자베스 엠 도허티에게 특별히 감사드립니다. 이그나시오 무 노즈-산후안; 더글라스 맥도날드, CHDI 재단; 그리고 Rory Curtis, Curia, 이 원고를 준비하는 동안 귀중한 의견을 주셨습니다. 우리는 또한이 연구 노력을 지원 한 Michele Luche, Mithra Mahmoudi 및 Stephanie Fox에게 감사드립니다.

<ol><li>Walker, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease.</a> Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).</li>
<li>McColgan, P., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+a+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: a clinical review.</a> European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).</li>
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<li>MacDonald, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Nasir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Huntington%27s+disease+gene+results+in+embryonic+lethality+and+behavioral+and+morphological+changes+in+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes.</a> Cell. 81 (5), 811-823 (1995).</li>
<li>Dragatsis, I., Levine, M. S., Zeitlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Hdh+in+the+brain+and+testis+results+in+progressive+neurodegeneration+and+sterility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice.</a> Nature Genetics. 26 (3), 300-306 (2000).</li>
<li>Anne, S. L., Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+huntingtin+by+cyclin-dependent+kinase+5+is+induced+by+DNA+damage+and+regulates+wild-type+and+mutant+huntingtin+toxicity+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage and regulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (27), 7318-7328 (2007).</li>
<li>Dietrich, P., Johnson, I. M., Alli, S., Dragatsis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+huntingtin+in+the+adult+mouse+leads+to+progressive+behavioral+deficits%2C+bilateral+thalamic+calcification%2C+and+altered+brain+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Elimination of huntingtin in the adult mouse leads to progressive behavioral deficits, bilateral thalamic calcification, and altered brain iron homeostasis.</a> PLoS Genetics. 13 (7), 1006846(2017).</li>
<li>Dragatsis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+early+embryonic+deletion+of+huntingtin+from+pyramidal+neurons+on+the+development+and+long-term+survival+of+neurons+in+cerebral+cortex+and+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Effect of early embryonic deletion of huntingtin from pyramidal neurons on the development and long-term survival of neurons in cerebral cortex and striatum.</a> Neurobiology of Disease. 111, 102-117 (2018).</li>
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<li>Gutekunst, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+neuropil+aggregates+in+Huntington%27s+disease%3A+Relationship+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nuclear and neuropil aggregates in Huntington's disease: Relationship to neuropathology.</a> Journal of Neuroscience. 19 (7), 2522-2534 (1999).</li>
<li>Hodgson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+YAC+mouse+model+for+Huntington%27s+disease+with+full-length+mutant+huntingtin%2C+cytoplasmic+toxicity%2C+and+selective+striatal+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A YAC mouse model for Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration.</a> Neuron. 23 (1), 181-192 (1999).</li>
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<li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+conformation+of+polyglutamine+track+revealed+by+a+crystal+structure+of+huntingtin+N-terminal+region+with+insertion+of+three+histidine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Beta conformation of polyglutamine track revealed by a crystal structure of huntingtin N-terminal region with insertion of three histidine residues.</a> Prion. 7 (3), 221-228 (2013).</li>
<li>Hoop, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+exon+1+fibrils+feature+an+interdigitated+%CE%B2-hairpin-based+polyglutamine+core%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Huntingtin exon 1 fibrils feature an interdigitated β-hairpin-based polyglutamine core.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1546-1551 (2016).</li>
<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intein-based+strategy+for+the+production+of+tag-free+huntingtin+exon+1+proteins+enables+new+insights+into+the+polyglutamine+dependence+of+Httex1+aggregation+and+fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An intein-based strategy for the production of tag-free huntingtin exon 1 proteins enables new insights into the polyglutamine dependence of Httex1 aggregation and fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
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<li>Harding, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAP40+orchestrates+huntingtin+structure+for+1+differential+interaction+with+polyglutamine+2+expanded+exon+1%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">HAP40 orchestrates huntingtin structure for 1 differential interaction with polyglutamine 2 expanded exon 1.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+polyQ+expansion+does+not+alter+the+conformation+of+the+Huntingtin-HAP40+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Pathological polyQ expansion does not alter the conformation of the Huntingtin-HAP40 complex.</a> Structure. 29 (8), 804-809 (2021).</li>
<li>Colin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+phosphorylation+acts+as+a+molecular+switch+for+anterograde%2Fretrograde+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Huntingtin phosphorylation acts as a molecular switch for anterograde/retrograde transport in neurons.</a> EMBO Journal. 27 (15), 2124-2134 (2008).</li>
<li>Thompson, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK+phosphorylates+Huntingtin+and+targets+it+for+degradation+by+the+proteasome+and+lysosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome.</a> Journal of Cell Biology. 187 (7), 1083-1099 (2009).</li>
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<li>Michalek, M., Salnikov, E. S., Werten, S., Bechinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+interactions+of+the+amphipathic+amino+terminus+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane interactions of the amphipathic amino terminus of huntingtin.</a> Biochemistry. 52 (5), 847-858 (2013).</li>
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<li>Nissley, D. A., O'Brien, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+co-translational+processing+plays+a+role+in+huntington%27s+pathogenesis-A+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered co-translational processing plays a role in huntington's pathogenesis-A hypothesis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 54(2016).</li>
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</ol>

저자는이 기사의 내용과 이해 상충이 없음을 선언합니다.

여기에서는 면역분석 및 MS 분석 개발, 웨스턴 블롯 분석을 위한 대조군 및 구조-기능 연구를 위한 표준으로 사용하기 위해 적절한 순도와 균질성을 갖는 여러 FL HTT 단백질 구축물을 생성하기 위한 일시적인 형질감염, 발현 및 정제 방법을 설명합니다. 이 일시적인 발현 방법은 확장 가능하고 다목적이며, 사용자가 이전에 기술된 안정한 세포주 또는 바이러스 기반 방법을 사용하는 것보다 더 효율적으로 낮은 밀리그램 양의 FL HTT 변이체를 생성할 수 있게 한다 21,22,23,24. 일상적으로, 플라스미드가 구축되면 일시적 발현 방법을 사용하여 일주일 이내에 2L 규모의 단백질 생산에서 2-5mg의 고도로 정제된 FL HTT를 생성할 수 있으며, 일반적으로 세포 배양 리터당 1-2.5mg의 FL HTT를 얻을 수 있습니다.
여기에서 설명하는 일시적 발현 방법은 세포주를 확립하는데 오랜 시간이 소요되고 안정적인 세포주의 보관 및 유지에 어려움이 있는 등 안정적인 세포주 발현에 있어서 많은 장애를 극복한다. PEI는 또한 시중의 다른 형질주입 시약에 비해 상대적으로 저렴하여 대규모 형질주입을 경제적으로 실행 가능하게 만듭니다. 또한 프로토콜에는 한계가 있습니다: 형질주입 효율은 주로 플라스미드의 품질, 최적의 세포 성장 및 PEI가 얼마나 잘 저장되고 준비되는지에 달려 있습니다. 작업자는 단백질 수율의 급격한 감소를 피하기 위해 이러한 중요한 단계에서 특별한 주의를 기울이고 품질 관리를 수행해야 합니다. 프로토콜에 사용되는 Anti-FLAG 수지는 또한 상대적으로 고가이며, 여러 정제 및 재생 후에 FL HTT의 감소된 포획을 나타낸다. 일부 연구자들은 친화성 수지의 보다 강력한 재생을 허용하기 위해 다른 태그로 전환하는 것이 더 실용적이라는 것을 알게 될 수 있습니다.
다양한 세포주 및 발현 조건을 시험하여 FL HTT 발현 수준을 최적화하였다. HEK293 세포는 단백질의 높은 발현과 현탁 배양 형식에서의 취급 용이성으로 인해 FL HTT의 발현을 위해 선택되었으며, 이 방법은 셰이커 또는 바이오리액터에서 대규모 발현에 적합합니다. 더 높은 FL HTT 단백질 발현 수준은 37°C의 통상적인 온도를 사용하는 대신 32°C와 같은 더 낮은 배양 온도에서 달성될 수 있다. 낮은 온도는 단백질 합성을 늦추고 FL HTT40의 올바른 폴딩을 촉진할 수 있습니다. 그러나, 이러한 현상은 FL HTT 또는 시험된 세포주에 특이적이지 않다. 감소된 형질감염 후 온도는 CHO 세포에서 약제학적 단백질 발현에 널리 사용되어 왔다. 비록 그 메카니즘이 완전히 이해되지는 않았지만, 저온은 G1 단계에서 세포 주기를 정지시키고 세포 에너지를 단백질 생산으로 전환시키는 것으로 생각된다41.
포유동물 세포로부터 정제된 전장 HTT는 샤페론 Hsp7024와 함께 공동 용리되고, Mg-ATP 세척 단계는 Hsp70 단백질을 제거할 수 있다. 흥미롭게도, 공동-용출된 Hsp70은 곤충 세포 발현 시스템21,22,23으로부터 정제된 FL HTT에서 관찰되지 않는다. 이는 포유동물 및 곤충 세포에서 FL HTT의 과발현에 대한 FL HTT의 PTMs 또는 열 쇼크 단백질 반응의 차이를 반영할 수 있다. 재조합 단백질에서 Hsp70이 제거되면 FL HTT의 단량체 형태를 안정화하기 위해 CHAPS 또는 DDM과 같은 비이온성 세제가 필요합니다.
FL HTT 변이체의 올리고머화 상태는 블루 네이티브 PAGE 및 SEC-MALS를 사용하여 분석하였다. 이량체 및 고차 올리고머 HTT의 작은 부분은 Blue Native PAGE 또는 SEC-MALS로 분석할 때 존재했습니다. 참고로, FL HTT에 의해 형성된 고차 올리고머는 polyQ 길이와 상관관계가 없는 것으로 보이며, Exon1 결실 돌연변이체조차도 유사한 올리고머-이량체-단량체 비율을 나타낸다. 이들 구축물 사이의 올리고머 함량의 실제 변동은 각 배치의 생산 및 취급에서의 사소한 차이 때문일 수 있다. HTT Exon140,41에 의해 형성된 응집체 및 원섬유와는 대조적으로, FL HTT의 고차 올리고머는 용해성을 유지했으며 SEC 및 Native PAGE에 의해 분석될 수 있었다.
정제된 단량체 FL HTT는 단지 비교적 안정하다. 4°C에서 장기간 보관, 실온에서 짧은 배양 또는 1mg/mL > 농도는 이러한 조건에서 눈에 띄는 침전이 관찰되지 않더라도 모두 단량체 FL HTT를 이량체 및 고차 올리고머 형태로 변환합니다. ≤1 mg/mL로 유지된 정제된 단량체 FL HTT는 이전에 기술된 바와 같이 저장 완충액 (50 mM 트리스, pH 8.0, 500 mM NaCl, 5% v/v 글리세롤, 0.5% w/v CHAPS, 및 5 mM DTT) 중에서 -80°C에서 비교적 안정하게 유지되었다24. 이러한 방식으로 제조 및 저장된 FL HTT의 최대 6회의 동결-해동 주기는 SEC-MALS에 의해 더 높은 올리고머 상태로의 약간의 이동이 관찰되었지만 단백질의 가시적인 침전을 일으키지 않았습니다(보충 그림 S2). 샘플은 또한 반복된 동결-해동 주기 후에 SDS PAGE에 의해 분석되었다. 눈에 보이는 침전물은 관찰되지 않았다. SDS-PAGE에서 응집체 또는 추가 분해 생성물이 보이지 않았습니다 (보충 그림 S3). 정제된 FL HTT의 장기 안정성은 아직 조사 중입니다. 결정적인 장기 데이터가 없는 경우 정제된 FL HTT를 -80°C에서 6개월 이상 보관하지 않는 것이 좋습니다.
고품질의 재조합 FL HTT 단백질 변이체와 이를 생산하는 방법은 HD 연구 커뮤니티에서 수요가 높습니다. 이러한 단백질은 면역 분석 및 MS 분석 표준, 구조 연구 및 새로운 FL HTT 특이적 분석의 개발로 사용됩니다. 여기에 설명된 대규모 과도 발현 방법은 >95% 순도의 밀리그램 양의 FL HTT 변이체를 일관되게 생산하여 HTT 연구에 필수적인 도구를 제공합니다. HD 연구를 지원하기 위해 수십 밀리그램의 고도로 정제된 FL HTT polyQ 변이체 및 기타 돌연변이의 생산이 일상화되었습니다.

헌팅턴병(HD)은 주로 불안정하고 비자발적 운동 운동뿐만 아니라 성격 변화 및 무관심과 같은 인지 및 정신과적 변화를 특징으로 하는 희귀 신경퇴행성 질환입니다1,2. 헌팅턴병은 헌팅틴 유전자(HTT)의 엑손 1에 위치한 CAG 반복 관을 35회 이상으로 확장하는 것과 관련이 있으며, 더 많은 수의 CAG 반복은 질병의 조기 발병과 관련이 있습니다3,4. 헌팅틴 단백질 (HTT) 인 HTT의 번역 산물은 신경 세포 생존 능력 및 뇌 발달 5,6,7,8,9와 관련이 있습니다.
HTT는 광범위한 세포 과정, 소포 수송, 세포 분열, 섬모 생성 및 자가포식10,11에 참여하는 것으로 보고된 스캐폴딩 단백질입니다. 그러나 HD의 분자 병인은 완전히 명확하지 않으며 polyQ 확장 mHTT의 병리학 적 영향을 매개하는 주요 단백질 상호 작용자의 식별이 부족합니다. 일부 연구는 HD 환자 및 질병의 동물 모델의 뉴런 및 아교세포에서 HTT 응집체가 확인되었기 때문에 확장된 HTT 단백질의 올리고머화 성향에 의해 구동되는 mHTT의 독성 기능의 이득을 시사합니다.12,13,14,15,16,17 . FL HTT 및 mHTT 변이체의 기능과 구조에 대한 조사를 촉진하고 연구자에게 분석 개발을 위한 고품질 단백질 표준물질을 공급하려면 균질한 재조합 단백질의 강력하고 확장 가능한 공급이 필요합니다.
FL HTT는 크기 (aa 1-3,144, polyQ 길이 Q23에 따른 번호 매기기), 단백질 분해 불안정성 및 응집 성향으로 인해 가용성 단백질로 발현 및 분리하기가 어렵다는 것이 입증되었습니다. 이전에는 HTT의 엑손 1 영역(aa2-90)을 대장균18,19,20에서 단백질의 용해도를 증가시킬 수 있는 다양한 태그를 사용하여 대규모로 발현 및 정제하였다. FL HTT는 바쿨로바이러스21,22를 사용하는 곤충 세포 발현 시스템에서 최초로 발현 및 정제되었으며, 화학적으로 가교결합된 FL Q23-HTT 및 Q78-HTT의 저분해능 30Å 전자 현미경(EM) 구조가 보고되었다(23). HTT 구조의 조사는 안정한 세포주 또는 아데노바이러스 발현 시스템24를 사용하여 인간 세포에서 천연 번역후 변형(PTM)을 갖는 FL Q17, Q46 및 Q128-HTT의 생산이 달성되었을 때 더욱 발전되었습니다. 이러한 연구는 정제된 HTT가 주로 단량체 상태로 존재하지만 고차 올리고머 및 응집체를 형성하는 경향이 있음을 시사합니다.
고도로 확장된 polyQ 영역을 갖는 FL Q128-HTT의 분석적 초원심분리는 비확장 polyQ 영역24를 갖는 단백질보다 더 많은 올리고머 및 응집체 분획을 제공하였다. 안정한 세포주를 사용하여, 상호작용 파트너 HAP40과의 동시 발현에 의해 FL HTT를 안정화시키는 전략이 성공적으로 적응되었다. FL HTT 및 HAP40 복합체의 Cryo-EM 구조는 정제된 단백질 복합체(PDB:6EZ8)25를 사용하여 평균 4Å 분해능으로 해결되었습니다. 이러한 공동발현 전략은 바쿨로바이러스 시스템에 성공적으로 적응되었고, 상이한 polyQ 길이를 갖는 일련의 고품질 HTT 변이체가 곤충 세포로부터 발현 및 정제되었다(26). 그 이후로, 가변 polyQ 길이와 HAP40 및 더 높은 분해능 구조를 갖는 HTT 복합체의 더 많은 Cryo-EM 구조가 해결되어 단백질 데이터베이스27,28(PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O)에 침착되었습니다.
FL HTT의 빠른 과도 발현을 위해 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 HEK293 세포에서 형질감염 및 발현 방법을 최적화했습니다. 원리 증명으로서, 23개의 글루타민(FL Q23-HTT)을 함유하는 FL HTT 변이체를 먼저 정제하고, 앞서 기술된 정제 방법의 변형을 사용하여 특성화하였다(24). 이 일시적 형질주입 방법은 편리하고 매우 효율적이며 확장 가능합니다. 보고된 안정적인 세포주 방법에 필적하는 1-2mg/L의 수율로 정제된 HTT를 생산할 수 있습니다.24. 단백질이 인간 세포주에서 생산되기 때문에, 생산된 HTT는 질량 분광분석 단백질체학 분석 11,29,30,31을 받을 때 천연 인간 PTM을 가질 가능성이 더 높다. FL HTT의 FL Q48-HTT, FL Q73-HTT 및 엑손1-결실(ΔExon1-HTT) 변이체의 밀리그램 양이 생산되었으며, 이는 일시적인 발현 방법이 생산을 위한 안정적인 세포주를 확립하는 데 필요한 시간 소모적인 노력에 의존하지 않고 HTT의 대체 변이체를 신속하게 생산하는 데 특히 유용하다는 것을 입증했습니다.
다음 프로토콜은 2L 세포 배양으로부터 FL Q23-HTT를 생산하기 위해 세포 배양, 형질감염, 단백질 정제 및 정제 후 단백질 특성화를 위해 이들 저자의 실험실에서 사용되는 표준 방법을 예시한다. 이 프로토콜은 더 큰 배양으로 확장하거나 다른 HTT 변이체를 정제하도록 조정할 수 있습니다. FL HTT의 최대 10L 세포 배양과 HTT 및 HTT 동족체의 다양한 부위 또는 절단 돌연변이가 동일한 프로토콜을 사용하여 실험실에서 성공적으로 수행되었습니다. 정제된 FL HTT는 이량체 및 고차 올리고머와 함께 높은 비율의 단량체를 함유한다. 생성된 변이체(Q23, Q48, Q73 및 결실된 Exon1) 간에 동일한 응집체 프로파일이 관찰됩니다. 적절한 주의를 기울이지 않을 때 응집이 발생할 수 있으므로 단백질 취급을 위한 최상의 조건을 식별하기 위해 제형 및 동결-해동 안정성 연구가 수행되었습니다. Blue Native PAGE 및 SEC/MALS-RI와 같은 방법도 품질 관리 프로세스의 일부로 HTT 올리고머 함량을 분석하는 방법에 대해 설명합니다. HD 연구 커뮤니티에 혜택을 주기 위해 이 연구에서 설명된 플라스미드 및 HTT 단백질도 Coriell Institute(www.coriell.org/1/CHDI)의 HD 커뮤니티 저장소에 기탁됩니다.

<table><tbody><tr><td>100 kDa 농축기-Amicon</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>프로토콜 섹션 번호-6.2.4</td></tr><tr><td>20x blue native PAGE running buffer</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td>프로토콜 섹션 번호-8.1</td></tr><tr><td>20x TBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI28358</td><td>프로토콜 섹션 번호-5.1</td></tr><tr><td>4x blue native PAGE 샘플 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>BN2003</td><td>프로토콜 섹션 번호-8.3</td></tr><tr><td>4x LDS 로딩 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>프로토콜 섹션 번호-5.3</td></tr><tr><td>5 L Erlenmeyer 플라스크</td><td>Corning</td><td>431685</td><td>프로토콜 섹션 번호-4.2</td></tr><tr><td>아가로스 젤 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>프로토콜 섹션 번호-2.2</td></tr><tr><td>안티-응집제</td><td>Thermo Fisher</td><td>0010057AE</td><td>프로토콜 섹션 번호-4.8</td></tr><tr><td>anti-FLAG M2 친화력 젤</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>프로토콜 섹션 번호-6.1.1</td></tr><tr><td>anti-FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td>프로토콜 섹션 번호-5.7</td></tr><tr><td>안티 폼-엑셀 안티 폼</td><td>Sigma</td><td>59920C-1B</td><td>프로토콜 섹션 번호-4.8</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A6419</td><td>프로토콜 섹션 번호-6.1.4.4</td></tr><tr><td>BEH 450 SEC</td><td>Waters</td><td>186006851</td><td>2.5 & 마이크로; m x 4.6 mm x 150 mm 프로토콜 섹션 번호-7.3</td></tr><tr><td>blue native PAGE 5% G-250 sample additive</td><td>Invitrogen</td><td>BN2004</td><td>프로토콜 섹션 번호-8.3</td></tr><tr><td>carbenicillin</td><td>Thermo Fisher</td><td>10177012</td><td>프로토콜 섹션 번호-2.5</td></tr><tr><td>원심분리기 - Sorvall Lynx 6000</td><td>Thermo Fisher</td><td>75006590</td><td>프로토콜 섹션 번호-6.1.3</td></tr><tr><td>세포 계수기 - ViCELL</td><td>BECKMAN COULTER</td><td></td><td>프로토콜 섹션 번호-4.3</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Anatrace</td><td>C316S</td><td>프로토콜 섹션 번호-6.1.4.6</td></tr><tr><td>유능한 대장균 세포-TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td>프로토콜 섹션 번호-2.4</td></tr><tr><td>digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>프로토콜 섹션 번호-5.1</td></tr><tr><td>시차 굴절률 검출기</td><td>Wyatt</td><td></td><td>프로토콜 섹션 번호-7.1</td></tr><tr><td>DYKDDDDK 펩타이드</td><td>Genscript</td><td></td><td>펩타이드 합성 서비스 프로토콜 섹션 번호-6.1.4.6</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td><td>프로토콜 섹션 번호-5.1</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Giga Kit</td><td>Qiagen</td><td>12391</td><td>프로토콜 섹션 번호-3.3</td></tr><tr><td>Endotoxin free water</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.03</td><td>프로토콜 섹션 번호-4.1</td></tr><tr><td>내독소 정량화 키트-CRL Endosafe Nexgen-PTS 검출 시스템</td><td>Charles River</td><td>PTS150K</td><td>프로토콜 섹션 번호-3.4</td></tr><tr><td>고정각 로터 A23-6x100 로터</td><td>Thermo Fisher</td><td>75003006</td><td>프로토콜 섹션 번호-6.1.3</td></tr><tr><td>FPLC 소프트웨어-Unicorn 6.2</td><td>Cytiva</td><td></td><td>프로토콜 섹션 번호-6.1.4</td></tr><tr><td>유전자 합성</td><td>Genscript</td><td></td><td>유전자 합성 서비스 프로토콜 섹션 번호-1.2</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific Glycerol (Certified ACS)</td><td>G33-4</td><td>프로토콜 섹션 번호-5.6</td></tr><tr><td>성장 매체-EXPI293 발현 배지</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1435102</td><td>프로토콜 섹션 번호-4.2</td></tr><tr><td>HEK293 세포</td><td>Thermo Fisher</td><td>R79007</td><td>프로토콜 섹션 번호-4</td></tr><tr><td>고전단 균질화기-미세유체화기</td><td>MicroFluidics</td><td>LM10</td><td>프로토콜 섹션 번호-6.1.3</td></tr><tr><td>HPLC - 1260 infinity II Bio-Insert HPLC</td><td>애질런트</td><td></td><td>프로토콜 섹션 번호-7.1</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LiCor</td><td></td><td>이미지 분석 소프트웨어 프로토콜 섹션 번호-5.1</td></tr><tr><td>MAB2166</td><td>Sigma</td><td>MAB2166</td><td>프로토콜 섹션 번호-5.7</td></tr><tr><td>MAB2168</td><td>EMD</td><td>MAB2168</td><td>프로토콜 섹션 번호-5.7</td></tr><tr><td>MAB3E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47757</td><td>프로토콜 섹션 번호-5.7</td></tr><tr><td>MAB4E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-7757</td><td>프로토콜 섹션 번호-5.7</td></tr><tr><td>MAB5490</td><td>Sigma</td><td>MAB5490</td><td>프로토콜 섹션 번호-5.7</td></tr><tr><td>MAB5492</td><td>Sigma</td><td>MAB5492</td><td>프로토콜 섹션 번호-5.7</td></tr><tr><td>MAB8A4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47759</td><td>프로토콜 섹션 번호-5.7</td></tr><tr><td>다중 각도 광 산란 검출기</td><td>Wyatt</td><td></td><td>프로토콜 섹션 번호-7.1</td></tr><tr><td>NativeMark 염색되지 않은 단백질 표준</td><td>Invitrogen</td><td>LC0725</td><td>프로토콜 섹션 번호-8.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>프로토콜 섹션 번호-5.6</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolab</td><td>R0131S</td><td>사용 가능한 Hi-Fi 버전 프로토콜 섹션 번호-2.2</td></tr><tr><td>NuPAGE 3&ndash; 8% Tris 아세테이트 겔</td><td>Invitrogen</td><td>EA0375PK2</td><td>프로토콜 섹션 번호-5.4</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LA0041</td><td>프로토콜 섹션 번호-5.4</td></tr><tr><td>PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td>프로토콜 섹션 번호-4.1</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td>프로토콜 섹션 번호-4.2</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.02</td><td>프로토콜 섹션 번호-4.5</td></tr><tr><td>플라스미드 miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>프로토콜 섹션 번호-2.6</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolab</td><td>R0560S</td><td>프로토콜 섹션 번호-2.2</td></tr><tr><td>프리캐스트 Bis-tris 겔-3-12% NativePAGE Novex Bis-tris 젤</td><td>Invitrogen</td><td>BN1003BOX</td><td>프로토콜 섹션 번호-8.4</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>GoldBio</td><td>GB-331-1</td><td>프로토콜 섹션 번호 -5.1</td></tr><tr><td>SEC-MALS 분석 소프트웨어 - Astra 7</td><td>Wyatt Technology</td><td></td><td>프로토콜 섹션 번호 -7.6</td></tr><tr><td>2 차 항체 -IRdye 800 CW 염소 안티 마우스 IgG</td><td>LiCor</td><td>926-32210</td><td>프로토콜 섹션 번호 -5.9</td></tr><tr><td>Superose 6 pg XK 16/70</td><td>Cytiva</td><td>90100042</td><td>프로토콜 섹션 번호 -6.2</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td>프로토콜 섹션 번호-5.6</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher</td><td>AAJ20605AP</td><td>프로토콜 섹션 번호-6.1.1</td></tr><tr><td>UV 분광계 - Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-8000-GL</td><td>프로토콜 섹션 번호-2.2</td></tr><tr><td>XK26/100</td><td>Cytiva</td><td>28988951</td><td>프로토콜 섹션 번호-6.1.1</td></tr></tbody></table>

일시적 발현 시스템을 사용한 포유류 세포에서 전장 인간 헌팅틴 변이체의 효율적이고 확장 가능한 생산

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

전장 헌팅틴 (FL HTT)은 대략 350 kDa의 질량을 갖는 큰 (aa 1-3,144), 유비쿼터스 발현, 폴리글루타민 (polyQ) 함유 단백질이다. FL HTT의 세포 기능이 완전히 이해되지는 않았지만 ~36회 반복 이상의 polyQ 관의 돌연변이 확장은 헌팅턴병(HD)과 관련이 있으며 polyQ 길이는 대략 발병 연령과 관련이 있습니다. 돌연변이 HTT(mHTT)의 기능에 대한 구조의 영향을 더 잘 이해하려면 다량의 단백질이 필요합니다. 포유동물 세포에서 FL HTT의 서브밀리그램 생산은 독시사이클린-유도성 안정한 세포주 발현을 사용하여 달성하였다. 그러나, 안정한 세포주로부터의 단백질 생산은 일시적인 형질감염 방법으로 극복할 수 있는 한계를 갖는다. 
이 논문은 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용한 일시적 형질감염에 의한 코돈 최적화 플라스미드로부터 FL HTT 및 그 변이체의 저밀리그램 소량 생산을 위한 강력한 방법을 제시합니다. 이 방법은 확장 가능하고(>10mg) 고도로 정제된 FL HTT의 세포 배양 1-2mg/L를 지속적으로 산출합니다. 이전 보고와 일치하여, FL HTT의 정제된 용액 상태는 매우 동적인 것으로 밝혀졌다; 단백질은 이량 체 및 고차 올리고머를 형성하는 경향이있다. 올리고머 형성을 늦추는 열쇠는 크기 배제 크로마토그래피 중에 이량체 및 고차 올리고머 분획에서 단량체 분획을 분리하기 위해 신속하게 작업하는 것입니다. 
다각도 광산란(SEC-MALS)을 사용한 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제된 HTT의 이량체 및 고차 올리고머 함량을 분석했습니다. FL HTT polyQ 길이 (Q23, Q48, 및 Q73)와 올리고머 함량 사이에는 상관관계가 관찰되지 않았다. exon1-결실된 작제물 (aa 91-3,144)은 FL HTT (aa 1-3,144)에 필적하는 올리고머화 성향을 나타내었다. SEC/MALS-굴절률(RI), 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 웨스턴 블롯, 네이티브 PAGE 및 블루 네이티브 PAGE에 의한 생산, 정제 및 특성화 방법이 본원에 기재되어 있다.

자사는 HEK293 세포에서 구조체 설계, 일시적 형질감염, 전장 인간 헌팅틴 단백질 변이체의 발현 및 정제를 포괄하는 확장 가능한 프로토콜을 제공합니다.

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

이 프로토콜은 낮은 밀리그램 규모의 전장 huntingin 변이체의 생산을 위해 개발되었습니다. HD 연구자에게 필수적인 일관된 고품질 단백질을 제공합니다. 이 절차를 시연하는 것은 쿠리아 연구소의 연구 과학자 인 마이클 해리스 (Michael Harris)가 될 것입니다.1 리터의 내 독소 자유 물에 1 그램의 폴리에틸렌 이민 25K를 첨가하여 시작하고 잘 저어줍니다. 100 밀리몰 염산을 사용하여 pH를 2.0으로 조정하고 모든 폴리에틸렌 이민이 용해 될 때까지 저어줍니다. 그런 다음 100 밀리몰 수산화 나트륨 용액을 사용하여 pH를 7.0으로 조정하고 0.2 마이크로 미터 필터를 통해 용액을 통과시킵니다.여과 된 용액의 분취량을 만들어 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 293 세포를 섭씨 37도, 90 RPM, 5 % 이산화탄소의 가습 셰이커 인큐베이터에서 페니실린 스트렙토 마이신이 보충 된 성장 배지에서 18-24 시간 동안 전파합니다. 형질감염 1일 전에, 세포를 5리터 삼각 플라스크에서 2 리터의 성장 배지 중의 6 밀리리터당 약 1.2 x 10의 밀도로 세포를 희석하고, 18 내지 24시간 동안 배양한다.배양이 끝나면 제조업체의 지침에 따라 자동 세포 카운터를 사용하여 세포 밀도와 생존율을 측정합니다. 형질감염에 필요한 폴리에틸렌이민 및 플라스미드의 양을 계산한 후, 폴리에틸렌이민 및 플라스미드를 PBS 100ml에 개별적으로 희석하고 실온에서 5분 동안 배양한다. 이어서, 희석된 플라스미드와 폴리에틸렌이민을 부드럽게 소용돌이치면서 혼합하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.혼합물을 세포 배양에 추가하고 부드럽게 소용돌이치며 혼합합니다. 이제 세포가 24 시간 동안 자라도록하십시오. 다음날, 부티르산 나트륨 용액을 2 밀리몰 응집 방지 및 소포제의 최종 농도에 1 : 1, 000 부피비로 첨가하여 배양하고 가습 셰이커 인큐베이터에서 48 시간 동안 세포를 배양한다.세포 생존율 및 밀도를 측정한 후, 세포를 2, 000 G에서 30분 동안 원심분리하여 수확하고, 정제 전에 영하 80°C에서 세포 펠렛을 보관하였다. FPLC를 사용한 안티 FLAG 정제의 경우, 버퍼 A를 사용하여 분당 4 밀리리터의 유속으로 빈 컬럼에 12-25 밀리리터의 안티 FLAG 수지를 포장하고 플런저의 높이를 조정하여 플런저 끝과 수지 베드 사이의 간격을 제거합니다. 다음으로, 해동 된 세포 펠릿을 냉장 용해 완충액에 현탁시키고 세포 현탁액을 평방 인치당 1, 000 파운드의 압력에서 고전단 균질 기를 통해 한 번 통과시킨다.호환 가능한 고정각 로터가 장착 된 원심 분리기를 사용하여 20, 000 G에서 1 시간 동안 용해물을 정화하십시오. 분석법 창에서 FPLC를 프로그래밍하고, 샘플 펌프를 통해 정화된 용해물을 로드하고, 텍스트 원고에 설명된 대로 원하는 컬럼 부피의 버퍼 A, B, C, D 및 용리 버퍼로 컬럼을 세척합니다. 실행이 완료되면 SDS-PAGE를 사용하여 10 마이크로 리터의 피크 분획을 분석합니다.피크 분획을 원하는 순도와 결합하고 추가 SDS-PAGE 분석을 위해 결합된 용리액을 약 50마이크로리터 저장합니다. FPLC를 사용하여 SEC 컬럼의 평형을 시작하고 50밀리리터 수퍼루프를 통해 FLAG 용출액 방지액을 로드합니다. SEC 버퍼를 실행한 후 섭씨 4도에서 밤새 SEC 분리가 발생하도록 합니다.용리 프로파일을 표준 HTT 용리 프로파일과 비교하여 단량체, 이량체 및 고차 올리고머 피크를 구별합니다. SEC 컬럼의 용리 프로파일에 기초하여 단량체 HTT 분획을 풀링하고, 원하는 경우 고차 올리고머 및 이량체 HTT 분획을 별도로 풀링한다. 풀링된 HTT 단백질을 섭씨 4도에서 100킬로달톤 원심 농축기를 사용하여 농축합니다.단백질 농도를 계산한 후, 정제된 HTT 단백질을 100 마이크로리터 미만의 분취량을 극저온 안전 마이크로원심분리 튜브에 넣는다. 액체 질소를 사용하여 분취량을 급속 동결하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. UV 검출기, 다각 광산란 검출기, 시차 굴절률 검출기와 결합된 HPLC 시스템에서 섭씨 4도에서 모든 분석 SEC-MALS를 수행하고 HTT의 굴절률 증분으로 0.185를 사용합니다.여과된 HPLC 등급의 물로 펌프와 검출기를 퍼지하고 UHPLC 컬럼을 시스템에 연결합니다. 컬럼을 여과된 물로 평형을 이룬 다음 모든 검출기 신호가 기준선에 도달할 때까지 SEC-MALS 버퍼를 사용합니다. 주입 당 15 분 동안 분당 0.3 밀리리터의 유속으로 2 마이크로 리터의 BSA 용액을 주입하십시오.데이터 품질을 검사하고, BSA 프로파일을 기반으로 정규화, 피크 정렬 및 대역 확장 보정을 수행하고, 다음 HTT 샘플 실행을 위한 템플릿을 생성합니다. 플로트를 사용하여 실온의 수조에서 FL Q23-HTT 샘플의 바이알을 신속하게 해동시킨다. 0.1마이크로미터 스핀 필터를 통해 HTT를 필터링합니다.2-4 마이크로 리터의 HTT 샘플을 주입하고 분당 0.3 밀리리터의 유속으로 섭씨 4도에서 15 분 동안 실행합니다. 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 크로마토그래피 및 광산란 데이터를 분석하고 Zimm 플롯을 생성하여 각 피크에 대한 중량 평균 분자량을 결정합니다. 본 연구에서는 2단계 컬럼 공정을 사용하여 HTT에 대해 95% 이상의 순도를 얻었으며 주요 오염 물질은 샤페론 Hsp70이었으며, 이는 FLAG 친화성 방지 정제 단계 동안 염화마그네슘 및 ATP로 광범위하게 세척하여 제거되었습니다. FL HTT의 과발현은 단백질의 단편화를 초래할 수 있지만 350킬로달톤의 정확한 분자량을 가진 단일 밴드로 분해된 방법으로 생성된 FL Q23-HTT는 없음을 나타냅니다. 조각화.항체와 FL Q23-HTT의 반응 후 웨스턴 블롯 분석은 임의의 추가적인 단편-관련 밴드가 관찰되지 않았기 때문에, 단백질이 유의한 검출 가능한 절단없이 단리되었음을 입증하였다. FL HTT poly-Q 길이 분산, Q23, Q48 및 Q73은 웨스턴 블롯에서 예상대로 반응하여 Q 길이 증가와 상관관계가 있는 poly-Q-지향 모노클로날 항체 MW1에 대해 점진적으로 더 강한 신호를 보여줍니다. 테스트된 HPLC 컬럼 중 SEC 컬럼은 몰 질량을 구별할 수 있도록 HTT 단량체와 이량체 사이에 충분한 분리능을 보여주었습니다.SEC로부터 정제된 FL HTT는 올리고머화 상태에 상응하는 다수의 밴드를 나타냈는데, 이는 겔 내에서 이동하는 동안 고차 올리고머의 형성에 기여하는 몇몇 소수성 패치의 존재 때문일 수 있다. 정제된 HTT는 각각 HTT의 단량체, 이량체 및 삼량체 종을 나타낼 가능성이 있는 643, 927 및 1, 070킬로달톤의 추정 분자량을 갖는 청색 천연 PAGE 상에 3개의 주요 밴드를 나타내었다. 정제된 헌팅틴의 적절한 취급은 가용성 응집체에서 고차 올리고머 생성을 방지하는 데 필수적입니다.최종 사용자는 급속 냉동 전에 샘플을 사전 냉각된 튜브에 분주하기 위해 신속하게 작업해야 합니다. 장기 안정성 테스트는 섭씨 영하 80도에서 장기간 보관된 샘플에 대해 수행할 수 있습니다. 반복 HPLC SEC-MALS 분석을 통해 샘플의 단량체 함량에 변화가 있는지 확인할 수 있습니다.

efficient-scalable-production-full-length-human-huntingtin-variants

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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테트라싸이클린-inducible (Tet-에서) shRNA 또는 cDNA 표현과 안정적인 인간 세포 라인의 생성

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소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

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이것은 분비된 당화(glycosylated mammalian protein)의 생산 및 X선 결정학 및 기타 생물물리학 연구를 위한 균질한 단백질의 충분한 수율을 가진 후속 1단계 정제를 위한 빠르고 비용 효율적인 프로토콜입니다.

효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

적절한 번역 후 변형을 통한 진핵 단백질의 실험실 규모 생산은 상당한 장벽을 나타냅니다. 다음은 포유류 발현 시스템을 사용하여 단백질 발현을 위한 신속한 확립 및 전환을 제공하는 강력한 프로토콜입니다. 이 시스템은 선택적 아미노산, 단백질의 선택적 표지 및 글라이칸 조성의 저분자 조절제를 지원합니다.

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네이티브, 태그 Huntingtin Exon1 모노 머와 스모 융합 전략을 사용 하 여 소의 생성

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뉴런의 세포 인신 매매 연구를 위한 튜브에서 정제하고 직접 모노 바이오티니레이트 BDNF를 정화하는 향상된 프로토콜

여기에서 현탁액 HEK293 셀 기반 AAV 생산 프로토콜이 제시되어 상용 공급업체에서 연구 목적으로 사용할 수 있는 구성 요소를 사용하여 벡터 생산에 필요한 시간과 노동력을 줄일 수 있습니다.

HEK293 부유 세포를 사용한 고수율 Adeno 관련 벡터 배치 생산

학습하세요 HEK293 세포에서 전장 헌팅틴 단백질 변이체를 효율적으로 생산하고 정제하는 방법을. 이 프로토콜은 헌팅턴병 연구에 필수적인 고순도 단백질 확보를 가능하게 합니다.

일시적 발현 시스템을 사용한 포유류 세포에서 전장 인간 헌팅틴 변이체의 효율적이고 확장 가능한 생산

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