HEK293T 세포에서 결합 및 엔도사이토시스를 추적하기 위한 양자점 접합 SARS-CoV-2 스파이크 삼량체의 고처리량 공초점 이미징

우리는 세포 바이러스 감염의 첫 번째 단계로 스파이크 매개 세포 인식 및 진입으로 다른 바이러스에 적용 할 수있는 SARS COVID 2를위한 플랫폼 기술을 수립했습니다. 양자점은 밝고 안정적이며 그 표면은 다양한 세포 응용을 위해 기능화 될 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 스파이크 내재화를 시각화하고 세포로 측정 할 수 있습니다.

0.1 % BSA를 준비하십시오. 130 마이크로 리터의 7.5 % BSA를 10 밀리리터의 이미징 매체에 혼합하십시오. 6.1 내지 3개의 연속 희석 및 삼중의 경우 14.26 마이크로리터의 QD 스파이크를 0.1%BSA의 285.74 마이크로리터에 첨가하여 20나노몰의 최고 농도를 만든다.

그런 다음 20 나노 몰 또는 QD 스파이크 100 마이크로 리터를 0.1 % BSA의 200 마이크로 리터에 추가하여 6.67 나노 몰 QD 스파이크의 두 번째 망상을 만듭니다. 다중 채널 흡입기로 각 웰에서 사용 된 모든 미디어를 제거하고 웰 당 100 마이크로 리터의 이미징 미디어가있는 다중 채널 피펫으로 한 번 씻은 다음 이미징 미디어 100 마이크로 리터를 흡인하십시오. 웰 당 50 마이크로리터의 QD 스파이크 용액을 다시 첨가하고, 플레이트를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5% 이산화탄소로 3시간 동안 인큐베이션한다.

보호 장비를 착용하고 멸균 된 바이오 안전 캐비닛 내부에 4 % PFA 및 0.1 % PSA 이미징 미디어를 준비하고 각 웰에서 50 마이크로 리터의 QD 스파이크를 흡인하고 웰 당 4 % PFA 100 마이크로 리터를 자동 다중 채널 피펫으로 추가하여 웰이 건조되지 않도록하십시오. 실온에서 15분 동안 배양한 다음, PBS로 3회 세척한 후, PBS에 5밀리미터 원액을 1000 내지 1000으로 희석하여 딥 레드 핵 염료를 제조하고, PBS를 흡인하고, 웰 당 희석된 핵 염료 50 마이크로리터를 다시 첨가한다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 세척하고, 플레이트를 이미지화하거나 추후 이미징을 위해 플레이트 실러를 사용하여 밀봉한다.

접시를 섭씨 네 도에 보관하십시오. 이미징 플랫폼용 소프트웨어를 시작합니다. 이미징 플랫폼에 로그인한 후 96 벽면 투명 바닥 이미징 플레이트로서 플레이트 타입을 선택하여 새로운 획득 프로토콜을 생성하고, 광학 모드를 선택하여 초점과 배율을 40배 수침수로 한 후, 비닝을 하나로 선택한다.

고대비와 같은 디지털 얼굴 대비 모드를 선택하여 잘 정의된 세포체를 생성합니다. 스냅샷을 찍어 이 제목이 이미지 윈도우에 표시된 대로 적절한지 확인하고, ACE2-GFP 세포주와 함께 사용할 적합 C 채널을 선택하여 셀 내에서 ACE2 트래피킹을 시각화합니다. 사용자 정의 QD 채널을 만들려면 삼각형 드롭 다운 메뉴를 선택하고 608 나노 미터 범위에서 방출되는 405 나노 미터 범위의 여기를 선택하고 강력한 세포질 QD 신호가있는 우물을 선택하여 노출 시간, 레이저 전력 및 Z 높이 위치를 설정하십시오.

기본 높이가 원하는 초점 평면에서 셀의 이미지를 생성하는지 확인합니다. Z 위치는 원형질막에 대한 Z 위치보다 엔도사이토오스 누자에 대해 더 낮을 것이다. 일반적으로 배경 신호보다 3배 이상 큰 회색 레벨의 밝은 이미지를 생성하는 노출 시간을 100밀리초에서 300밀리초 사이로 선택합니다.

20 나노 몰에서 회색 수준은 약 6, 000 원자 단위이어야하며 노출 시간은 200 밀리 초이고 레이저 파워는 80 %입니다. 각 채널의 스냅 샷 기능으로 생성 된 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 강도 표시를 선택한 다음 관심있는 객체 또는 배경을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 해당 픽셀의 회색 레벨을 확인하고 레이저 파워를 조정하여 관심있는 물체의 강도를 미세 조정하십시오. 획득 프로토콜을 저장하고 실험을 실행하도록 전환하고 플레이트 이름을 입력하고 실험을 실행하십시오.

QD 및 ACE2 둘 다의 전좌는 형광 현미경 및 ACE2-GFP 발현 세포주를 사용하여 시각화하였다. 이미지 세분화 및 후속 분석을 수행하여 스팟 카운트와 같은 관련 파라미터를 추출하였다. 첫째, 핵을 핵 마커 채널로부터 분할하여 ROI 집단을 생성하였다.

그런 다음 ACE2-GFP 채널을 사용하여 세그먼트화하여 셀을 윤곽을 그리는 ROI 영역. 마지막으로, QD 608 스파이크 스폿은 셀 ROI 영역으로부터 세그먼트화되었고, 내부화된 QD 및 ACE2 신호는 강한 공동 국재화를 보였다. 여섯 가지 상이한 농도의 QD 스파이크를 사용한 농도 반응 실험을 HEK 293T 세포에서 수행하였다.

QD의 광학 농도를 결정할 때 QDS는 2.22 나노 몰만큼 낮게 사용할 수 있지만 강력한 반응을 보장하기 위해 10 나노 몰 이상의 농도를 사용하는 것이 좋습니다. QD에 컨쥬게이션 동안 단백질 응집이 발생할 수 있다. 응집체는 밝은 응집된 침전물 및 HEK 293T 세포로서 QD 용액에서 발견되었고, QDs는 세포에 첨가되기 전에 마이크로리터당 30 마이크로그램에서 시작하는 중화된 항체와 함께 인큐베이션되었고, 이들 항체는 결합 내재화를 차단하고 QD만으로 처리된 세포에 비해 스팟 카운트의 감소를 야기하였다.

이 에세이는 또한 높은 처리량 스크리닝, 중화 항체의 리드 평가에 사용될 수 있으며, 바이러스 진입을 차단하기 위해 말장난 항 바이러스제를 확인하고 새로 떠오르는 변종을 연구하기 위해 적응 될 수 있습니다.