Name: HEK293T 세포에서 결합 및 엔도사이토시스를 추적하기 위한 양자점 접합 SARS-CoV-2 스파이크 삼량체의 고처리량 공초점 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 학습하세요 양자점 접합 SARS-CoV-2 스파이크 삼량체를 이용한 고처리량 공초점 이미징으로 HEK293T 세포에서 바이러스 결합 및 엔도사이토시스를 추적하는 방법. 이 기술은 세포 감염 메커니즘 연구와 항바이러스 스크리닝에 활용됩니다.

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이 연구는 NIH 국립 번역 과학 발전 센터의 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 해군 연구소는 내부 나노 과학 연구소를 통해 자금을 제공했습니다. 시약 준비는 NRL COVID-19 기본 기금을 통해 지원되었습니다.

본 연구에 사용된 HEK293T 세포주는 불멸화 세포주이다. 이 연구에서는 인간 또는 동물 피험자가 사용되지 않았다.
1. 세포 배양 및 파종
<ol><li>멸균 생물 안전 캐비닛 내부에는 개인 보호 장비 (실험실 장갑, 실험실 코트 및 안전 안경 포함)를 착용하고 Dulbecco의 변형 이글 배지 (DMEM)에 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S) 및 250 μg / mL G418을 보충하여 세포 배양 배지를 준비하십시오.<ol>
<li>500mL의 배지에 DMEM 443.75mL, FBS 50mL, P/S 5mL, G418 1.25mL를 첨가합니다.</li>
		<li>0.2 μm 필터 플라스크를 통해 여과하고 박테리아 오염을 피하기 위해 멸균성을 유지한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>멸균된 생물안전 캐비닛 내부에, 세포 배양 배지의 웰 당 100 μL에 20,000개의 세포가 있는 검은색, 투명한 바닥, 폴리-D-라이신이 코팅된 96-웰 플레이트의 내부 60웰을 시드한다. 외부 36 웰을 웰 당 100 μL의 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 채운다.<ol>
<li>세포를 계수하려면 2μL의 아크리딘 오렌지 및 프로피듐 요오드화 염색을 18μL의 세포 현탁액에 첨가한다.</li>
		<li>이 용액 10 μL를 세포 카운팅 슬라이드의 한쪽 면에 로딩한다.</li>
		<li>1.2.1단계를 반복합니다. 및 1.2.2. 을 눌러 슬라이드의 양쪽을 로드합니다.</li>
		<li>슬라이드를 자동화된 셀 카운터에 놓습니다.</li>
		<li>형광 계수 프로토콜을 선택하고 Count를 누릅니다. 슬라이드의 양쪽을 계산하고 두 라이브 셀 밀도의 평균을 계산합니다.</li>
		<li>필요한 세포 현탁액의 부피를 계산하려면 평균 세포 밀도로 필요한 총 세포 수를 나눕니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적절한 밀도와 분포가 달성되었는지 확인하기 위해 광 현미경으로 시딩 한 후 우물을 검사하십시오.</li>
	<li>플레이트를 5% CO2와 함께 37°C의 가습된 인큐베이터에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.</li>
</ol>2. QD-스파이크로 세포의 처리
<ol><li>이미징 배지에서 희석하여 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 제조하였다.<ol>
<li>10mL의 이미징 배지에 130μL의 7.5% BSA를 넣고 혼합합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>12-웰 저장소 또는 분석 플레이트에서, 이미징 매질에서 0.1% BSA를 사용하여 440 nM QD-스파이크 (SARS-CoV-2, Isolate USA-WA1/2020) 스톡을 20 nM으로 희석한다.<ol>
<li>QD-스파이크의 1 웰에 대해, 2.27 μL의 440 nM QD-스파이크를 20 nM의 최종 농도를 위해 0.1% BSA 이미징 매질의 47.73 μL에 첨가한다.</li>
		<li>6-포인트 1:3 연속 희석액(3배)을 생성하려면, 14.26 μL의 QD-스파이크를 0.1% BSA 이미징 매질의 285.74 μL에 첨가하여 20 nM의 최고 농도를 만든다. 100 μL의 20 nM QD-스파이크를 0.1% BSA 매질의 200 μL에 첨가하여 6.67 nM QD-스파이크의 두 번째 희석을 만든다. 네 번 반복하여 여섯 개의 농도 점을 생성합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다중 채널 흡입기를 사용하여 각 웰에서 사용된 모든 미디어를 제거합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 이미징 매체(100μL/웰)로 한 번 세척합니다.</li>
	<li>100μL의 이미징 미디어를 흡인하고 QD-스파이크 용액 50μL/웰을 다시 추가합니다.</li>
	<li>플레이트를 5% CO2와 함께 37°C의 가습된 인큐베이터에서 3시간 동안 인큐베이션한다. 4단계를 계속합니다.</li>
</ol>3. 고정 및 핵 염색
<ol><li>멸균 된 생물 안전 캐비닛 내부에서 개인 보호 장비 (실험실 장갑, 실험실 코트 및 안전 안경 포함)를 착용하고 0.1 % BSA 이미징 매체에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 준비하십시오.</li>
	<li>각 웰에서 50μL의 QD-스파이크를 흡인하고 4% PFA의 100μL/웰을 첨가합니다.<ol>
<li>우물이 마르지 않도록하십시오. 자동화된 다중 채널 피펫을 사용하여 웰이 건조되지 않도록 합니다(권장).</li>
	</ol>
</li>
	<li>실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>1x 인산완충식염수(PBS)로 세 번 세척한다.</li>
	<li>5 mM 원액을 PBS로 1:1000 희석하여 딥 레드 핵 염료를 제조하였다.</li>
	<li>PBS를 흡인하고 희석된 핵 염료 50 μL/웰을 다시 첨가한다.</li>
	<li>실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>PBS로 세 번 씻으십시오.</li>
	<li>나중에 이미징을 위해 플레이트 실러를 사용하여 플레이트 또는 씰을 이미지화하십시오. 플레이트를 4°C에서 보관한다. 형광은 몇 주 이상 안정해야 한다.</li>
</ol>4. 획득 설정 및 이미징
<ol><li>이미징 플랫폼용 소프트웨어를 시작합니다. 고콘텐츠 이미징 플랫폼을 켜면 상태 표시줄의 표시등이 켜져 있어야 합니다. 기기가 연결되어 있지 않으면 소프트웨어가 오프라인 분석 모드로 전환됩니다.</li>
	<li>이미징 플랫폼에 로그인합니다.</li>
	<li>새 획득 프로토콜을 만듭니다.<ol>
<li>플레이트 유형을 96웰 클리어 바닥 이미징 플레이트로 선택합니다. 참고: 계측기의 플레이트 선택은 다양할 수 있으며 높이, 너비 및 기타 거리와 같은 플레이트 치수를 포함하는 올바른 플레이트 정의를 로드하여 간격과 초점이 잘 정해져 있는 것을 사용자 지정할 수 있습니다.</li>
		<li>광학 모드를 공초점으로 선택하고 배율을 40x 수침으로 선택합니다.</li>
		<li>비닝을 1로 선택합니다.</li>
		<li>4.3.5-4.3.8 단계에 설명된 대로 채널 및 형광 여기/방출 파장을 선택합니다. 이미지를 보고 설정이 적절한지 확인하기 위해 설정을 선택할 때 스냅숏을 만듭니다. 참고: DPC(Digital Phase Contrast)를 사용하면 세포 얼룩이나 형광 염료 없이 살아있는 세포를 시각화할 수 있습니다. 고정 셀에는 권장하지 않습니다.</li>
		<li>DPC에 대한 모드 (예: 고대비)를 선택하여 잘 정의된 세포체를 생성합니다. 스냅숏을 만들어 이미지 창에 표시된 대로 이 설정이 적절한지 확인합니다.</li>
		<li>세포 내에서 ACE2 트래피킹의 시각화를 허용하는 ACE2-GFP 세포주와 함께 사용할 FITC 채널을 선택하십시오.</li>
		<li>QD 채널에 대한 사용자 지정 채널을 만들려면 채널의 삼각형 드롭다운 메뉴를 선택하고 405nm 범위에서 여기와 608nm 범위의 방출을 선택합니다.</li>
		<li>세포가 고정되고 깊은 적색 핵 염료가 사용 된 경우, 630 nm 이상의 방출을 가진 원간 적색 채널을 선택하여 세포 몸체를 더 묘사하고 세포 마스크로 작용하십시오.</li>
		<li>강한 세포질 QD 신호가 있는 웰을 선택하여 노출 시간, 레이저 파워 및 Z 높이 위치를 설정합니다. 4.3.10-4.3.13의 단계를 따릅니다.</li>
		<li>기본 높이가 셀이 원하는 초점면에 있는 이미지를 생성하는지 확인합니다. 엔도사이토시드된 누자가 표적 소기관인 경우, Z-위치는 원형질막이 표적 소기관인 경우보다 낮을 것이다.</li>
		<li>배경 신호보다 적어도 세 배 더 큰 회색 레벨의 밝은 이미지를 생성하는 노출 시간을 선택합니다. 일반적으로 100ms에서 300ms 사이입니다. 20nM에서 회색 레벨은 200ms의 노출 시간과 80%의 레이저 파워를 사용하여 약 6000a.u.여야 합니다.</li>
		<li>각 채널의 스냅샷 기능으로 생성된 이미지를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 강도 표시를 선택하여 회색 수준을 확인합니다. 그런 다음 관심 있는 개체 또는 배경을 마우스 왼쪽 단추로 클릭하여 해당 픽셀의 회색 수준을 봅니다.</li>
		<li>레이저 파워를 조정하여 관심 물체의 강도를 미세 조정하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>획득 프로토콜을 저장합니다.</li>
	<li>실험 실행으로 전환하고 플레이트 이름을 입력합니다.</li>
	<li>실험을 실행합니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>이미징 소프트웨어로 데이터를 가져옵니다.<ol>
<li>모든 이미지를 획득한 후 측정값을 이미징 소프트웨어로 내보냅니다. 이렇게 하려면 서버를 설정하고 계정을 만들어야 합니다. 이미징 소프트웨어로 내보낼 데이터의 화면을 만듭니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미징 소프트웨어에서 이미지 분석을 선택하여 분석 프로토콜 구축을 시작합니다.</li>
	<li>화면 목록에서 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 선택을 클릭하여 이미징 실험에서 측정값을 로드 합니다. 이미지화된 우물과 관련 필드의 플레이트 맵은 창의 왼쪽 하단에 표시되어야 합니다.</li>
	<li>밝은 세포질 QD 반점이있는 우물을 선택하여 이미지 세분화를 시작하십시오.</li>
	<li>입력 이미지 빌딩 블록에서 플랫필드 보정을 선택합니다.</li>
	<li>핵 찾기를 선택하여 프로토콜에 다음 빌딩 블록을 추가합니다.<ol>
<li>여기서, 핵 마커로서 DPC 또는 원적색 채널을 사용한다.</li>
		<li>먼저 객체를 정확하게 분할하는 방법을 선택한 다음 드롭다운 메뉴를 사용하여 세그멘테이션을 미세 조정하고 슬라이더를 조정합니다. 참고: 양호한 세분화는 핵, 세포 및 반점에 대한 관심 영역(ROI)을 정확하게 정의합니다. 마커에 대해 양수인 픽셀만 개별 ROI 내에서 캡처해야 합니다. 배경 신호는 제외해야 합니다. 배경이 ROI에서 캡처되는 경우, 방법의 감도가 감소될 수 있거나, 강도의 임계값이 증가하여 세그멘테이션 알고리즘의 엄격성이 증가될 수 있다. 이는 모든 Find 빌딩 블록에 적용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음으로, 세포질 빌딩 블록 찾기 를 추가하여 세포질을 확인합니다.<ol>
<li>이 경우, 세포질 세분화를 위해 ACE2-GFP 채널을 사용한다.</li>
		<li>각 세포의 세포질을 가장 잘 식별하는 방법을 선택하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>그런 다음 찾기 스팟 빌딩 블록을 추가하여 QD-스파이크 누점을 식별합니다.<ol>
<li>ROI 모집단으로 핵을 선택합니다.</li>
		<li>셀을 ROI 영역으로 선택합니다. 이것은 전체 세포 내의 누점을 캡처합니다.</li>
		<li>각 셀에서 QD 누자를 가장 잘 식별하는 방법을 선택합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미지의 모든 객체가 분할되고 이 웰에서 정확하게 식별되면 다른 웰을 선택하여 빌딩 블록과 설정이 일반적으로 다른 웰 및 기타 조건에 적용될 수 있도록 합니다.</li>
	<li>분할된 모든 개체(핵, 세포질/세포 및 반점)에 대한 강도 계산 특성을 추가합니다.</li>
	<li>분할된 모든 개체(핵, 세포질/세포 및 반점)에 대한 형태학 특성 계산 을 추가합니다.</li>
	<li>분할된 모든 개체(핵, 세포질/세포 및 반점)에 대한 텍스처 특성 계산 을 추가합니다.</li>
	<li>핵과 반점을 포함한 각 집단에 대한 매개 변수를 선택하여 결과를 정의합니다. 개체의 수는 세포 생존력의 간접적 척도로서 사용될 수 있다.</li>
</ol>6. 데이터 내보내기6.
<ol><li>배치 분석을 클릭하십시오. 다음 단계로 진행하기 전에 분석이 완료될 때까지 기다립니다(단계 6.2). 참고: 배치 분석을 통해 이미지 분석 소프트웨어 서버는 선택한 측정값을 사용하여 분석 프로토콜을 로드하여 데이터를 원격으로 분석할 수 있습니다.</li>
	<li>데이터 세트를 로컬 컴퓨터 또는 네트워크 드라이브로 내보냅니다.<ol>
<li>연결 파일을 다운로드하여 열어 이미지 분석 소프트웨어를 컴퓨터의 도우미 응용 프로그램에 연결합니다.</li>
		<li>결과 파일 형식(.txt, .csv, .html 또는 기본 XML)을 선택합니다.</li>
		<li>드롭다운 메뉴를 사용하여 파일 폴더 설정을 선택합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 스프레드시트의 데이터 분석
<ol><li>내보낸 파일을 엽니다. .csv 파일인 경우 피벗 테이블을 사용할 수 있도록 .xls 파일 형식으로 저장합니다. 파일 경로가 너무 긴 경우 저장 오류를 방지하기 위해 .xls 파일을 폴더 계층 구조에서 위쪽으로 저장하십시오.</li>
	<li>스프레드시트에 각 웰의 조건을 지정하는 열을 추가합니다. 예를 들어, 세포 유형, QD-스파이크 변이체, QD-스파이크 농도, 배양 시간 등이 있다.</li>
	<li>피벗 테이블 함수를 선택하고 추가된 조건을 행으로, 측정된 매개 변수를 열로 사용하여 테이블을 빌드합니다. 각 매개변수에 대한 계산(예: 평균, 표준 편차, 중앙값, 최소값, 최대 또는 개수)을 선택합니다.</li>
	<li>데이터를 정규화하여 비접합 QD를 0%로, 최고 농도의 QD-Spike를 100%로 포함하여 샘플을 제어합니다. 참고: 중화 항체와 같은 억제제의 효능을 평가하는 경우, 데이터를 배지 전용 처리된 세포(100% 효능) 및 억제제가 없는 QD-Spike(0% 효능)로 정규화합니다.</li>
	<li>그래프 소프트웨어에 데이터를 플로팅합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

이 기사에 설명 된 방법은 고처리량 공초점 현미경을 사용하여 인간 세포에서 기능화 된 QD를 이미징하는 데 필요한 단계를 제공합니다. 이 방법은 SARS-CoV-2 스파이크 및 hACE2 엔도사이토시스에 대한 연구를 가능하게 하기 때문에 TMPRSS2 및 막 융합의 활성보다는 엔도사이토시스가 바이러스 진입의 주요 경로인 세포에 가장 적합합니다. QD 모델 및 상업적으로 입수가능한 스파이크 삼량체 상의 C-말단 His-태그의 특성 때문에, 스파이크 S1 및 S2 도메인의 임의의 TMPRSS2 절단은 S2 도메인에만 부착된 QD를 남겨둘 것이다12. 이는 RBD가 S1에서 발견된다는 점을 감안할 때 내재화를 방지할 수 있다. 따라서 hACE2가 결합되고 TMPRSS2가 스파이크를 절단하는 셀 표면에서의 이벤트 시퀀스가 정확하다면 내재화가없는 음의 신호가 예상됩니다.
이 프로토콜은 이미징 세포 과정을 다루기 때문에 배양 된 세포는 hACE2의...

형광 현미경을 통해 연구원은 특수 염료1, 유전적으로 인코딩된 형광 단백질2 및 양자점(QD) 형태의 형광 나노입자를 사용하여 세포의 내부 작용을 조사할 수 있습니다3. 2019 년 심각한 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 (SARS-CoV-2) 세계적인 유행병의 경우, 연구자들은 바이러스가 원형질막과 세포질에서 세포와 어떻게 상호 작용하는지 이해하기 위해 형광 현미경을 사용했습니다. 예를 들어, 연구자들은 비리온 표면의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과 인간 세포 표면의 인간 안지오텐신 전환 효소 2 (hACE2)의 결합, 원형질막에서의 융합을 통한 후속 내재화 및 스파이크 : hACE2 단백질 복합체의 내시세포증4,5에 대한 통찰력을 얻을 수있었습니다. 또한 세포 형광 이미징을 사용하여 리소좀을 통해 세포로부터 SARS-CoV-2 유출 에 대한 훌륭한 통찰력을 얻었는데, 이는 이전에 골지에서 싹트는 전통적인 소포를 통해 발생하는 것으로 생각되었던 코로나 바이러스의 독특한 특징입니다6 다른 많은 바이러스와 마찬가지로. 생물학적 연구의 거의 모든 측면의 주류 인 세포 형광 현미경 검사 기술은 전체 동물의 초해상도 이미징에서 약물 스크리닝을위한 자동화 된 고함량 다중 파라 메트릭 이미징에 이르기까지 광범위한 응용 분야에서 필연적으로 발전해 왔습니다. 여기서, 자동화된 고함량 공초점 현미경은 바이러스 스파이크 단백질에 접합된 형광 QDs를 사용하는 SARS-CoV-2 세포 진입의 연구에 적용된다.
생물학적 이미징 플랫폼에 의해 생성된 이미지의 고함량 분석은 다중 모드 플레이트 리더를 사용하여 얻을 수 있는 전체 웰 강도와 같은 단일 파라미터보다 귀중한 생물학적 통찰력을 더 크게 추출할 수 있게 해줍니다7. 자동화된 세분화 알고리즘을 사용하여 시야에서 객체를 분리함으로써, 각각의 오브젝트 또는 오브젝트 집단은 각각의 이용가능한 형광 채널8에서 강도, 면적 및 텍스처와 같은 파라미터에 대해 분석될 수 있다. 많은 측정값을 다변량 데이터 세트에 결합하는 것은 표현형 프로파일링에 유용한 접근 방식입니다. 원하는 표현형, 예를 들어 누점 형태의 QD 내재화가 알려져 있는 경우, 치료의 효능을 평가하기 위해 크기, 수 및 강도와 같은 누자와 관련된 측정을 사용할 수 있다.
클라우드 기반 고콘텐츠 이미징 분석 소프트웨어는 고콘텐츠 이미징 플랫폼을 포함한 다양한 계측기 데이터 출력을 수용할 수 있습니다. 이미지 저장 및 온라인 분석을 위해 클라우드 기반 서버를 사용함으로써 사용자는 이미징 장비 또는 데이터가 저장된 네트워크 드라이브에서 데이터를 업로드 할 수 있습니다. 프로토콜의 분석 부분은 클라우드 소프트웨어 환경 내에서 수행되며 다운스트림 데이터 시각화를 위해 다양한 파일 형식으로 데이터를 내보낼 수 있습니다.
SARS-CoV-2 바이러스는 조립 및 복제를 돕는 비구조 및 구조 단백질로 구성됩니다. SARS-CoV-2 스파이크는 S1과 S2라는 두 개의 도메인을 가지고 있으며, S1은 원형질막에서 hACE2 상호 작용을 담당하는 수용체 결합 도메인을 포함합니다9. 스파이크는 또한 hACE210,11 이외에 공동-수용체로서 작용할 수 있는 원형질막에서 다른 분자들과 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. 스파이크 단백질 서열 전체에서, 특히 S1/S2 계면에서, 막횡단 세린 프로테아제 2 (TMPRSS2)12 이후 막에서 융합을 가능하게 하는 프로테아제 절단 부위가 존재한다. 다양한 재조합 SARS-CoV-2 스파이크 단백질은 개별 수용체 결합 도메인으로부터 S1, S2, S1 및 S2를 갖는 S2 및 전체 스파이크 트리머로부터 연구 활동에 사용하기 위해 여러 상업 벤더로부터 생산되었다13.
이 작업에서, QDs의 표면은 히스티딘 태그 (QD-Spike)를 포함하는 재조합 스파이크 트리머로 기능화되었다. 해군 연구소 광학 나노 물질 섹션에서 생산 한 QD에는 카드뮴 셀레나이드 코어와 황화아연 쉘14,15가 포함되어 있습니다. QD 표면 상의 아연은 재조합 단백질 내의 히스티딘 잔기를 좌표화하여 형태와 기능면에서 SARS-CoV-2 바이러스 입자와 유사한 기능화된 QD를 형성한다. 나노입자의 생성과 컨쥬게이션된 단백질은 QD 컨쥬게이션된 수용체 결합 도메인15를 사용하여 이전에 기술되었다. 이 방법은 인간 세포의 생리적 맥락에서 SARS-CoV-2 스파이크 활성을 연구하는 연구자를 안내 할 수있는 세포 배양 준비, QD 치료, 이미지 수집 및 데이터 분석 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>32% 파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15714</td><td>양자점 처리 후 세포 고정에 사용, 최종 농도 3.2% Optimem I에서 QD를 안정화하고 비특이적 상호 작용을 방지하는 데 사용, 최종 농도 0.1%</td></tr><tr><td>7.5% 소 혈청 알부민</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>형광 세포 계수를 위한 세포 생존 염료로 사용</td></tr><tr><td>Acridine Orange / Propidium Iodide 염색</td><td>Logos Biosystems</td><td>F23001</td><td>세포 파종 및 분석에 사용되는 마이크로웰 플레이트 QD-Spike</td></tr><tr><td>Black clear bottom 96 poly-D-lysine Grein 655946 er로 코팅된 96 웰 코팅 플레이트</td><td></td><td></td><td>세포 배양 지원에 사용, DMEM 보충제</td></tr><tr><td>Characteristic Fetal Bovine Serum</td><td>Cytiva/HyClone</td><td>SH30071.03</td><td>클라우드 기반 고함량 이미지 분석 소프트웨어; V2.9.1</td></tr><tr><td>콜럼버스 분석기</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>고정 후 세포핵 및 세포체 라벨링에 사용, 진한 적색 핵 염료</td></tr><tr><td>DRAQ5 (5 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62252</td><td>HEK293T 세포 배양을 위한 기초 배지</td></tr><tr><td>Dulbecco의 최소 필수 배지, D-포도당(4.5g/L), L-글루타민, 피루브산 나트륨(110mg/L), 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>콜럼버스에서 내보낸 후 데이터를 정렬하는 데 사용됩니다. V2110 Microsoft 365</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td>hACE2-GFP 양성 세포의 선택을 계속하는 데 사용, DMEM 보충</td></tr><tr><td>G418</td><td>InvivoGen</td><td>ant-gn-5</td><td>인간 배아 신장 세포주 안정적으로 발현 인간 안지오텐신 변환 효소 2 GFP</td></tr><tr><td>HEK293T 태그 hACE2-GFP</td><td>Codex Biosolutions</td><td>CB-97100-203</td><td>자동 세포 계수기</td></tr><tr><td>Luna 자동 세포 계수기</td><td>Logos Biosystems</td><td>NA</td><td>형광 세포 계수에 사용</td></tr><tr><td>Luna Cell Counting Slides</td><td>Logos Biosystems</td><td>L12001</td><td>High-content imaging platform</td></tr><tr><td>Opera Phoenix</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Quantum dots로 세포를 배양하는 데 사용되는 이미징 매체</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>11058-021</td><td>칼슘 또는 마그네슘이 없는 인산염 완충 식염수 파시에이징 및 분석 중 세포 세척에 사용</td></tr><tr><td>PBS -/-</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>세포 배양의 세균 오염을 방지하는 데 사용, DMEM 보충제</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>그래프 작성, 데이터 시각화 및 통계 분석에 사용; V9.1.0</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>NA</td><td>hACE2에 대한 SARS-Cov-2 스파이크 결합 분석 및 스파이크 세포내이입 모니터링에 사용됨</td></tr> <tr><td>Quantum</td><td></td><td>Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td> <td>hACE2에 대한 SARS-Cov-2 스파이크 바인딩 억제에 사용</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) 스파이크 중화 항체, 마우스 mab</td><td>Sino Biological</td><td>40592-MM57</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr>을 통과시키는 동안 플라스크에서 세포를 해리하는 데 사용됩니다</tbody></table>.

hek293t 세포에서 결합 및 엔도사이토시스를 추적하기 위한 양자점 접합 sars-cov-2 스파이크 삼량체의 고처리량 공초점 이미징

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

세포 형광 현미경 검사를위한 새로운 기술의 개발은 약물 발견을위한 고처리량 스크리닝 방법을 촉진했습니다. 양자점은 밝고 안정적인 광발광뿐만 아니라 좁은 발광 대역으로 스며든 우수한 광물리학적 특성을 가진 형광 나노입자입니다. 양자점은 구형이며, 표면 화학의 적절한 변형과 함께, 세포 응용을 위해 생체분자를 접합하는데 사용될 수 있다. 이러한 광학 특성은 생체 분자로 기능화 할 수있는 능력과 결합하여 수용체 - 리간드 상호 작용 및 세포 밀매를 조사하기위한 훌륭한 도구입니다. 여기에서는 양자점을 사용하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 결합 및 엔도사이토시스를 추적하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 양자점을 활용하여 세포 생리학의 맥락에서 단백질-단백질 상호작용 및 인신매매를 연구하고자 하는 실험가들을 위한 가이드로 사용될 수 있다.

처리시, QDs는 나노입자가 원형질막 상의 ACE2에 결합하고 엔도사이토시스를 유도할 것이기 때문에 내재화될 것이다. ACE2-GFP 발현 세포주를 사용하여, QD 및 ACE2 둘 다의 전좌는 형광 현미경을 사용하여 시각화될 수 있다. 일단 내부화되면, 두 개의 QD 및 ACE2 신호는 강력한 공동 로컬라이제이션을 보여준다. 이러한 이미지로부터 이미지 세분화 및 후속 분석을 수행하여 스폿 카운트와 같은 관련 파라미터를 추출할 수 있습니다(그림 1, 그림 2B). 도 1A는 대조군으로서 상이한 농도의 QD-Spike 또는 배지만으로 처리된 세포의 몽타주이다. 디지털 위상 콘트라스트, FITC 및 405nm에서 여기, 608nm에서 방출되는 맞춤형 QD 채널을 포함하여 세 가지 채널이 사용되었습니다. DPC는 일반적인 세포 형상의 이미지를 제공한다. DPC 이미지는 전체 세...

이 프로토콜에서, 재조합 SARS-CoV-2 스파이크에 접합된 양자점은 세포-기반 분석을 가능하게 하여 원형질막에서 hACE2에 대한 스파이크 결합 및 세포질 내로의 결합된 단백질의 후속 엔도사이토시스를 모니터링한다.

HEK293T 세포에서 결합 및 엔도사이토시스를 추적하기 위한 양자점 접합 SARS-CoV-2 스파이크 삼량체의 고처리량 공초점 이미징

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

우리는 세포 바이러스 감염의 첫 번째 단계로 스파이크 매개 세포 인식 및 진입으로 다른 바이러스에 적용 할 수있는 SARS COVID 2를위한 플랫폼 기술을 수립했습니다. 양자점은 밝고 안정적이며 그 표면은 다양한 세포 응용을 위해 기능화 될 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 스파이크 내재화를 시각화하고 세포로 측정 할 수 있습니다.0.1 % BSA를 준비하십시오. 130 마이크로 리터의 7.5 % BSA를 10 밀리리터의 이미징 매체에 혼합하십시오. 6.1 내지 3개의 연속 희석 및 삼중의 경우 14.26 마이크로리터의 QD 스파이크를 0.1%BSA의 285.74 마이크로리터에 첨가하여 20나노몰의 최고 농도를 만든다.그런 다음 20 나노 몰 또는 QD 스파이크 100 마이크로 리터를 0.1 % BSA의 200 마이크로 리터에 추가하여 6.67 나노 몰 QD 스파이크의 두 번째 망상을 만듭니다. 다중 채널 흡입기로 각 웰에서 사용 된 모든 미디어를 제거하고 웰 당 100 마이크로 리터의 이미징 미디어가있는 다중 채널 피펫으로 한 번 씻은 다음 이미징 미디어 100 마이크로 리터를 흡인하십시오. 웰 당 50 마이크로리터의 QD 스파이크 용액을 다시 첨가하고, 플레이트를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5% 이산화탄소로 3시간 동안 인큐베이션한다.보호 장비를 착용하고 멸균 된 바이오 안전 캐비닛 내부에 4 % PFA 및 0.1 % PSA 이미징 미디어를 준비하고 각 웰에서 50 마이크로 리터의 QD 스파이크를 흡인하고 웰 당 4 % PFA 100 마이크로 리터를 자동 다중 채널 피펫으로 추가하여 웰이 건조되지 않도록하십시오. 실온에서 15분 동안 배양한 다음, PBS로 3회 세척한 후, PBS에 5밀리미터 원액을 1000 내지 1000으로 희석하여 딥 레드 핵 염료를 제조하고, PBS를 흡인하고, 웰 당 희석된 핵 염료 50 마이크로리터를 다시 첨가한다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 세척하고, 플레이트를 이미지화하거나 추후 이미징을 위해 플레이트 실러를 사용하여 밀봉한다.접시를 섭씨 네 도에 보관하십시오. 이미징 플랫폼용 소프트웨어를 시작합니다. 이미징 플랫폼에 로그인한 후 96 벽면 투명 바닥 이미징 플레이트로서 플레이트 타입을 선택하여 새로운 획득 프로토콜을 생성하고, 광학 모드를 선택하여 초점과 배율을 40배 수침수로 한 후, 비닝을 하나로 선택한다.고대비와 같은 디지털 얼굴 대비 모드를 선택하여 잘 정의된 세포체를 생성합니다. 스냅샷을 찍어 이 제목이 이미지 윈도우에 표시된 대로 적절한지 확인하고, ACE2-GFP 세포주와 함께 사용할 적합 C 채널을 선택하여 셀 내에서 ACE2 트래피킹을 시각화합니다. 사용자 정의 QD 채널을 만들려면 삼각형 드롭 다운 메뉴를 선택하고 608 나노 미터 범위에서 방출되는 405 나노 미터 범위의 여기를 선택하고 강력한 세포질 QD 신호가있는 우물을 선택하여 노출 시간, 레이저 전력 및 Z 높이 위치를 설정하십시오.기본 높이가 원하는 초점 평면에서 셀의 이미지를 생성하는지 확인합니다. Z 위치는 원형질막에 대한 Z 위치보다 엔도사이토오스 누자에 대해 더 낮을 것이다. 일반적으로 배경 신호보다 3배 이상 큰 회색 레벨의 밝은 이미지를 생성하는 노출 시간을 100밀리초에서 300밀리초 사이로 선택합니다.20 나노 몰에서 회색 수준은 약 6, 000 원자 단위이어야하며 노출 시간은 200 밀리 초이고 레이저 파워는 80 %입니다. 각 채널의 스냅 샷 기능으로 생성 된 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 강도 표시를 선택한 다음 관심있는 객체 또는 배경을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 해당 픽셀의 회색 레벨을 확인하고 레이저 파워를 조정하여 관심있는 물체의 강도를 미세 조정하십시오. 획득 프로토콜을 저장하고 실험을 실행하도록 전환하고 플레이트 이름을 입력하고 실험을 실행하십시오.QD 및 ACE2 둘 다의 전좌는 형광 현미경 및 ACE2-GFP 발현 세포주를 사용하여 시각화하였다. 이미지 세분화 및 후속 분석을 수행하여 스팟 카운트와 같은 관련 파라미터를 추출하였다. 첫째, 핵을 핵 마커 채널로부터 분할하여 ROI 집단을 생성하였다.그런 다음 ACE2-GFP 채널을 사용하여 세그먼트화하여 셀을 윤곽을 그리는 ROI 영역. 마지막으로, QD 608 스파이크 스폿은 셀 ROI 영역으로부터 세그먼트화되었고, 내부화된 QD 및 ACE2 신호는 강한 공동 국재화를 보였다. 여섯 가지 상이한 농도의 QD 스파이크를 사용한 농도 반응 실험을 HEK 293T 세포에서 수행하였다.QD의 광학 농도를 결정할 때 QDS는 2.22 나노 몰만큼 낮게 사용할 수 있지만 강력한 반응을 보장하기 위해 10 나노 몰 이상의 농도를 사용하는 것이 좋습니다. QD에 컨쥬게이션 동안 단백질 응집이 발생할 수 있다. 응집체는 밝은 응집된 침전물 및 HEK 293T 세포로서 QD 용액에서 발견되었고, QDs는 세포에 첨가되기 전에 마이크로리터당 30 마이크로그램에서 시작하는 중화된 항체와 함께 인큐베이션되었고, 이들 항체는 결합 내재화를 차단하고 QD만으로 처리된 세포에 비해 스팟 카운트의 감소를 야기하였다.이 에세이는 또한 높은 처리량 스크리닝, 중화 항체의 리드 평가에 사용될 수 있으며, 바이러스 진입을 차단하기 위해 말장난 항 바이러스제를 확인하고 새로 떠오르는 변종을 연구하기 위해 적응 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Neisseria meningitidis (NM), g 부정적인 인간 특정 호흡기 병원체가 인간 α - actinin에 바인딩할 수 있습니다. 여기 우리는 인간의 뇌 microvascular 내피 세포 (HBMECs)에 세균 입국 후 α - actinin 세포와 세균의 colocalisation의 시각화를위한 프로토콜을 제시한다.

의 세포 상호 작용 Visualisation 및 부량 Neisseria meningitidis</em공촛점 이미징에 의해 α - actinin>과 인간

Source: Tran, B. N., et. al. High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the use of quantum dot–conjugated spike protein (QD-Spike) to visualize dose-dependent viral entry in ACE2-GFP–expressing cells. Confocal imaging captures the internalization of QD-Spike via receptor-mediated endocytosis, modeling early coronavirus entry.

Visualizing Dose-Dependent Spike Protein Uptake with Quantum Dot Conjugates

이 비디오는 SARS-CoV-2 아게놈 RNA의 공간 분포를 시각화하기 위한 HCR(Hybridization Chain Reaction)-FISH(Fluorescence In Situ Hybridization)의 적용을 보여줍니다. HCR과 면역형광 기술을 결합하면 단일 세포 수준에서 숙주-바이러스 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Immuno-RNA Fluorescence In Situ Hybridization을 사용하여 SARS-CoV-2 시각화

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

이 프로토콜에는 포스터 공명 에너지 전달, 및 현미경 이미징 형광 수명에 따라 무 단백질의 복잡 한 형성의 양적 시각화에 대 한 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다.

형광 일생 화상 현미경 검사 법에 의해 인신 매매 세포내 올 무를 떠 올 리

바인딩할 대상 수용 체 세포 표면에 항 체 구조와 클러스터링 변경 부여 수 있습니다. 이러한 동적 변경 내용이 대상 셀에 약물 개발 특성화에 대 한 영향을 미칠. 이 프로토콜 confocal 현미경 검사 법 및 이미지 상호 관계 분광학 ImageJ/피지 수용 체 세포 표면에 클러스터링의 척도를 통해 활용 합니다.

Confocal 현미경 검사 법 밝혀 세포 표면 수용 체 이미지 상관 분광학을 통해 집계

여기서, 우리는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) RNA를 시각화하기 위하여 정시 혼성화 (RNA-FISH)와 면역형광에 있는 RNA 형광을 결합하는 간단한 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 SARS-CoV-2 RNA 숙주 상호 작용의 분자 특성에 대한 이해를 증가시킬 수 있다.

시투 혼성화에서 면역 RNA-형광을 이용한 SARS-CoV-2의 시각화

여기서 설명된 프로토콜은 스파이크 당단백질로 의사형인 향상된 녹색 형광 단백질 표지 된 정맥낭염 바이러스에 의해 감염을 억제하는 병류 혈청 샘플의 능력을 평가함으로써 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 중화 항체를 측정하는 빠르고 효과적인 방법을 설명합니다.

의사 바이러스 감염의 높은 처리량 형광 화상 진찰을 사용하여 SARS-CoV-2 중화 항체의 검출

이 프로토콜은 생체 내에서 SARS-CoV-2 감염을 연구하는 데 필요한 2차 접근법의 필요성을 극복하기 위해 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서 루시페라아제 및 형광 발현 재조합 (r)SARS-CoV-2 및 생체내 이미징 시스템 (IVIS)을 사용하는 바이러스 감염의 역학을 기술한다.

리포터 발현 재조합 SARS-CoV-2를 이용한 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서의 바이러스 감염의 라이브 이미징 및 정량화

여기에서는 이중 리포터 유세포 분석 시스템을 사용하여 안지오텐신 변환 효소-2 결합 자기 마이크로스피어에 의해 포착된 온전한 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 바이러스 입자에서 두 개의 고유한 스파이크 단백질 에피토프를 동시에 검출하는 새로 개발된 다중 형광 면역분석법에 대해 설명합니다.

Multiplex Dual-Reporter Strategy를 통한 바이러스 입자의 표면 단백질 에피토프 프로파일링

이 프로토콜은 고해상도 셀룰러 및 아셀룰러 이미징을 위한 다중화 배열 검출기와 통합된 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템의 첨단 영상 응용과 공유 자원 관리를 상세히 설명합니다. 이 워크플로우는 단일 플랫폼 내에서 공초점에서 초해상도(~120 nm)까지 다중 모달 이미징을 가능하게 하여 나노스케일 시각화를 더욱 쉽게 접근할 수 있게 합니다.

초해상도 영상 및 공유 관리: 다중화 검출이 포함된 공초점 현미경 프로토콜

학습하세요 양자점 접합 SARS-CoV-2 스파이크 삼량체를 이용한 고처리량 공초점 이미징으로 HEK293T 세포에서 바이러스 결합 및 엔도사이토시스를 추적하는 방법. 이 기술은 세포 감염 메커니즘 연구와 항바이러스 스크리닝에 활용됩니다.

HEK293T 세포에서 결합 및 엔도사이토시스를 추적하기 위한 양자점 접합 SARS-CoV-2 스파이크 삼량체의 고처리량 공초점 이미징

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