Name: 종이 기반 토홀드 스위치 진단의 개발 및 환자 검증을 위한 설계-구현 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 학습하세요 종이 기반 토홀드 스위치 진단법을 활용한 바이러스 RNA 검출 기술입니다. 이 방법은 분자생물학적 도구를 사용하여 민감하고 특이적인 현장 진단을 가능하게 하며, 자원이 제한된 지역에서 임상급 검사 접근성을 높입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 Green, Pardee 및 Pena 연구실의 모든 구성원과 이 원고에 공개된 작업과 관련된 이전 원고의 모든 공동 저자에게 감사드립니다. S.J.R.D.S.는 브라질 페르남부쿠 과학 기술 재단(FACEPE)이 후원하는 박사 펠로우십(참조 번호 IBPG-1321-2.12/18)의 지원을 받았으며 현재 캐나다 토론토 대학교가 후원하는 박사후 연구원의 지원을 받고 있습니다. PB는 토론토 대학교 약학부의 William Knapp Buckley Award의 지원을 받고 있습니다. MK는 토론토 대학교 내부 펠로우십 번호 PRMF2019-002의 정밀 의학 이니셔티브(PRiME)의 지원을 받았습니다. 이 작업은 캐나다 연구 위원장 프로그램(파일 950-231075 및 950-233107), 토론토 대학의 주요 연구 프로젝트 관리 기금, CIHR 재단 보조금 프로그램(201610FDN-375469), CIHR/IDRC 팀 보조금을 통해 L.P, A.A.G. 및 K.P에 대한 기금으로 지원되었습니다. 캐나다-라틴/아메리카-카리브해 지카 바이러스 프로그램(FRN: 149783), 캐나다 2019 신종 코로나바이러스(COVID-19) 신속 연구 자금 지원 기회를 통해 캐나다 국제 개발 연구 센터(보조금 109434-001)에서 K.P.에 대한 기금으로. 이 연구는 또한 애리조나 생물 의학 연구위원회 새로운 연구자 상 (ADHS16-162400), 게이츠 재단 (OPP1160667), NIH 이사의 새로운 혁신가 상 (1DP2GM126892), NIH R21 상 (1R21AI136571-01A1)에서 K.P./A.A.G, 알프레드 P. 슬론 펠로우십 (FG-2017-9108). 그림 1 은 K.P.에 대한 학술 라이센스하에 Biorender.com 작성되었습니다.

<ol><li>Urdea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+high+impact+diagnostics+in+the+developing+world%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Requirements for high impact diagnostics in the developing world.</a> Nature. 444, Suppl 1 73-79 (2006).</li>
<li>Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+diagnostics+for+global+health%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Point-of-care diagnostics for global health.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 10, 107-144 (2008).</li>
<li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+real-time+surveillance+of+Zika+virus+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil.</a> Genome Medicine. 8 (1), 97(2016).</li>
<li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+in+the+Americas%3A+Early+epidemiological+and+genetic+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+synthetic+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li>
<li>Duyen, T. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+colorimetric+biosensor+for+antibiotics+inhibiting+bacterial+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 123 (1), 96-100 (2017).</li>
<li>Jung, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+biosensors+for+rapid+detection+of+water+contaminants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants.</a> Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).</li>
<li>Yang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+Escherichia+coli-based+system+to+screen+for+quorum-sensing+molecules+interacting+with+quorum+receptor+proteins+of+streptomyces+coelicolor%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cell-free Escherichia coli-based system to screen for quorum-sensing molecules interacting with quorum receptor proteins of streptomyces coelicolor.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (19), 6367(2009).</li>
<li>Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+detection+of+norovirus+using+paper-based+cell-free+systems+and+synbody-based+viral+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment.</a> Synthetic Biology. 3 (1), (2018).</li>
<li>Park, S., Lee, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+coronaviruses+using+RNA+toehold+switch+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection of coronaviruses using RNA toehold switch sensors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1-13 (2021).</li>
<li>Amalfitano, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glucose+meter+interface+for+point-of-care+gene+circuit-based+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A glucose meter interface for point-of-care gene circuit-based diagnostics.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).</li>
<li>Nguyen, P. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wearable+materials+with+embedded+synthetic+biology+sensors+for+biomolecule+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection.</a> Nature Biotechnology. 39 (11), 1366-1374 (2021).</li>
<li>Pellinen, T., Huovinen, T., Karp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+biosensor+for+the+detection+of+transcriptional+inducers+using+firefly+luciferase+as+a+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A cell-free biosensor for the detection of transcriptional inducers using firefly luciferase as a reporter.</a> Analytical Biochemistry. 330 (1), 52-57 (2004).</li>
<li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+approach+to+biosensing+hTR%CE%B2-specific+endocrine+disruptors%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors.</a> Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).</li>
<li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensing+estrogenic+endocrine+disruptors+in+human+blood+and+urine%3A+A+RAPID+cell-free+protein+synthesis+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: A RAPID cell-free protein synthesis approach.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 345, 19-25 (2018).</li>
<li>Voyvodic, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plug-and-play+metabolic+transducers+expand+the+chemical+detection+space+of+cell-free+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Plug-and-play metabolic transducers expand the chemical detection space of cell-free biosensors.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).</li>
<li>Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplifying+and+streamlining+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).</li>
<li>Gräwe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paper-based%2C+cell-free+biosensor+system+for+the+detection+of+heavy+metals+and+date+rape+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs.</a> PLOS One. 14 (3), 0210940(2019).</li>
<li>Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toehold+Switches%3A+De-Novo-Designed+Regulators+of+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression.</a> Cell. 159 (4), 925-939 (2014).</li>
<li>Craw, P., Balachandran, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+nucleic+acid+amplification+technologies+for+point-of-care+diagnostics%3A+a+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2469-2486 (2012).</li>
<li>Zyrina, N. V., Antipova, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonspecific+Synthesis+in+the+Reactions+of+Isothermal+Nucleic+Acid+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Moscow%29%22%5BJournal%5D)">Nonspecific Synthesis in the Reactions of Isothermal Nucleic Acid Amplification.</a> Biochemistry (Moscow). 86 (7), 887-897 (2021).</li>
<li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost+paper-based+synthetic+biology+platform+for+analyzing+gut+microbiota+and+host+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-12 (2018).</li>
<li>Karlikow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+validation+of+the+performance+of+paper-based+tests+for+the+detection+of+the+Zika+and+chikungunya+viruses+in+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Field validation of the performance of paper-based tests for the detection of the Zika and chikungunya viruses in serum samples.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (3), 246-256 (2022).</li>
<li>Agarwala, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Database+resources+of+the+National+Center+for+Biotechnology+Information%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Database resources of the National Center for Biotechnology Information.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).</li>
<li>BLAST: Basic Local Alignment Search Tool. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> (2022).</li>
<li>Deiman, B., Van Aarle, P., Sillekens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+applications+of+nucleic+acid+sequence-based+amplification+%28NASBA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA).</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 163-179 (2002).</li>
<li>Zadeh, J. N., Wolfe, B. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+sequence+design+via+efficient+ensemble+defect+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid sequence design via efficient ensemble defect optimization.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (3), 439-452 (2011).</li>
<li>NUPACK: Nucleic Acid Package. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.nupack.org/">http://www.nupack.org/</a> (2022).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+DNA+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , Cambridge, MA. (2021).</li>
<li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic%2C+Yap+State%2C+Micronesia%2C+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerging Infectious Diseases. 14 (8), 1232(2008).</li>
<li>Walsh, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+automated+DNA+assembly%3A+Best+practices%2C+metrics%2C+and+protocols+using+robots%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Technology%22%5BJournal%5D)">Standardizing automated DNA assembly: Best practices, metrics, and protocols using robots.</a> SLAS Technology. 24 (3), 282(2019).</li>
<li>Silva, S. J. R., de Magalhães, J. J. F., de Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+circulation+of+DENV%2C+CHIKV%2C+ZIKV+and+SARS-CoV-2+in+Brazil%3A+An+inconvenient+truth%5BTitle%5D)+AND+%22One+Health%22%5BJournal%5D)">Simultaneous circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 in Brazil: An inconvenient truth.</a> One Health. 12, 100205(2021).</li>
<li>Kimura, S., Fujinaga, K., Sekiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+machine.+Tanpakushitsu+kakusan+koso%5BTitle%5D)+AND+%22Protein%2C+Nucleic+Acid%2C+Enzyme%22%5BJournal%5D)">PCR machine. Tanpakushitsu kakusan koso.</a> Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 41 (5), 514-517 (1996).</li>
<li>Arce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decentralizing+cell-free+RNA+sensing+with+the+use+of+low-cost+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Decentralizing cell-free RNA sensing with the use of low-cost cell extracts.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 727584(2021).</li>
<li>Silva, S. J. R., Pardee, K., Balasuriya, U. B. R., Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+one-step+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+%28RT-LAMP%29+for+rapid+detection+of+ZIKV+in+patient+samples+from+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li>
<li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+robust%2C+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li>
</ol>

K.P.와 A.A.G.는 종이 기반 토홀드 센서 관련 기술의 공동 발명가입니다. Y.G., S.C. 및 K.P.는 LSK Technologies, Inc.의 공동 설립자이며 PLUM 관련 기술의 공동 발명가입니다. M.K., K.P. 및 A.A.G.는 En Carta Diagnostics Ltd.의 공동 설립자입니다. 다른 저자는 이해 상충이 없습니다. 특허: PLUM 장치: Y.G., S.C. 및 KP 특허 출원은 토론토 대학교에 의해 제출되고 LSK Technologies Inc.에 양도되었습니다. 2020년 2월 27일에 출원된 미국 임시 특허 출원 번호 62/982,323; Toehold 스위치 특허: A.A.G., P.Y. 및 J.J. C. "리보레귤레이터 조성물 및 사용 방법", 특허. 2012년 11월 6일 출원된 WO2014074648A3; 종이 기반 진단 특허 : K.P. 및 J.J.C. "종이 기반 합성 유전자 네트워크"미국 특허 출원 중 No. 2013년 12월 6일에 출원된 US15/963,831; Zika 특허 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. 및 J.J.C., "휴대용, 저비용 바이러스 검출 및 균주 식별 플랫폼", 2016년 10월 4일 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/403,778호; Zika 특허 2: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. 및 J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform," 2016년 5월 25일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/341,221호.

여기에 설명된 결합된 종이 기반 시스템은 RT-qPCR과 기능적으로 유사한 성능으로 임상적으로 관련된 분자진단을 필요 시점6으로 가져올 수 있습니다. 중요한 것은 원격 설정의 경우 현장에서 진단을 사용할 수 있으므로 결과를 얻는 시간을 며칠에서 몇 시간으로 줄일 수 있다는 것입니다. 이 접근법의 프로그래밍 가능성을 강조하면서 설명 된 파이프 라인은 거의 모든 병원체 표적을 검출하는 데 사용될 수 있습니다. 우리는 분자 도구를 특수 제작된 휴대용 플레이트 리더와 페어링했으며, 이 리더는 컴팩트하고 배터리 작동(8–9시간)과 호환되며 온보드 데이터 분석을 제공하여 분산 애플리케이션을 가능하게 합니다. 다른 작업에서는 RT-qPCR과 병행하여 268개의 환자 샘플로 결합된 하드웨어 및 Zika 바이러스 진단 플랫폼을 검증했으며 98.5%24의 진단 정확도를 발견했습니다. 종합하면, 우리의 목표는 이 플랫폼의 기술 이전을 연구자에게 제공하여 충족되지 않은 진단 요구 사항을 해결하기 위해 커뮤니티에서 용도를 변경하고 개선할 수 있도록 하는 것입니다.
인실리코 토홀드 스위치 설계 프로세스는 3단계로 나눌 수 있는 파이프라인으로 통합되고 자동화되었습니다. 첫 번째 단계는 하나의 뉴클레오티드 증분으로 표적 서열에 혼성화하는 토홀드 스위치 설계 풀을 생성합니다. 두 번째 단계는 2차 구조 및 토홀드 스위치 가용성을 검사하고 프레임 내 조기 정지 코돈이 있는 센서를 제거합니다. 그런 다음 여러 요소(예: 토홀드 스위치의 결함 수준, 토홀드 스위치 가용성 및 대상 사이트 접근성)를 고려하는 스코어링 기능을 구현하여 전체 점수를 기반으로 상단 토홀드 스위치 설계를 선택합니다. 마지막 단계에서는 상단 토홀드 스위치 설계 및 해당 대상 트리거에 대한 시퀀스 목록이 생성됩니다. 상단 센서 서열은 NCBI/Primer-BLAST25를 사용하여 인간 전사체 및 밀접하게 관련된 바이러스 게놈에 대한 특이성을 스크리닝해야 합니다. 또한 Zika 바이러스 게놈에서 서열 보존을 위해 센서 표적 부위를 스크리닝하여 센서가 광범위하고 강력한 검출을 제공하도록 하는 것이 가장 좋습니다. 여러 버전의 토홀드 스위치 설계 소프트웨어가 개발되었으며 설계 알고리즘을 통해 사용자는 시리즈 A 6 또는 시리즈 B 토홀드 스위치6의 두 가지 버전을 생성할 수 있습니다. 이 기사에서는 시리즈 B 토홀드 스위치 설계에 중점을 두었습니다.
상용 DNA 합성 후, 토홀드 스위치는 신속하게 조립된 다음 표적 게놈의 짧은 영역(200-300nt)에 해당하는 합성 표적 트리거 서열에 대해 초기 스크리닝을 수행하여 테스트할 수 있습니다. 토홀드 스위치 기반 센서의 성능을 스크리닝하려면 RNA 형태로 표적 서열을 추가하는 것이 이상적입니다. 이 기사에서는 시험관 내 전사 트리거 RNA를 추가하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명했습니다. 그러나, 이용 가능한 경우, 정량화된 바이러스 RNA 추출물 또는 상업적 합성 RNA 게놈 또는 표준물질과 같은 전장 게놈 주형이 사용될 수 있다. 초기 발가락 스위치 스크리닝을 위해 전장 RNA 게놈을 사용하면 RNA 2차 구조와 같은 추가 요인이 센서 성능에 영향을 미치는지 여부를 알 수 있으므로 유용합니다. 후보 스위치의 ON/OFF 비율을 최적화하기 위해 토홀드 스위치 DNA를 무세포 반응으로 적정할 수 있습니다. 이 단계는 또한 고성능 토홀드 스위치(폴드 증폭 또는 높은 ON/OFF 비율)를 식별하고 다운스트림 특성화 단계에서 누출 토홀드 스위치(표적 RNA가 없는 경우 높은 신호)를 생략하는 역할을 할 수 있습니다.
최고 성능의 토홀드 스위치 후보의 검출 한계를 개선하기 위해 NASBA는 표적 지카 바이러스 RNA의 임상적으로 관련된 농도를 토홀드 스위치6로 검출할 수 있는 수준으로 증가시키는 데 사용됩니다. 정방향 및 역방향 프라이머 세트의 다양한 조합을 스크리닝하여 임상적으로 관련된 농도에서 검출할 수 있도록 최상의 NASBA 프라이머 및 토홀드 스위치 조합을 결정합니다. 이상적인 프라이머 세트와 발가락 스위치 조합이 확인되면 분석은 임상 검증으로 진행됩니다. 토홀드 스위치와 NASBA 스크리닝 단계는 노동력과 자원 집약적일 수 있으므로 테스트 개발은 자원이 풍부한 연구 사이트에 가장 적합하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 프로세스 자동화를 적용하지는 않았지만 반복적 인 설계, 빌드 및 테스트주기(32)를 가속화 할 수 있습니다. 다행스럽게도 센서 설계 및 테스트에서 배포까지의 소요 시간은 매우 짧을 수 있으므로(일주일 미만) 이 전략은 전염병 발생과 같이 시간이 중요한 상황에이상적입니다6.
임상적으로 관련된 감도를 가진 바이오센서가 개발된 후에도 해결해야 할 기술적 과제가 있습니다. 이 프로토콜은 수동 작동을 포함하고 다단계 절차이기 때문에 샘플 간의 교차 오염 위험이 있습니다. 우리는 신중한 실험실 실습을 통해 이러한 위험을 줄이기 위해 최선을 다합니다. 268 명의 환자 샘플에 대한 최근 임상 시험에서 우리는 오염 문제가 발생하지 않았습니다. 그러나 중요한 고려 사항입니다24. 이를 염두에두고 프로토콜은 실험실 분석으로 남아 있으며 적절한 분자 생물학 기술을 구사하는 숙련 된 사용자가 필요합니다. 배치에 대한 추가 고려 사항은 환자 샘플에서 RNA 분리입니다. 여기에서는 컬럼 기반 핵산 추출 키트를 사용한 RNA 분리에 대해 설명합니다. 그러나 다른 연구에서는 저부담 환자시료 처리를 위한 효과적이고 간단한 비등 용해 방법(95°C에서 2분)을 입증했습니다6. 이 전략은 RNA 추출과 관련된 비용을 거의 제거하고 COVID-19 대유행과 같은 위기 상황에서 자원이 부족한 환경이나 공급망 문제에서 물류 문제를 일으킬 수 있는 컬럼 기반 핵산 추출 키트의 사용을방지합니다33.
COVID-19 팬데믹 기간 동안 보았듯이 RT-qPCR을 수행하는 데 사용되는 기기 자체가 병목 현상으로 작용하고 테스트에 대한 환자의 접근을 제한할 수 있습니다. 또한 대부분 재정적인 이 요소는 진단 액세스를 제한할 수 있는 중앙 집중식 테스트 모드로 이어집니다. 예를 들어, 2015/2016 Zika 발병 기간 동안 브라질에는 5 개의 국가 참조 실험실 만 제공되어 환자 테스트가 지연되었습니다. 규모의 경제의 잠재적 이점을 고려하지 않고 휴대용 플레이트 리더의 현재 제품 비용은 ~ $ 500 USD이며, 이는 노동 및 상업 마진을 고려하여 5 배 증가하더라도 여전히 저렴한 도구를 제공합니다. 이는 $15,000-$90,000 USD34의 비용 범위의 RT-qPCR 기기와 잘 비교됩니다. 또한 라틴 아메리카의 무세포 분석에 대한 테스트당 예상 비용은 약 $5.48 USD인 반면, 브라질의 RT-qPCR 테스트당 비용은 Zika 발병 당시 ~$11-36 USD였습니다. 장비 비용 외에도 휴대용 플레이트 리더는 설치 공간이 작고(20cm3), 자동 분석, 인터넷을 통해 클라우드에 데이터 업로드가 가능하며 배터리 전원으로 실행할 수 있습니다. 이러한 기능은 테스트를 배포할 수 있는 잠재적 설정을 극적으로 확장하고 동시에 서비스를 받을 수 있는 환자 집단을 확장합니다.
현재까지 가장 일반적인 상용 대장균 CFPS 플랫폼은 S30 및 PURE 시스템37; 그러나 저소득 및 중간 소득 국가에서 진단에 대한 접근성을 개선하는 데 있어 주요 고려 사항은 이러한 시약의 제한된 국내 가용성입니다. 이 문제를 해결하기 위한 중요한 단계는 현지 CFPS 생산의 개발입니다. Federici 연구소는 최근 용해물 기반 무세포 시스템에서 토홀드 스위치 기반 센서를 구현하기 위한 비상업적 플랫폼 개발에 상당한 진전을 이루었으며, Zika 바이러스 RNA14와 함께 2.7fM LOD에 도달했습니다. 이 성과는 수입 관세 및 지연을 피하면서 사용 국가에서 시약을 만들 수있을뿐만 아니라 인건비도 현지 요율로 확장되므로 전체 비용을 크게 낮출 수 있습니다. Federici 그룹이 개괄 한 작업에서 칠레에서 CFPS 발현 반응 (5 μL)을 생산하는 비용은 6.9 센트 (USD) 35,38로 용해물 기반 시스템 35,38을 구현하기위한 이중 인센티브 (물류 및 비용 개선)를 제공했습니다.
RT-qPCR 비교 테스트를 분산 진단 네트워크에 배치하면 중앙 집중식 RT-qPCR 시설로의 샘플 운송에 의존하는 현재 관행에 비해 상당한 이점을 얻을 수 있습니다. Zika 사례가 집중된 도시 주변 환경에서 환자와 진단 시설 사이의 물리적 거리는 진단 속도를 늦추고 결과가 임상적으로 관련된 시간에 환자에게 도달하지 못할 위험을 증가시킵니다. 여기에 제시된 작업이 지식 이전을 통해 연구 커뮤니티가 인간 건강, 농업 및 환경 모니터링을위한 분산 된 생명 공학 및 휴대용 하드웨어를 만드는 데 기여할 수 있기를 바랍니다.

RT-qPCR은 뛰어난 민감도와 특이성으로 인해 임상 진단을 위한 황금 표준 기술로 남아 있습니다. 이 방법은 매우 견고하지만 온도 제어 분배 및 보관이 필요한 값 비싼 특수 장비 및 시약에 의존합니다. 이는 전 세계적으로, 특히 질병 발생 시기와 시설이 잘 갖춰진 실험실에 대한 접근이 제한된 지역에서 품질 진단의 접근성에 상당한 장벽을 제시합니다1,2. 이것은 브라질에서 2015/2016 Zika 바이러스가 발생하는 동안 관찰되었습니다. RT-qPCR 테스트를 제공할 수 있는 중앙 집중식 실험실이 5개뿐이었기 때문에 심각한 병목 현상이 발생하여 진단에 대한 액세스가 제한되었습니다. 이것은 발병 3,4로 더 심각한 영향을 받은 도시 주변 환경의 개인에게 특히 어려웠습니다. 진단에 대한 액세스를 개선하기 위한 노력의 일환으로 이 프로토콜은 리소스가 적은 설정에서 분산되고 저렴한 고용량 진단을 제공할 수 있는 잠재력을 가진 플랫폼을 보여줍니다. 그 일환으로 등온 증폭 및 합성 RNA 스위치 기반 센서를 종이 기반 무세포 발현 시스템 5,6과 결합하는 진단 발견 파이프라인이 구축되었습니다.
무세포 단백질 합성(CFPS) 시스템, 특히 대장균 기반 무세포 시스템은 환경 모니터링 7,8 에서 병원체 진단5,6,9,10,11,12에 이르기까지 광범위한 바이오센싱 애플리케이션을 위한 매력적인 플랫폼입니다. . 전사 및 번역에 필요한 구성 요소로 구성된 CFPS 시스템은 전체 세포 바이오센서에 비해 상당한 이점이 있습니다. 구체적으로, 감지는 세포벽에 의해 제한되지 않으며, 일반적으로 모듈식으로 설계되고, 생체안전하고, 저렴하고, 휴대용으로 동결건조될 수 있다. 유전자 회로 기반 반응을 종이 또는 직물과 같은 기질에 동결 건조하는 기능은 운송, 실온에서 장기 보관5, 심지어 웨어러블 기술13에 통합할 수 있습니다.
이전 연구는 E. coli cell-free 시스템을 사용하여 수은과 같은 독성 금속, 테트라 사이클린 7,14와 같은 항생제, 내분비 교란 화학 물질15,16, 히푸르 산 (hippuric acid)과 같은 바이오 마커 (17), 병원체 관련 쿼럼 감지 분자 9,18 및 코카인17 및 감마 하이드 록시 부티레이트 (GHB)와 같은 불법 물질과 같은 수많은 분석 물을 검출하는 데 사용될 수 있음을 입증했습니다.19 . 핵산의 서열 특이적 검출을 위해, 전략은 대부분 등온 증폭 기술에 결합된 스위치 기반 바이오센서의 사용에 의존해 왔다. 토홀드 스위치는 리보솜 결합 부위(RBS)와 시작 코돈을 격리하여 다운스트림 번역을 차단하는 헤어핀 구조를 포함하는 합성 리보레귤레이터(텍스트의 나머지 부분에서는 간단히 '스위치'라고도 함)입니다. 그들의 표적 트리거 RNA와의 상호작용시, 헤어핀 구조가 완화되고 리포터 개방 판독 프레임의 후속 번역이 활성화된다(20).
등온 증폭은 또한 분자 진단21로서 사용될 수 있다; 그러나, 이들 방법은 비특이적 증폭에 취약하며, 이는 특이성을 감소시킬 수 있고, 이에 따라 시험의 정확도를 RT-qPCR 22의 정확도 이하로 감소시킬 수 있다. 여기에 보고된 작업에서 스위치 기반 센서의 상류 등온 증폭은 임상적으로 관련된 핵산(펨토몰에서 아토몰까지)의 검출을 가능하게 하는 결합된 신호 증폭을 제공하는 데 사용되었습니다. 두 방법의 이러한 쌍은 또한 조합하여 높은 수준의 특이성을 제공하는 두 개의 시퀀스별 체크포인트를 제공합니다. 이 접근법을 사용하여 이전 연구는 Zika6, Ebola5, Norovirus10과 같은 바이러스뿐만 아니라 C. difficile23 및 항생제 내성 장티푸스12와 같은 병원성 박테리아의 검출을 입증했습니다. 가장 최근에는 COVID-19 대유행11,12,13에 대한 접근 가능한 진단을 제공하기 위한 노력의 일환으로 SARS-CoV-2 감지를 위한 무세포 토홀드 스위치가 입증되었습니다.
다음 프로토콜은 인실리코 바이오센서 설계에서 조립 및 최적화 단계를 거쳐 환자 샘플을 사용한 현장 검증에 이르기까지 지카 바이러스 검출을 위한 무세포 종이 기반 합성 토홀드 스위치 분석의 개발 및 검증을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 RNA 토홀드 스위치 기반 센서와 지카 바이러스 RNA에 특이적인 등온 증폭 프라이머의 인실리코 설계로 시작됩니다. 수많은 등온 증폭 방법이 존재하지만, 여기에서 핵산 서열 기반 증폭(NASBA)을 사용하여 반응에 존재하는 바이러스 RNA 표적의 농도를 증가시켜 임상적으로 유의한 민감도를 가능하게 하는 것이 입증되었습니다. 실제로 등온 증폭 방법은 일정한 온도에서 작동하는 이점이 있으므로 일반적으로 중앙 집중식 위치로 제한되는 열 순환기와 같은 특수 장비가 필요하지 않습니다.
다음으로, 중첩 확장 PCR을 통해 리포터 코딩 서열을 갖는 합성 발가락 스위치 센서를 조립하고, 합성 RNA를 사용하는 무세포 시스템에서 최적의 성능을 위해 합성 발가락 스위치 센서를 스크리닝하는 과정을 설명한다. 이 지카 바이러스 센서 세트의 경우 비색 기질인 클로로페놀 레드-β-D-갈락토피라노사이드(CPRG)를 절단할 수 있는 β-갈락토시다아제 효소를 암호화하는 lacZ 유전자를 선택하여 눈이나 플레이트 리더로 감지할 수 있는 노란색에서 보라색으로의 색상 변화를 생성합니다. 최고 성능의 합성 스위치가 확인되면 합성 RNA를 사용하여 해당 표적 서열의 핵산 서열 기반 등온 증폭을 위한 프라이머를 스크리닝하여 최상의 감도를 제공하는 세트를 찾는 프로세스가 설명됩니다.
마지막으로, 진단 플랫폼의 성능은 라틴 아메리카 현장에서 검증됩니다(그림 1). 임상 진단 정확도를 결정하기 위해, 종이 기반 무세포 분석은 환자로부터의 지카 바이러스 샘플을 사용하여 수행되고; 비교를 위해 금 표준 RT-qPCR 분석이 병행하여 수행됩니다. 비색 무세포 분석을 모니터링하기 위해 열 순환기를 사용할 수 없는 지역에서 결과를 현장에서 정량화할 수 있습니다. 휴대용, 저비용, 사용자 친화적, 다중 모드 (PLUM, 이하 휴대용 플레이트 리더라고 함)라고하는 손으로 조립 된 플레이트 리더도 여기에 소개됩니다24. 처음에는 무세포 합성 토홀드 스위치 진단을 위한 동반 장치로 개발된 휴대용 플레이트 리더는 높은 처리량 방식으로 결과를 배양하고 읽을 수 있는 접근 가능한 방법을 제공하여 사용자에게 통합된 컴퓨터 비전 기반 소프트웨어 분석을 제공합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig1v9.jpg"> 그림 1: 종이 기반 무세포 토홀드 스위치 반응을 사용하여 환자 샘플을 테스트하는 워크플로. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig1v8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>384웰 플레이트 커버 - 알루미늄</td><td>Sarstedt</td><td>95.1995</td><td>PLUM 리더에 삽입하기 전에 384웰 플레이트를 덮는 데 사용</td></tr><tr><td>384웰 플레이트 커버 - 투명</td><td>Sarstedt</td><td>95.1994</td><td>BioTek 플레이트 리더에 삽입하기 전에 384웰 플레이트를 덮는 데 사용</td></tr><tr><td>384웰 플레이트 VWR</td><td></td><td>CA11006-180</td><td>정량화를 위해 2mm 종이 기반 진단을 이 플레이트의 웰에 넣습니다</td></tr>. <tr><td>Agarose</td><td>BioShop Canada</td><td>AGA001.500</td><td>Gel 전기영동</td></tr><tr><td>BSA</td><td>BioShop Canada</td><td>ALB001.500</td><td>Whatman 여과지용 차단제</td></tr><tr><td>Cell free 반응</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800L</td><td>PURExpress</td></tr><tr><td>CPRG</td><td>Roche</td><td>10884308001</td><td>클로로페놀 red-b-D-galactopyranoside</td></tr><tr><td>일회용 멸균 생검 펀치</td><td>Integra Miltex</td><td>23233-31</td><td>384웰 플레이트에 맞는 2mm 종이 디스크를 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Thermo Scientific</td><td>K2981</td><td>체외 전사 반응</td></tr><tr><td>DNAse I Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>74104</td><td>DNase I Kit IVT RNA에서 템플릿 DNA를 제거하는 데 사용됩니다</td>.</tr><tr><td>dNTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>PCR</td></tr><tr><td>전기영동 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1704487</td><td>아가로스 젤 실행에 사용</td></tr><tr><td>겔 이미징 스테이션</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td>ChemiDoc XRS+ 이미징 시스템</td></tr><tr><td>IVT 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td>in vitro 전사 템플릿(트리거) RNA 스위치 스크리닝에 사용</td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>핵산 농도 측정에 사용됨</td></tr><tr><td>NASBA kit</td><td>Life Sciences Advanced Technologies</td><td>NWK-1</td><td>등온 증폭 반응 성분</td></tr><tr><td>Nuclease free H20</td><td>invitrogen</td><td>10977015</td><td>반응 혼합물에 첨가</td></tr><tr><td>PAGE 전기영동 시스템</td><td>Biorad</td><td>1658001FC</td><td>폴리아크릴아미드 겔 주조 및 실행에 사용</td></tr><tr><td>pCOLADuet-LacZ DNA</td><td>Addgene</td><td>75006</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.addgene.org/75006/ Phusion polymerase/reactioin buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>PCR</td></tr><tr><td>플레이트 리더</td>에 사용 <td>BioTek</td><td>BioTek NEO2</td><td>다중 모드 플레이트 리더, Synergy Neo2</td></tr><tr><td>프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>맞춤형 올리고 합성</td></tr><tr><td>Q5 중합효소/ 반응 완충액</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491L</td><td>PCR에 사용</td></tr><tr><td>Qiagen PCR Puriifcation Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td></tr><tr><td>RNA loading dye</td><td>New England Biolabs</td><td>B0363S</td><td>2X RNA loading dye</td></tr><tr><td>RNA purification Kit</td><td>QIAGEN</td><td>EN0521</td><td>QIAamp Viral RNA extraction kit</td></tr><tr><td>RNase inhibitor</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314S</td><td>RNase A, B 및 C의 오염을 방지하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>RT-qPCR 키트</td><td>QIAGEN</td><td>208352</td><td>QuantiNova 프로브 RT-PCR 키트</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>Invitrogen S11494</td><td>S11494</td><td>PAGE 핵산용 겔 염색</td></tr><tr><td>TAE Buffer</td><td>BioShop Canada</td><td>TAE222.4</td><td>Gel 전기영동 버퍼</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4484073</td><td>온도 사이클링 및 인큐베이팅 반응에 사용</td></tr><tr><td>Whatman 42 여과지</td><td>GE Healthcare</td><td>1442-042</td><td>종이 기반 진단을 위한 분자 구성 요소를 삽입하는 데 사용됩니다</td></tr></tbody></table>.

종이 기반 토홀드 스위치 진단의 개발 및 환자 검증을 위한 설계-구현 연구

Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

테스트를 위해 커뮤니티에 배포할 수 있는 저부담 분자 진단에 대한 접근이 점점 더 중요해지고 있으며 사회의 웰빙과 경제적 안정에 의미 있는 광범위한 영향을 미칩니다. 최근 몇 년 동안 신속하고 저렴한 분자 진단의 필요성을 충족시키기 위해 몇 가지 새로운 등온 진단 방식이 등장했습니다. 우리는 모기 매개 Zika 및 chikungunya 바이러스에 대한 진단을 포함하여 발가락 스위치 기반 진단의 개발 및 환자 검증을 통해 이러한 노력에 기여했으며, 이는 금 표준 역전사-정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 기반 분석에 필적하는 성능을 제공했습니다. 이러한 진단은 개발 및 제조 비용이 저렴하며 리소스가 부족한 환경에 진단 용량을 제공할 수 있는 잠재력이 있습니다. 여기서 프로토콜은 Zika 바이러스 검출을 위한 스위치 기반 분석의 개발에 필요한 모든 단계를 제공합니다. 이 기사는 단계별 진단 개발 프로세스를 통해 독자를 안내합니다. 첫째, Zika 바이러스의 게놈 서열은 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 후보 스위치의 계산 설계를 위한 입력 역할을 합니다. 다음으로, 합성 RNA 서열을 이용한 경험적 스크리닝 및 진단 민감도의 최적화를 위한 센서의 조립이 도시된다. 완료되면 RT-qPCR 및 특수 제작된 광학 리더인 PLUM과 병행하여 환자 샘플을 사용하여 검증을 수행합니다. 이 작업은 인간 건강, 농업 및 환경 모니터링에 적용되는 저비용 토홀드 스위치 기반 센서 개발을 위한 기술 로드맵을 연구자에게 제공합니다.

전산 설계 파이프라인에 이어 3개의 토홀드 스위치의 구성은 PCR에 의해 수행되었습니다. PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 분석하였다(도 2). 대략 발가락 스위치에 결합 된 lacZ 유전자의 크기 인 약 3,000bp의 명확한 밴드의 존재는 일반적으로 성공적인 반응을 나타냅니다. 또는 밴드가 없는 레인, 다중 밴드 또는 잘못된 크기의 밴드는 실패한 PCR을 나타냅니다. 실패한 PCR의 경우, 반응 조건 및/또는 프라이머 서열이 최적화되어야 한다.
조립된 토홀드 스위치를 스크리닝하여 각각의 시험관 전사된 트리거 RNA에 대해 각 센서를 평가했습니다(그림 3). 3개의 센서 모두 증가된 OD570 흡광도를 나타냈지만, 스위치 27B(그림 3A)가 가장 빠른 온레이트를 보였다. 스위치(33B) 및 그보다 덜한 정도로, 47B는 표적 트리거 RNA의 부재 하에서 증가된OD570 흡광도를 나타냈으며, 이는 이들 스위치가 일부 배경 활성 또는 누출을 갖는다는 것을 나타내고(도 3B,C) - 특이성을 감소시킬 수 있기 때문에 후보 센서에서 원하지 않는 특성이다. ON/OFF 신호 비율이 가장 높은 센서를 보다 명확하게 식별하기 위해 OD570 흡광도의 접힘 변화를 계산하고(추가 정보 섹션 5 참조) 플로팅했습니다(그림 4). 이 분석에서 스위치 27B는 약 60의 ON/OFF 비율로 최고의 성능을 가진 센서임이 분명합니다.
이어서, 최고 성능의 토홀드 스위치(27B)의 감도는 NASBA 반응과 결합될 때 토홀드 스위치를 활성화하는데 필요한 최저 RNA 농도를 결정함으로써 평가되었다. 그래프는 최고 성능의 Zika 센서가 μL 당 1.24 분자 (~ 2 aM에 해당)의 낮은 농도에서 RNA를 감지 할 수 있음을 보여줍니다. 그림 5).
스위치 27B가 식별되고 검증된 후, 센서 재료는 브라질 페르남부쿠 주의 헤시피에 있는 팀원들에게 배포되었습니다. 브라질에서는 비교를 위해 RT-qPCR과 병행하여 지카 바이러스 환자 샘플을 사용하여 지카 바이러스 진단 플랫폼의 임상 진단 정확도를 평가했습니다. 종이 기반 Zika 진단 플랫폼을 검증하기 위해 종이 기반 센서의 비색 출력을 배양하고 읽을 수 있는 휴대용 플레이트 리더가 사용되었습니다. 노란색에서 보라색으로의 색상 변화는 양성 샘플을 식별하는 데 사용되며 음성 샘플은 노란색으로 유지됩니다(그림 6). 휴대용 플레이트 리더(그림 8)에서 생성된 결과를 시각화하기 위한 추가 옵션은 시간 경과에 따른 각 종이 기반 반응에 대한 비색 반응을 플로팅하는 것입니다. 샘플은 삼중으로 테스트되었으며 임계 값 (빨간색 선이 1로 설정됨)을 초과하는 샘플은 양성으로 간주되었으며 임계 값 미만의 샘플은 음성으로 간주되었습니다 (그림 6 및 그림 7).
마지막으로, 지카 토홀드 스위치 센서의 임상 성능을 지카 바이러스 감염 진단을 위한 현재의 황금 표준 방법과 평가하고 비교하기 위해 모든 환자 샘플을 RT-qPCR과 병행하여 테스트했습니다. 두 개의 대표적인 환자 샘플의 증폭 플롯을 RT-qPCR에 의한 지카 바이러스의 검출을 위해 삼중으로 시험하였다(도 9). 샘플은 주기 역치(Ct) 값이 ≤38일 때 양성으로 간주됩니다. 빨간색 선은 양성 샘플을 나타내고 파란색 선은 Zika 바이러스에 대한 음성 샘플을 나타냅니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig2v6.jpg"> 그림 2: PCR 산물의 품질을 평가하기 위한 아가로스 겔 전기영동. PCR 산물은 1X TAE의 1% 아가로스 겔에서 분석되고 80V에서 90분 동안 실행됩니다. 단일 클리어 밴드는 일반적으로 성공적인 반응을 나타냅니다. 레인 1: 1 kb DNA 사다리; 레인 2-4: 각각 27B 스위치 DNA, 33B 트리거 DNA, 및 47B 트리거 DNA. 왼쪽의 숫자는 bp 단위의 밴드 크기를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6.jpg"> 그림 3: 종이 기반 Zika 센서를 위한 3개의 토홀드 스위치 프로토타이핑. 3개의 종이 기반 RNA 토홀드 스위치 센서의 성능을 37°C에서 130분 이상 측정했습니다. 각 그래프에는 두 개의 추적이 포함되어 있으며, 하나는 스위치 전용 컨트롤을 나타내고 다른 하나는 스위치 및 트리거를 나타냅니다. 3개의 그래프는 토홀드 스위치 센서(27B(A), 33B(B) 및 47B(C)를 사용하여 획득된 데이터를 나타낸다. 오차 막대는 세 번의 반복실험에서 평균(SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig04v7.jpg"> 그림 4: 최고 성능의 센서는 570nm에서 흡광도의 접힘 변화를 계산하여 식별됩니다. 폴드 변화(또는 최대 ON/OFF 비율)는 스위치 전용 제어와 스위치 플러스 트리거 CFPS 분석 사이의 130분에서 흡광도(OD570)의 비율을 측정하여 계산됩니다. 오차 막대는 세 번의 반복실험에서 얻은 SEM을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig4v8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig05v7.jpg"> 그림 5: 최고 성능의 스위치의 민감도 평가. 시험관내 전사된 지카 RNA는 NASBA 반응으로 적정됩니다. 1시간 배양 후, 반응물을 종이 디스크의 무세포 PURExpress 반응에 1:7의 비율로 첨가했습니다. 37°C에서 130분 후의 폴드 변화가 플롯팅된다. 이 수치는24에서 재현되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig05v4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig6v9.jpg"> 그림 6: 캡처된 이미지 데이터가 로드된 휴대용 플레이트 판독기 캡처 페이지. 이 그림은 데이터 수집 실행 중에 휴대용 플레이트 판독기로 캡처한 최종 이미지의 샘플 그림을 보여줍니다. 원래 날짜/시간 스탬프가 이미지 상단에 표시됩니다. 노란색은 대조군 또는 음성 반응을 나타내고 보라색은 긍정적 인 반응을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig6v8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig7v9.jpg"> 그림 7: 데이터 분석 모드 왼쪽에서 사용자는 플롯하려는 데이터 세트를 선택합니다. 그런 다음 그래프가 각 샘플 또는 컨트롤 세트에 대해 고유한 색상으로 오른쪽에 표시됩니다. 빨간색 점선은 양성 및 음성 샘플을 결정하기 위한 임계값 역할을 합니다. 임계값을 초과하는 삼중 테스트된 샘플은 양성으로 간주되고 임계값 미만의 샘플은 음성으로 간주됩니다. 오차 막대는 세 번의 반복실험에서 표준 편차(SD)를 나타냅니다. Ctrl 1에서 Ctrl 5는 컨트롤을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig7v8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8.jpg"> 그림 8. PLUM, 휴대용 플레이트 리더. 이 휴대용 플레이트 리더는 실험실 인 어 박스 역할을 하며 비색 반응을 배양하고 모니터링하기 위한 온도 제어 플레이트 리더 역할을 합니다. 이 휴대용 장치는 현장에서 종이 기반 Zika 센서의 정량적 및 높은 처리량 측정을 제공할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig9v9.jpg"> 그림 9: 지카 바이러스 검출을 위해 삼중으로 테스트된 두 환자 샘플의 증폭에 대한 RT-qPCR 플롯. 샘플은 주기 임계값(Ct) 값이 ≤38일 때 양성으로 간주됩니다. 빨간색 점선은 양성 및 음성 샘플을 결정하기 위한 임계값 역할을 합니다. 빨간색 트레이스는 양성 샘플을 나타내고 파란색 트레이스는 음성 샘플을 나타냅니다. ΔRn(델타 Rn) 값은 테스트된 모든 샘플에 대해 RT-qPCR 기기에 의해 검출된 형광 신호의 정규화된 크기를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig9v8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 프로토콜 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplementary_protocol_R2_RE_KJ.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 수치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">이 수치를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

분산 테스트를 위해 커뮤니티에 배포할 수 있는 분산형, 저비용 및 고용량 진단에 대한 액세스는 글로벌 보건 위기에 대처하는 데 매우 중요합니다. 이 원고는 휴대용 광학 판독기로 검출할 수 있는 바이러스 RNA 서열에 대한 종이 기반 진단을 구축하는 방법을 설명합니다.

Access to low-burden molecular diagnostics that can be deployed into the community for testing is increasingly important and has meaningful wider ...

우리의 프로토콜은 유전자 회로 기반 진단의 설계, 조립 및 검증을 설명합니다. 이러한 종이 기반 분자 진단은 비용이 저렴하고 민감하여 임상적으로 관련된 핵산 농도를 검출할 수 있으며 거의 모든 서열을 검출하도록 설계할 수 있습니다. 이것은 사용자가 필요에 맞게 설계할 수 있는 플랫폼 기술이며 임상 등급 진단을 보다 분산된 치과 리소스 설정으로 가져올 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.무세포 토홀드 스위치 센서는 거의 모든 핵산 기반 표적에 맞게 설계할 수 있습니다. 최근 연구에서는 에볼라, 노로 바이러스, SARS-CoV-2, C.difficile 및 장티푸스 유발 박테리아에 대한 무세포 진단이 입증되었습니다. 이 절차를 시연하는 것은 박사후 연구원 인 Severino Jefferson Rivero da Silva와 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Pouriya Bayat입니다.토홀드 스위치를 설계하려면 지카 바이러스 게놈에서 표적 서열을 식별하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 앰플리콘에서 지카 바이러스 표적 서열을 선택합니다. 토홀드 스위치 설계 소프트웨어 패키지를 다운로드하십시오. MATLAB을 열고 설계 소프트웨어 폴더로 이동합니다.입력 하위 폴더에 있는 설계 입력 파일 csv 파일에 대상 시퀀스를 입력합니다. 설계 기능에 사용할 모수를 선택합니다. 설계 함수를 실행하여 관심 대상에 대한 토홀드 스위치 설계를 생성합니다.완료되면 final_designs 폴더로 이동하여 csv 형식 스프레드시트에서 상단 토홀드 스위치 설계 시퀀스와 해당 대상 시퀀스를 찾습니다. 알고리즘에 의해 생성된 토홀드 스위치 DNA 서열이 5개의 프라임 말단에 T7 프로모터 서열을 포함하고 3개의 프라임 말단에 보존된 21개의 뉴클레오티드 링커 서열을 포함하는지 확인합니다. NCBI BLAST를 사용하여 서열 상동성을 검사하여 다른 일반적인 바이러스에 대해 상단 발가락 스위치 설계 시퀀스를 스크리닝합니다.40% 미만의 혈액학을 가진 시퀀스를 허용합니다. 토홀드 스위치 헤어핀 DNA 올리고 및 역증폭 프라이머의 용액을 뉴클레아제가 없는 물에서 10마이크로몰 농도로 준비합니다. 이 표에 따라 얼음 위의 PCR 튜브에서 반응을 조립하십시오.이 표에 나열된 사이클링 조건에 따라 반응 튜브를 열순환기에 놓습니다. 아가로스 겔에서 PCR 산물을 분석합니다. PCR 산물을 정제하고 충분히 높은 농도를 보장하기 위해 최소한의 뉴클레아제가 없는 물에서 DNA를 용리합니다.분광 광도계를 사용하여 DNA를 정량화합니다. 뉴클레아제가 없는 물 1밀리리터에 분말 25mg을 용해시켜 CPRG 스톡 용액을 준비합니다. 여기에 표시된 표준 프로토콜에 따라 얼음 위에 마스터 믹스를 준비하십시오.무세포 마스터 믹스를 PCR 튜브에 분주합니다. 무세포 대조군 및 스위치 단독 대조군의 경우, 뉴클레아제가 없는 물을 5.94마이크로리터의 부피에 첨가하십시오. 그리고 반응을 위해 PCR 정제 된 토홀드 스위치 DNA를 추가하여 최종 농도 33 나노 몰을 얻습니다.토홀드 스위치와 표적 RNA 조합을 테스트하려면 시험관내 전사된 표적 RNA를 1마이크로몰의 최종 농도로 추가합니다. 피펫팅과 원심분리기로 모든 반응을 완전히 혼합합니다. 바닥이 있는 검은색 투명 384웰 플레이트에 반응 웰을 둘러싼 웰에 30마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다.그런 다음 2mm 생검 펀치와 핀셋을 사용하여 BSA 차단 여과지 디스크를 잘라 반응 웰에 넣습니다. 각 반응 튜브에서 1.8마이크로리터를 384웰 플레이트의 여과지 디스크에 삼중으로 분주합니다. 플레이트를 투명 PCR 필름으로 덮고 플레이트 리더에 넣습니다.570 나노 미터에서 130 분 동안 매분 섭씨 37도에서 흡광도를 측정합니다. 뉴클레아제가 없는 물에서 모든 정방향 및 역방향 프라이머 세트의 25 마이크로몰 스톡 용액을 준비합니다. 여기에 표시된 마스터 믹스를 사용하여 5마이크로리터 반응을 설정합니다.흰색 침전물이 용해될 때까지 피펫팅하여 혼합한 다음 PCR 튜브에 분주합니다. 정방향 및 역방향 프라이머를 적절한 튜브에 추가한 다음 뉴클레아제가 없는 물 1마이크로리터 또는 표적 트리거 RNA의 피코몰 2개를 추가합니다. 부드러운 피펫팅으로 혼합하고 튜브를 짧게 회전시킵니다.여기에 표시된 대로 열순환기에서 배양 프로토콜을 설정합니다. 12분 후, 튜브를 제거하고 각 튜브에 1.25마이크로리터의 효소 혼합물을 첨가한 다음, 혼합 및 원심분리한다. 섭씨 41도 유지 단계를 건너뛴 후 튜브를 열순환기로 되돌려 1시간 반응 배양을 시작합니다.그런 다음 프라이머 성능을 평가하기 위해 종이 기반 무세포 토홀드 스위치 반응을 조합하고 데이터를 분석합니다. 민감도 분석을 위해 후보 프라이머 쌍을 식별하고 뉴클레아제가 없는 물에서 표적 RNA의 연속 희석을 준비합니다. NASBA 및 무세포 반응을 생물학적 삼중으로 선택된 프라이머 세트로 반복합니다.추출된 환자 RNA 1마이크로리터를 사용하여 섹션 5와 같이 NASBA 증폭 및 종이 기반 무세포 반응을 수행합니다. 반응 후 384웰 반응 플레이트를 준비하고 섭씨 37도의 휴대용 플레이트 판독기에서 분석을 실행합니다. 그런 다음 RT-qPCR 구성 요소를 조립하고 이 표에 따라 시약을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다.피펫팅으로 반응물을 혼합합니다. 96웰 또는 384웰 PCR 플레이트의 각 웰에 6.5마이크로리터를 분주한 다음 각 RNA 주형을 3.5마이크로리터씩 삼중으로 분주합니다. 플레이트 위에 PCR 필름을 놓습니다.384-웰 플레이트를 600배 G에서 2분 동안 원심분리한다. 플레이트를 RT-qPCR 기계에 놓고 여기에 표시된 대로 사이클링 조건을 실행합니다. 계산 설계에 따라 3개의 토홀드 스위치를 구성하고 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 분석했습니다.약 3, 000 개의 염기쌍 밴드가 성공적인 반응을 나타 냈습니다. 발가락 스위치를 각각의 시험관내 전사된 트리거 RNA에 대해 평가하였다. 3개의 센서 모두 흡광도의 증가를 나타냈지만, 센서(27B)는 가장 빠른 온 속도를 보인 반면, 스위치(33B, 47B)는 배경 활동을 나타내는 온/오프 비율이 낮고 특이성이 감소하였다.570나노미터에서 흡광도의 배변화는 스위치(27B)가 온/오프 신호비에서 최고의 성능을 갖는다는 것을 보여주었다. 또한 NASBA와 결합하면 마이크로 리터당 124 분자의 낮은 농도에서 RNA를 검출 할 수있어 높은 감도를 나타냅니다. 브라질로부터의 지카 바이러스 환자 샘플을 휴대용 플레이트 리더를 사용하여 센서의 임상 진단 정확도를 평가하기 위해 시험하였다.노란색에서 보라색으로의 색상 변화는 양성 샘플을 식별했습니다. 각 종이 기반 반응에 대한 비색 반응은 PLUM 휴대용 플레이트 리더의 통합 소프트웨어에 의해 시간이 지남에 따라 표시되었습니다. 임계 값을 초과 한 샘플은 양성으로 간주되었습니다.센서의 임상 성능은 RT-qPCR과 비교하여 확립되었습니다. 샘플은 주기 임계값이 38 이하일 때 양성으로 간주되었습니다. 환자 시험을 진행하기 전에 토홀드 스위치 스크린과 NASBA 프라이머 감도의 결과를 재현 가능하고 최적화하는 것이 중요합니다.단순성과 적응성을 감안할 때 여기에 설명된 진단 플랫폼은 특히 저소득 국가의 의료 시스템에 이점을 제공할 수 있는 새로운 현장 진료 도구 개발을 위한 길을 열었습니다.

design-to-implementation-study-for-development-patient-validation

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

촉각 자동 수동 - 손가락 자극기 (탭) : 우리는 터치의 감각을 조사를위한 컴퓨터 제어 장치를 설명합니다. 우리는 도청 장치의 구성 요소를 설명하고, 도청 장치가 두 간격 강제 선택 촉각 격자 방향 테스트를 관리하는 데 사용됩니다 방법을 보여줍니다.

촉각 자동 수동 - 핑거 자극기 (탭)

미세 바이오 센서 플랫폼 설계 및 다양 한 analytes의 신속 하 고 민감한 정량화에 대 한 낮은 비용 드라이 필름 포토 레지스트 기술을 사용 하 여 조작. 이 단일 사용 시스템 중지 흐름 기술에 의하여 효소 연결 된 분석 실험에-칩-움직일의 전기 판독을 허용합니다.

드라이 필름 포토 레지스트 기반 전기 화학 미세 바이오 센서 플랫폼: 장치 제작, 온 칩 시험 준비 및 시스템 운영

여기, 선물이 스트로크 (고양이-FAS)의 기능 평가의 전산화 적응 테스트 시스템을 개발 하는 프로토콜. 고양이-FAS 충분 한 안정성 및 관리 효율성과 동시에 4 개의 기능 (두 모터 기능 [위와 더 낮은 사지], 자세 제어, 및 일상 생활의 기본 활동)를 평가할 수 있습니다.

뇌졸중의 기능 평가의 전산화 적응 테스트 시스템

이 예심의 목적은 대장 내시경 검사 전에 환자 준비를위한 도구로 온라인 컴퓨터 기반 교육의 위치를 확립하는 것입니다. 컴퓨터 기반 교육은 간호, 간호사 상담, 내시경 품질 측정 및 환자 관련 결과 측정평가의 표준과 비교됩니다.

전자 환자 상담 재판 (E-PACO): 대장 내시경 검사를 준비하는 환자를위한 컴퓨터 기반 교육 대 간호사 상담

제시된 프로토콜은 다양한 평가 방법을 통합하고 스마트폰에서 키보드 디자인을 평가하는 방법을 보여줍니다. 영어 문자와 일치하는 쌍은 입력 재질로 제안되며 두 키 간의 전환 시간은 종속 변수로 사용됩니다.

스마트폰에서 키보드 디자인을 평가하는 평가 방법 및 툴킷

우리의 목적은 epimysial electromysial electromyography 전극의 제조 및 테스트에 대한 업데이트되고 따라하기 쉬운 가이드를 제공하는 것이었습니다. 이를 위해 재료 소싱에 대한 지침과 제조 및 테스트 프로세스에 대한 자세한 안내를 제공합니다.

저비용 Epimysial Electromysial Electromyography Electroode 개발: 제조 및 테스트를 위한 간소화된 워크플로우

생리학 및 병리 학적 압력 조건에 심장 밸브 조직을 쓰는 수있는 순환 압력 생물 반응기는 설계되었습니다. LabVIEW 프로그램은 사용자가 압력 크기, 진폭 및 주파수를 제어할 수 있습니다. 이 장치는 심장 밸브 조직이나 격리 세포의 mechanobiology을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

우리는 식물에서 단일 클론 항체와 리포터 단백질의 과도 발현 유전자 조절 요소, 식물의 성장과 발달 파라미터 및 배양 조건의 영향을 결정하고 모델링하는 데 사용될 수있는 실험 방법의 설계를 설명한다.

사례 연구로 담배에 과도 단백질 발현 : 실험 접근의 디자인을 사용하여 복잡한 시스템의 특성

이 프로토콜은 적게 10 μL의 혈청 샘플에서 세포 외 소체 (전기 자동차), 셀로부터 방출 멤브레인 작은 입자를 분리하는 방법을 자세히 설명. 이 접근법은, 초 원심 분리의 필요성을 회피 분석 시간의 몇 분을 필요로하고, 제한된 양의 시료로부터 전기차의 분리를 가능하게한다.

세포 외 소포의 분리 및 특성에 대한 종이 기반의 장치

여기, 모듈형 DNA "장치" 어셈블리 액체 처리 로봇에 모듈형 복제 DNA 어셈블리 메서드를 사용 하 여 수행 하는 자동화 된 워크플로 제공 됩니다. 프로토콜 조합 DNA 장치 라이브러리 생성, 우리는 두 액체 처리 플랫폼을 사용 하 여 설명 하는 액체 처리기 선택 목록 생성 하기 위한 소프트웨어 도구를 사용 합니다.

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

학습하세요 종이 기반 토홀드 스위치 진단법을 활용한 바이러스 RNA 검출 기술입니다. 이 방법은 분자생물학적 도구를 사용하여 민감하고 특이적인 현장 진단을 가능하게 하며, 자원이 제한된 지역에서 임상급 검사 접근성을 높입니다.

종이 기반 토홀드 스위치 진단의 개발 및 환자 검증을 위한 설계-구현 연구

더 많은 동영상 탐색