Name: Acinetobacter baumannii O 결합 글리코 펩타이드의 확인을위한 개방형 검색 기반 접근법의 적용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 학습하세요 Acinetobacter baumannii의 O-결합 글리코펩타이드 확인을 위한 개방형 검색 기반 프로토콜. STB-RPS 추출 및 ZIC-HILIC 농축을 활용하여 세균 당화 이벤트를 효율적으로 식별하는 방법을 익히세요.

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N.E.S는 Australian Research Council Future Fellowship (FT200100270) 및 ARC Discovery Project Grant (DP210100362)의 지원을 받습니다. MS 계측에 대한 액세스를 위해 Bio21 분자 과학 및 생명 공학 연구소의 멜버른 질량 분광법 및 프로테오믹스 시설에 감사드립니다.

참고: 박테리아 글리코펩타이드 샘플의 준비 및 분석은 네 개의 섹션으로 나눌 수 있습니다(그림 1). 본 연구를 위해, 세 개의 서열화된 A. baumannii 균주의 글리코실화를 평가하였다(표 1). 이들 균주 각각의 프로테옴 FASTA 데이터베이스는 Uniprot를 통해 액세스할 수 있다. 이 프로토콜에 사용되는 완충제의 조성에 대해서는 표 2 를 참조한다.
1. 프로테오믹 분석을 위한 단백질 시료의 제조
<ol><li>관심있는 프로테옴 샘플의 분리<ol>
<li>전체 세포를 사용하는 경우, 세포가 배지에 존재하는 잠재적인 단백질 오염물을 제거하기 위해 인산완충식염수(PBS)로 세척되었는지 확인하십시오. 세척 후 전체 세포를 스냅-동결시키고 필요할 때까지 -80°C에서 보관한다.</li>
		<li>분획된 샘플(예: 막 제제)이 사용되는 경우, 사용된 시약이 하류 액체 크로마토그래피 MS(LC-MS) 분석(50)을 방해하지 않도록 보장한다.</li>
		<li>소듐 도데실 설페이트 (SDS), 트리톤 X-100, NP-40 또는 라우로일사르코신과 같은 세제가 사용되었다면, 아세톤 침전, SP3 샘플 제조 방법51 또는 S-트랩52와 같은 상업적 프로테오믹 클린업 컬럼을 사용하여 이들 세제를 제거한다. 대안으로, 호환되지 않는 세제를 MS 호환 또는 탈착식 세제(예: 소듐 데옥시콜레이트(SDC) 또는 옥틸 글루코피라노사이드)로 대체하십시오.</li>
		<li>샘플 준비에 사용되는 모든 플라스틱 제품 및 유리 제품이 오토클레이브되지 않았는지 확인하십시오. 오토클레이브 유리 제품 및 플라스틱은 일반적으로 MS 내에서 쉽게 검출되는 폴리머와 같은 작은 분자량 화합물로 심하게 오염됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전체 세포 샘플의 가용화<ol>
<li>세척, 스냅-냉동 세포의 ∼10 mg을 갓 제조된 소듐 데옥시콜레이트 용해 완충액 200 μL에 재현탁시킨다(SDC 용해 완충액: 100 mM 트리스, pH 8.5 중의 4% SDC). 참고: 프로테아제 억제제는 단백질 분해를 제한하기 위해 SDC 용해 완충액에 첨가될 수 있다.</li>
		<li>샘플을 95°C에서 10분 동안 진탕(열믹서 상에서 2000 rpm)으로 끓인 다음, 10분 동안 얼음 위에 두어라. 샘플의 효율적인 용해 및 가용화를 보장하기 위해이 과정을 두 번 반복하십시오. 참고: 샘플은 -80°C에서 이 시점에서 장기간 보관할 수 있습니다. 보관하는 경우, 추가 처리 전에 95°C에서 가열하여 재가용화한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>비신코닌산(BCA) 단백질 분석법53을 사용하여 샘플 단백질 농도를 정량한다. 단백질 분해를 제한하기 위해 정량화를 수행하는 동안 샘플을 얼음에 보관하십시오. 참고: 총 프로테옴 분석의 경우, 20-100 μg의 단백질이 나노LC-MS에 충분하며, 이는 일반적으로 분석 당 2 μg 미만의 단백질 소화를 필요로 한다. 과량의 펩티드의 제조는 깊은 프로테오믹 커버리지가 필요한 경우 복제 분석 또는 추가 분획화를 허용한다. 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC)를 이용한 글리코펩티드 농축 기반 분석을 위해서는 100-500 μg의 단백질이 필요하다.</li>
	<li>샘플을 감소시키고 알킬화하십시오.<ol>
<li>1x의 최종 농도에 대한 샘플에 10x 환원/알킬화 완충액 (100 mM 트리스 2-카르복시에틸포스핀 하이드로클로라이드; 1 M 트리스, pH 8.5 중 400 mM 2-클로로아세트아미드)의 부피의 1/10을 첨가하고, 샘플을 1,500 rpm에서 진탕하면서 45°C에서 30분 동안 어둠 속에서 인큐베이션한다. 참고: 10x 환원/알킬화 완충액의 pH를 확인하여 pH가 낮을수록 SDC가 침전되기 때문에 샘플에 추가하기 전에 약 7.0-8.0의 pH를 확인하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플을 간단히 스핀 다운하고 프로테아제 트립신 / Lys-C (~ 10 μL, 100 mM 트리스, pH 8.5에 재현탁)를 첨가하여 최종 프로테아제 : 단백질 비율 1:100. 소화물을 1,500 rpm (최대 18 h)에서 진탕하면서 37°C에서 밤새 인큐베이션한다. 완전한 단백질 소화를 보장하려면 트립신/Lys-C 프로테아제:단백질 비율 1:50~1:200을 사용하십시오.</li>
	<li>담금질은 1.25 부피의 100% 이소프로판올을 샘플에 첨가하여 소화한다. 샘플을 1 분 동안 소용돌이 치며 혼합하고 간단히 회전시킵니다. 참고: 샘플은 -20°C에서 저장하여 나중에 추가로 처리할 수 있습니다.</li>
	<li>0.115 부피의 10% 트리플루오로아세트산 (TFA; ~1% TFA의 최종 농도)을 첨가하여 샘플을 산성화시키고, 샘플을 와류하고, 간단히 스핀다운시킨다.</li>
</ol>2. 프로테옴 샘플의 처리
<ol><li>프로테옴 샘플의 펩티드 정리<ol>
<li>앞서 기술한 바와 같이 각 샘플에 대해 하나의 스티렌디비닐벤젠-역상 설포네이트(SDB-RPS) 스톱-앤고-추출(Stage) 팁을 준비한다(54).<ol>
<li>경험적으로, 50 μg의 펩티드 결합을 위해, 무딘 바늘 (14 G)을 사용하여 47mm2 SDB-RPS 막으로부터 3개의 SDB-RPS 디스크를 절제한다. 펩티드 양이 더 많으면 그에 따라 디스크 수를 늘리십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>SDB-RPS 스테이지 팁을 사용하기 전에, 다음 버퍼의 적어도 열 베드 부피를 순차적으로 첨가하고, 원심분리(25°C, 3분, 500 × g)에 의해 컬럼을 통해 버퍼를 방사하거나, 주사기를 사용하여 부드럽게 압력을 가하여 컬럼을 통해 버퍼를 밀어서 팁을 준비한다.<ol>
<li>팁을 100% 아세토니트릴의 150μL로 적시십시오.</li>
			<li>팁을 150 μL의 30% 메탄올, 18.2 MΩH2O 중의 1% TFA로 세척한다.</li>
			<li>팁을 150μL의 90% 이소프로판올, 18.2MΩH2O로 평형을 이루는 1% TFA로 평형을 이룹니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>샘플(50% 이소프로판올, 1% TFA 함유)을 원심분리(25°C, 3분, 500 × g)로 SDB-RPS 스테이지 팁 상에 로딩하거나 주사기를 사용하여 압력을 부드럽게 가하여 로딩한다.</li>
		<li>SDB-RPS 스테이지 팁을 원심분리(25°C, 3분, 500 × g)로 세척하거나 주사기를 사용하여 압력을 부드럽게 가하여 다음 버퍼로 세척합니다. 참고: 추가 세척 또는 대체 완충액을 사용하여 이소프로판올55 대신 에틸 아세테이트를 사용하는 것과 같은 비펩타이드성 오염물질을 제거할 수 있습니다.<ol>
<li>팁을 150 μL의 90% 이소프로판올, 1% TFA로 세척한다.</li>
			<li>팁을 18.2MΩH2O중의 1% TFA의 150 μL로 세척한다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>SDB-RPS 스테이지 팁으로부터 펩티드를 원심분리에 의해 80% 아세토니트릴 중의 5% 수산화암모늄 150 μL로 희석하거나 주사기를 사용하여 부드럽게 압력을 가함으로써 분리한다. 개별 튜브에서 샘플을 수집합니다. 참고: 흄 후드 내에서 사용하기 직전에 플라스틱 용기에 80% 아세토니트릴로 5% 수산화암모늄을 준비하십시오.</li>
		<li>용출된 펩티드를 25°C에서 진공 원심분리하여 건조시킨다. 참고: HILIC 농축을 수행하는 경우, 이 시점에서 펩티드 용출액의 1-10%를 제거하고, 건조시키고, 총 프로테옴 입력 대조군으로 사용할 수 있다.</li>
	</ol></li>
	<li>글리코펩티드 샘플의 농축<ol>
<li>앞서 기술한 바와 같이 Zwitterionic 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(ZIC-HILIC) 스테이지 팁(54,56)을 준비한다.<ol>
<li>간단히 말해서, 무딘 바늘 (14G)을 사용하여 47 mm2C8 멤브레인에서 하나의C8 디스크를 절제하고 디스크를P200 팁에 포장하여 프릿을 만듭니다. 주사기를 사용하여 부드럽게 압력을 가하여 프릿에 50% 아세토니트릴, 50% 18.2MΩH2O에 재현탁한 약 5mm의 ZIC-HILIC 재료를 프릿에추가합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ZIC-HILIC 스테이지 팁을 사용하기 전에, 다음 버퍼를 순차적으로 첨가하고 주사기를 사용하여 부드럽게 압력을 가하여 수지를 조절하십시오. 참고: ZIC-HILIC 수지 표면의 의사 물층의 무결성을 보장하려면(글리코펩티드를 풍부하게 하기 위해 필요함), 수지는 항상 젖은 상태로 유지되어야 합니다. 수지를 세척 할 때 항상 ~ 10μL의 용매를 수지 위에 놓고 세척 / 샘플이이 잔류 용매에 직접 피펫팅되도록하십시오.<ol>
<li>수지를 ZIC-HILIC 용출 완충액(18.2MΩH2O 중 0.1% TFA)의 20베드 부피(200μL)로 평형화시킨다.</li>
			<li>수지를 ZIC-HILIC 준비 완충액 (18.2 MΩH2O 중 95% 아세토니트릴)의 20 베드 부피 (200μL)로 세척한다.</li>
			<li>수지를 20베드 부피(200μL)의 ZIC-HILIC 로딩/세척 버퍼(80% 아세토니트릴, 18.2MΩH2O와 균형을 이룬 1% TFA)로 세척합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>건조된 소화된 샘플(단계 2.1.6부터)을 ZIC-HILIC 로딩/세척 완충액에 재현탁하여 최종 농도 4μg/μL로 재현탁시킨다(예를 들어, 펩티드 200μg의 경우, ZIC-HILIC 로딩/세척 버퍼 50μL에 재현탁). 샘플이 재현탁되도록 1분 동안 간단히 소용돌이치고, 25°C에서 2,000 × g에서 1 분 동안 스핀다운한다.</li>
		<li>재현탁된 펩티드 샘플을 컨디셔닝된 ZIC-HILIC 컬럼 상에 로딩한다.<ol>
<li>주사기를 사용하여 부드럽게 압력을 가하여 ZIC-HILIC 로딩/세척 버퍼(총 60베드 부피 세척용)의 20베드 부피(200μL)로 세 번 세척합니다.</li>
			<li>20층 부피(200 μL)의 ZIC-HILIC 용출 완충액으로 당펩티드를 1.5 mL 튜브에 넣고 주사기를 이용하여 압력을 부드럽게 가한 다음 25°C에서 진공 원심분리하여 용출액을 건조시켰다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. 프로테옴/글리코펩티드-풍부 샘플의 LC-MS
<ol><li>샘플을 버퍼 A*(2% 아세토니트릴, 0.1% TFA)에 재현탁하여 최종 농도 1μg/μL로 재현탁합니다(예: 펩티드 50μg의 경우 50μL의 버퍼 A*에 재현탁).</li>
	<li>샘플을 MS에 결합된 HPLC/UPLC에 로드하여 글리코펩티드의 분리 및 식별을 가능하게 한다. 참고: 내부 직경, 길이, 유속, 크로마토그래피 수지의 유형 및 필요한 펩티드 주입량을 포함한 컬럼 파라미터는 사용할 분석 설정 및 구배 길이에 맞게 최적화되어야 합니다. 분석 설정의 최적화를 수행하는 방법에 대한 예는57을 참조하십시오.</li>
	<li>결과 MS 데이터의 수집을 모니터링하여 데이터가 원하는 파라미터로 수집되고 있는지 확인합니다. 참고: 구성 분석의 경우 CID 단편화로 충분합니다. 글리코펩티드에 글리칸을 첨가하기 때문에, 글리코펩티드 이온은 전형적으로 비글리코실화된 펩티드보다 더 높은 m/z 및 더 낮은 전하 밀도로 관찰된다. 이러한 이온을 관찰 할 수 있도록하려면 MS1 질량 범위를 400 ~ 2,000 m / z로 허용하십시오.</li>
	<li>CID를 사용하여 선택된 이온을 단편화하여 글리칸의 특성화에 중요한 옥소늄 이온을 포함하는 낮은 m/z 단편 이온의 수집을 보장합니다. 참고: CID를 사용한 글리코펩티드의 단편화는 펩티드 및 글리칸 서열 둘 다뿐만 아니라 단편화 동안 적용된 에너지 25,58,59에 의해 영향을 받는다. 다양한 충돌 에너지가 사용될 수 있지만, 글리코펩티드를 단편화하기 위한 최적의 전략은 다중 충돌 에너지(25,59,60)의 사용을 결합한 계단식 충돌 에너지의 사용이다.</li>
	<li>글리칸 조성물의 결정을 돕기 위해 부위 국소화를 위한 ETD 또는 IT-CID와 같은 대안적인 단편화 방법을 이용한다. 참고: 이러한 단편화 접근법 중 어느 것도 조성 분석에 필수적이지는 않지만, 관심있는 글리코펩티드의 추가 심문을 가능하게 하기 위해 수집될 수 있다.</li>
</ol>4. 프로테옴/글리코펩타이드 농축 시료 분석
<ol><li>FragPipe에서 검색을 사용하도록 데이터 파일을 사전 필터링합니다.<ol>
<li>ETD 또는 IT-CID 스캔이 데이터 세트 내에서 획득된 경우, FragPipe로 검색하기 전에 MSConvert61 을 사용하여 데이터 파일에서 이러한 스캔 이벤트를 필터링하십시오. 참고: 아래에 설명된 개방형 검색 파라미터의 경우 빔 유형 CID 데이터만 필요합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>FragPipe에서 열린 검색 수행<ol>
<li>FragPipe를 열고 워크플로 탭을 클릭합니다. 워크플로 풀다운 메뉴에서 검색 열기 옵션을 선택하고 파일 추가를 클릭하여 검색할 데이터 파일을 FragPipe로 가져옵니다(그림 2A).</li>
		<li>데이터베이스 탭을 클릭하고 다운로드를 클릭하여 다운로드 관리자를 시작하십시오. 이렇게 하면 Uniprot Proteome ID를 사용하여 Uniprot에서 프로테옴 데이터베이스를 다운로드할 수 있습니다. 다운로드 관리자 내에서 디코이 및 오염 물질 추가 옵션을 클릭하여 데코이 및 오염 단백질을 데이터베이스에 통합합니다.</li>
		<li>보다 엄격한 FDR 임계값을 보려면 유효성 검사 탭을 클릭하고 필터 및 보고서 값을 0.01 에서 필요한 FDR로 수정합니다. 참고: 기본 FragPipe 설정은 단백질 수준에서 1% FDR을 보장합니다.</li>
		<li>MSfragger 탭을 클릭합니다. 피크 정합 상자 내에서 전구체 질량 공차를 기본 500Da에서 2,000Da로 늘려 큰 수정을 식별할 수 있도록 합니다(그림 2A).</li>
		<li>실행 탭을 클릭하고 FragPipe의 출력 위치를 정의합니다. 실행 단추를 클릭하여 검색을 시작합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>데이터 세트(FragPipe의 psm.tsv 출력 내에 포함됨)에서 식별된 PSM을 사용하여 데이터 세트 내에서 관찰된 델타 질량의 빈도를 플로팅하여 잠재적 글리칸을 식별합니다(그림 3). PRIDE 수탁 PXD027820을 통해 액세스할 수 있는 R 스크립트를 사용하여 MSfragger 출력에서 델타 질량 플롯을 만듭니다. 참고: 열린 검색 결과의 최소 후처리는 이러한 스크립트 내에서 수행되며, 이러한 스크립트의 주요 목적은 델타 질량 프로파일의 시각화를 지원하는 것입니다. 중요하게도, 풍부한 델타 질량의 관찰만으로는 변형이 잠재적 글리칸이라는 증거가 아니며, 델타 질량을 글리칸으로 할당하는 것은 상응하는 MS2 사건에 대한 추가 분석이 필요하기 때문이다.</li>
	<li>샘플 내에서 글리코펩티드의 특성화를 가능하게 하기 위해, 높은 하이퍼스코어를 갖는 할당에 대응하는 높은 신뢰도 델타 질량 식별에 초점을 맞춘다.<ol>
<li>글리코펩티드 스펙트럼을 평가하는 것을 돕기 위해, 스펙트럼 내에서 펩티드 관련 이온의 할당을 가능하게 하는 인터랙티브 펩티드 스펙트럼 주석기(63)와 같은 펩티드 주석 도구를 사용하여, 글리칸 관련 이온의 수동 식별을 가능하게 한다(도 4). 참고: 여기에 제시된 데이터 세트 내에서 >30의 하이퍼스코어는 확인된 모든 글리코펩티드의 상위 50% 이내의 점수에 해당하므로 높은 점수로 간주됩니다(그림 5).</li>
	</ol></li>
	<li>고신뢰도 글리코펩티드가 할당되면서, 글리코펩티드의 동정을 개선하기 위해 일반적으로 관찰되는 글리칸 관련 이온(도 4)을 동정한다. 참고: 글리칸 중심 검색으로 알려진 검색 내에 글리칸 관련 이온을 통합함으로써 글리코펩티드 할당의 품질을 향상시킬 수 있습니다.<ol>
<li>FragPipe의 MSfragger 탭을 클릭하고 관찰된 글리칸의 결정된 델타 질량을 변수 수정 및 질량 오프셋 섹션에 통합합니다. 변수 수정 및 질량 오프셋 섹션에 값을 입력하여 이러한 질량을 /로 구분된 개별 질량으로 추가합니다. 이 글리칸의 글리칸 관련 단편 덩어리를 MSFragger의 글리코 / 불안정 모드 섹션에 추가하십시오. 참고: 그림 2B는 A. baumannii 균주 AB307-0294의 글리칸 중심 검색에 필요한 주요 정보를 간략하게 설명합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>프로테오믹 연구와 관련된 모든 MS 데이터를 PRIDE 또는 MASSIVE 저장소와 같은 중앙 집중식 프로테오믹 저장소에 업로드합니다. 참고: 이 연구와 관련된 모든 데이터는 PRIDE 프로테오믹 저장소에 보관되었으며 PRIDE 수탁: PXD027820을 통해 액세스할 수 있습니다.</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

공개 검색은 알려지지 않은 수정 사항을 식별하기위한 효과적이고 체계적인 방법입니다. 박테리아 프로테옴 샘플 내에서 알려지지 않은 글리칸의 확인은 전통적으로 시간이 많이 걸리고 기술적으로 전문화 된 사업이었지만, MSfragger21,41 및 Byonic31,38과 같은 도구의 최근 개발은 이제 펩티드에 부착 된 잠재적 인 글리 칸으로서의 추가 특성화를 위해 델타 질량을 빠르고 효과적으로 식별 할 수있게되었습니다. 표준 및 글리코펩티드-풍부 프로테옴 샘플 둘 다의 공개 검색은 잠재적인 글리코펩티드를 동정할 수 있다(도 1). 많은 박테리아 시스템의 프로테옴 내에서 글리코펩티드의 공통성과 풍부함은 글리코펩티드 농축 없이 이러한 변형의 직접적인 검출을 가능하게 한다<sup ...

단백질 분자에 탄수화물을 부착하는 과정인 단백질 글리코실화는 자연 1,2에서 가장 흔한 번역 후 변형(PTM) 중 하나입니다. 삶의 모든 영역에서 다양한 복잡한 기계가 무수한 세포 기능에 영향을 미치는 당단백질의 생성에 전념하여 진화했습니다 1,3,4,5. 단백질 글리코실화는 아미노산6,7의 범위에서 발생하는 반면, N-결합 및 O-연결된 글리코실화 이벤트는 자연에서 관찰되는 두 가지 우세한 형태이다. N-연결된 글리코실화는 아스파라긴(Asn) 잔기의 질소 원자에 글리칸의 부착을 수반하는 반면, O-연결된 글리코실화에서, 글리칸은 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 또는 티로신(Tyr) 잔기7의 산소 원자에 부착된다. 글리코실화 시스템에 의해 표적화된 잔기의 유사성에도 불구하고, 단백질에 부착된 글리칸 내의 차이는 글리코실화가 자연에서 발견되는 PTM의 가장 화학적으로 다양한 부류임을 초래한다.
진핵 글리코실화 시스템은 글리칸 다양성을 보유하지만, 이들 시스템은 전형적으로 이용되는 독특한 탄수화물의 수에서 제한된다. 그 결과 다양성은 이러한 탄수화물이 글리 칸 8,9,10,11,12로 배열되는 방식에서 비롯됩니다. 대조적으로, 박테리아 및 고세균 종은 이러한 시스템내에서 생성 된 독특한 설탕의 깎아 지른 배열로 인해 사실상 무제한의 글리 칸 다양성을 가지고 있습니다 2,10,13,14,15,16,17. 생명의 영역에 걸쳐 관찰된 글리칸 다양성의 이러한 차이는 글리코실화 사건의 특성화 및 확인에 대한 중요한 분석적 도전을 나타낸다. 진핵 글리코실화의 경우, 글리칸 조성물을 예측하는 능력은 글리코생물학에 대한 관심의 증가를 촉진시켰다; 그러나 박테리아 글리코실화에 대해서도 마찬가지이며, 이는 여전히 전문 실험실의 연구로 크게 제한됩니다. 생명 과학에서 질량 분광법 (MS) 계측의 접근성이 증가함에 따라 MS 기반 접근법은 이제 글리코 프로테오믹 분석의 주요 방법입니다.
MS는 글리코실화의 특성화를 위한 전형적인 도구로서 등장하였으며, 현재 당단백질6을 특성화하기 위해 하향식 및 상향식 접근법 둘 다 일반적으로 사용되고 있다. 하향식 프로테오믹스는 특정 단백질18,19의 글로벌 글리코실화 패턴을 평가하기 위해 사용되는 반면, 상향식 접근법은 복합 혼합물6,20,21,22,23에서도 글리칸 특이적 글리코펩티드의 특성화를 가능하게 하기 위해 사용된다. 글리코펩티드의 분석을 위해, 유익한 단편화 정보의 생성은 글리코실화 사건24,25의 특성화에 필수적이다. 공진 이온 트랩 기반 충돌 유도 해리(IT-CID), 빔형 충돌 유도 해리(CID) 및 전자 전달 해리(ETD)를 포함한 다양한 단편화 접근법이 기기에서 일상적으로 접근 가능합니다. 각 접근법은 글리코펩티드 분석 25,26에 대해 서로 다른 강점과 약점을 가지고 있으며, 글리코실화 6,20을 분석하기 위해 이러한 단편화 접근법을 적용하는 데 지난 십 년 동안 상당한 진전이 있었다. 그러나, 박테리아 글리코실화 분석의 경우, 중요한 한계는 글리코펩티드를 단편화하는 능력이 아니라 샘플 내에서 잠재적인 글리칸 조성물을 예측할 수 없다는 것이었다. 이러한 시스템 내에서, 다양한 박테리아 글리칸의 알려지지 않은 성질은 글리코펩티드의 식별을 제한하며, 심지어 글리코실화에 초점을 맞춘 검색 도구는 현재 O-Pair27, GlycopeptideGraphMS 28 및 GlycReSoft29와 같은 진핵 글리코펩티드의 분석을 위해 흔히 사용되고 있다. 이 문제를 극복하기 위해, 박테리아 글리코실화30의 연구를 위한 강력한 접근법으로 떠오르는 오픈 서닝 도구의 사용과 함께 대안적인 검색 방법이 요구된다.
블라인드 또는 와일드카드 검색이라고도 하는 개방형 검색은 알 수 없거나 예기치 않은 PTM 21,30,31,32를 가진 펩티드를 식별할 수 있게 합니다. 개방형 검색은 큐레이팅된 수정 검색, 다단계 데이터베이스 검색 또는 광질량 내성 검색(33,34,35,36,37)을 포함하는 다양한 계산 기술을 활용합니다. 오픈 서빙은 큰 잠재력을 가지고 있지만, 그의 사용은 전형적으로 제한된 검색(31,32)에 비해 변형되지 않은 펩티드의 검출에 대한 분석 시간의 현저한 증가 및 민감도의 손실에 의해 방해를 받았다. 변형되지 않은 펩티드-스펙트럼 매칭(PSMs)의 검출의 감소는 이들 기술과 관련된 위양성 PSM 비율의 증가의 결과이며, 이는 원하는 거짓 발견률(FDR)을 유지하기 위해 증가된 엄격한 필터링을 필요로 한다(FDR)33,34,35,36,37 . 최근에는 Byonic 31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo 40 및 MSFragger 21,41을 포함하여 공개 검색의 접근성을 크게 향상시키는 몇 가지 도구가 제공되었습니다. 이러한 도구는 분석 시간을 현저하게 줄이고 이종 글리칸 조성물을 처리하기 위한 접근법을 구현함으로써 글리코실화 이벤트의 강력한 식별을 가능하게 한다.
이 글은 그람 음성 병원체인 아시네토박터 바우마니이를 모델로 사용하여 열린 탐색에 의한 박테리아 글리코펩티드의 동정을 위한 간소화된 방법을 제시한다. A. baumannii는 PglL 단백질 글리코실화 시스템42,43,44로 알려진 다중 단백질 기질의 변형을 담당하는 보존된 O-연결된 글리코실화 시스템을 보유한다. 유사한 단백질이 균주 간의 글리코실화를 표적으로 하는 반면, PglL 글리코실화 시스템은 캡슐 유전자좌(K-locus로 알려짐)로부터 유래되는 단백질 글리코실화에 사용되는 글리칸의 생합성으로 인해 매우 가변적이다(K-locus로 알려짐)44,45,46. 이로 인해 단일 또는 제한된 중합된 K-단위로부터 유래된 다양한 글리칸(K-단위라고도 함)이 단백질 기질(30,44,46)에 첨가된다. 이 작업에서 소프트웨어 FragPipe에서 열린 검색 도구 인 MSfragger를 사용하여 A. baumannii 균주에서 글리 칸을 식별하는 데 사용됩니다. 오픈 서치와 수동 큐레이션을 결합함으로써, 박테리아 글리코펩티드의 동정을 더욱 개선하기 위해 "글리칸 중심 검색"을 수행할 수 있다. 함께, 이러한 다단계 동정 접근법은 신규한 글리코실화 사건의 특성화에 대한 광범위한 경험 없이 글리코펩티드의 동정을 가능하게 한다.

<table><tbody><tr><td>14 G Kel-F 허브 포인트 스타일 3</td><td>Hamilton company</td><td>hanc90514</td><td></td></tr><tr><td>2-클로로아세트아미드</td><td>시그마 Aldrich Pty Ltd</td><td>C0267-100G</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>시그마 Aldrich Pty Ltd</td><td>34851-4L</td><td></td></tr><tr><td>수산화암모늄(28%)</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>338818-100ML</td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 시약</td><td>A 피어스</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 시약 B</td><td>Pierce</td><td>23224</td><td></td></tr><tr><td>C8 Empore SPE</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>66882-U</td><td>C8 재료의 대체 공급 업체는 Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)</td></tr> <tr><td>Formic acid</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>5.33002</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>650447-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>M/4058/17</td><td></td></tr><tr><td>SDB-RPS Empore SPE (역상 설포네이트)</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>66886-U</td><td>SDB-RPS의 대체 공급업체는 Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>, Sigma Aldrich Pty Ltd</td>, <td>D6750-100G</td><td></td></tr>, <tr><td>ThermoMixer C</td>, <td>Eppendorf</td><td>2232000083</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>입니다.<td>302031-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris 2-카르복시에틸 포스핀 염산염</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(하이드록시메틸)아미노메탄</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>252859-500G</td><td></td></tr><tr><td>트립신/Lys-C 프로테아제 혼합물</td><td>Promega</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>진공 농축기</td><td>Labconco</td><td>7810040</td><td></td></tr><tr><td>ZIC-HILIC 재료</td><td></td><td></td><td>일회용 SPE 컬럼에 사용되는 Merck 1504580001 Resin은 더 큰 형태의 컬럼을 비우고 free resin을 사용하여 얻을 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

acinetobacter baumannii o 결합 글리코 펩타이드의 확인을위한 개방형 검색 기반 접근법의 적용

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

단백질 글리코실화는 박테리아 유기체 내에서 일반적인 변형으로 점점 더 인식되어 원핵 생리학 및 병원성 종의 최적 감염성에 기여합니다. 이로 인해 박테리아 글리코실화를 특성화하는 데 대한 관심이 증가하고 있으며 이러한 사건을 식별하기위한 고처리량 분석 도구에 대한 필요성이 커지고 있습니다. 상향식 프로테오믹스는 풍부한 글리코펩티드 데이터의 생성을 쉽게 가능하게 하지만, 원핵 종에서 관찰되는 글리칸의 폭과 다양성은 박테리아 글리코실화 사건의 식별을 매우 어렵게 만든다.
전통적으로, 박테리아 프로테오믹 데이터 세트 내에서 글리칸 조성물의 수동 결정은 이것을 현장 특정 전문가로 제한된 맞춤형 분석으로 만들었습니다. 최근에, 개방형 검색 기반 접근법은 알려지지 않은 수정의 식별을 위한 강력한 대안으로 등장하고 있다. 펩티드 서열에서 관찰되는 독특한 변형의 빈도를 분석함으로써, 개방 검색 기술은 복잡한 샘플 내의 펩티드에 부착된 일반적인 글리칸의 동정을 허용한다. 이 기사에서는 글리코프로테오믹 데이터의 해석 및 분석을 위한 간소화된 워크플로우를 제시하며, 글리칸 조성물에 대한 사전 지식 없이 박테리아 글리코펩타이드를 식별하기 위해 공개 검색 기술을 어떻게 사용할 수 있는지 보여줍니다.
이 접근법을 사용하여, 샘플 내의 글리코펩티드는 글리코실화 차이를 이해하기 위해 신속하게 확인될 수 있다. 아시네토박터 바우마니 를 모델로 사용하여, 이러한 접근법은 균주 간의 글리칸 조성물의 비교와 신규한 당단백질의 동정을 가능하게 한다. 종합하면,이 연구는 박테리아 글리코실화의 확인을위한 개방형 데이터베이스 검색 기술의 다양성을 보여 주므로 이러한 매우 다양한 글리코 프로테옴의 특성화가 그 어느 때보 다 쉬워졌습니다.

박테리아 글리코펩티드 분석을 위한 개방 검색의 유용성을 예시하기 위해, A. baumannii-AB307-0294, ACICU 및 D1279779의 세 균주 내에서 O-연결된 글리칸의 화학적 다양성을 평가하였다. O-연결된 글리코프로테옴은 A. baumannii 균주 사이에서 매우 가변적이며, 글리코실화에 사용되는 글리칸은 고도로 가변적인 캡슐 유전자좌 44,45,46으로부터 유래된다. 이러한 화학적 다양성은 A. baumannii를 오픈 검색 연구를위한 이상적인 모델 시스템으로 만듭니다. 세 균주의 글리코프로테옴은 이전에 평가되지 않았지만, 이들 균주 중 두 균주인 AB307-029464 및 ACICU65</...

오픈 서닝은 이전에 알려지지 않은 글리칸 조성물로 장식된 글리코펩티드의 동정을 가능하게 한다. 이 기사에서는 Acinetobacter baumannii 를 모델로 사용하여 박테리아 샘플에 대해 공개 검색 및 후속 글리칸 중심의 글리코 펩티드 검색을 수행하기위한 간소화 된 접근 방식을 제시합니다.

Acinetobacter baumannii O 결합 글리코 펩타이드의 확인을위한 개방형 검색 기반 접근법의 적용

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal ...

이 프로토콜은 박테리아 글리코프%eptides의 식별을 간소화하여 연구원들이 새로운 글리코실화 사건과 균주 간의 글리코실화에 사용되는 글리칸의 차이를 식별할 수 있게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 비글리코실화 전문가가 박테리아 프로테옴 샘플에서 잠재적인 글리코실화 사건을 식별할 수 있게 한다는 것이다. 개방 검색은 글리코실화뿐만 아니라 다양한 변형의 확인에 사용될 수 있는 일반적으로 적용 가능한 접근법이며, 임의의 프로테옴 샘플에 적용될 수 있다.STB-RPS 스톱 앤 고 추출 팁을 준비하려면 14게이지 무딘 바늘을 사용하여 50마이크로그램의 펩타이드 결합을 위해 47평방 밀리미터 STB-RPS 멤브레인에서 세 개의 STB-RPS 디스크를 절제합니다. 펩티드 양이 더 많으면 그에 따라 디스크 수를 늘리십시오. SDB-RPS 스테이지 팁을 사용하기 전에, 100% 아세토니트릴 150 마이크로리터를 첨가하고 원심분리에 의해 버퍼를 방사하거나 주사기를 사용하여 압력을 부드럽게 가하여 팁을 세척한다.다음으로, 팁을 1%TFA를 함유하는 30%메탄올 150마이크로리터로 세척한 다음, 팁을 1%TFA를 함유하는 90%이소프로판올 150마이크로리터로 평형화시킨다. 평형화 후, 프로테옴 샘플을 원심분리 또는 주사기를 사용하여 STB-RPS 단계 팁 상에 로딩한다. 그런 다음 팁을 1 % TFA를 함유 한 90 % 이소프로판올 150 마이크로 리터로 씻은 다음 1 % TFA 150 마이크로 리터로 씻으십시오.STB-RPS 단계 팁에서 펩티드를 용출시키려면, 단일 팁에 첨가된 5%수산화암모늄 및 80% 아세토니트릴의 150 마이크로리터를 사용하고 주사기를 사용하여 부드럽게 압력을 가하여 개별 튜브에서 용출된 샘플을 수집한다. 또는 원심분리를 통해 용출하는 경우 모든 단계 팁에 첨가 된 80 % 아세토 니트릴의 5 % 수산화 암모늄에서 150 마이크로 리터를 사용하고 깨끗한 플레이트에서 수집하십시오. 용출된 펩티드를 섭씨 25도에서 진공 원심분리하여 건조시킨다.다음에, 글리코펩티드 샘플을 풍부하게하기 위해, 쯔비터이온성 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피, 또는 ZIC-HILIC, 스테이지 팁을 제조하였다. 14게이지 무딘 바늘을 사용하여 470평방밀리미터 C8 멤브레인에서 C8 디스크 하나를 절제하고 P-200 팁에 디스크를 포장하여 프릿을 만듭니다. 그런 다음, 주사기를 사용하여 부드럽게 압력을 가하여 프릿 상에 50% 아세토니트릴에 재현탁된 약 5밀리미터의 ZIC-HILIC 물질을 첨가한다.팁을 사용하기 전에 수지를 20 베드 부피의 ZIC-HILIC 용출 버퍼로 평형화시키고 수지 위에 10 마이크로 리터의 부피를 남겨 두어 수지가 건조되지 않도록하십시오. 이어서, 20베드 부피의 ZIC-HILIC 준비 완충액으로 수지를 순차적으로 세척한 다음, 20층 부피의 ZIC-HILIC 로딩 또는 세척 완충액으로 세척한다. 다음에, 소화되고 건조된 펩티드를 ZIC-HILIC 로딩 완충액 중에 마이크로리터당 네 마이크로그램의 최종 농도로 재현탁시킨다.샘플을 재현탁 시키려면 잠시 동안 소용돌이 치신 다음 섭씨 2000 배와 섭씨 25도에서 1 분 동안 회전시킵니다. 방사 후, 재현탁된 펩티드 샘플을 컨디셔닝된 ZIC-HILIC 컬럼 상에 로딩한 다음, 주사기를 사용하여 부드럽게 압력을 가함으로써 ZIC-HILIC 로딩 버퍼의 20베드 부피로 컬럼을 세 번 세척한다. 마지막으로, 주사기를 사용하여 압력을 부드럽게 가하여 1.5 밀리리터 튜브에 20 베드 부피의 ZIC-HILIC 용출 완충액으로 글리코펩티드를 용출시킨 다음, 섭씨 25도에서 진공 원심분리하여 용리액을 건조시킨다.LC-MS 분석을 위해, 버퍼 A*의 샘플을 마이크로리터당 하나의 마이크로그램의 최종 농도로 재현탁시킨 다음, 샘플을 MS에 결합된 HPLC-UPLC에 로딩하여 글리코펩티드의 분리 및 식별을 가능하게 한다. 결과 MS 데이터 수집을 모니터링하여 원하는 매개 변수로 데이터가 수집되고 있는지 확인합니다. 프로테옴 및 글리코펩티드가 풍부해진 샘플을 분석하려면 FragPipe를 열고 워크플로 탭을 클릭합니다.워크플로 풀다운 메뉴에서 검색 열기 옵션을 선택하고 파일 추가를 클릭하여 검색할 데이터 파일을 FragPipe로 가져옵니다. 그런 다음 데이터베이스 탭을 클릭한 다음 다운로드를 클릭하여 UniProt 가입 번호를 사용하여 UniProt에서 프로테옴 데이터베이스를 다운로드하기 위한 다운로드 관리자를 시작합니다. 다운로드 관리자 내에서 디코이 및 오염 물질 추가 옵션을 클릭하여 디코이 및 오염 단백질을 이 데이터베이스에 통합합니다.그런 다음 MSFragger 탭을 클릭 한 다음 피크 일치 상자 내에서 전구체 질량 공차를 기본 500 달톤에서 2, 000 달톤으로 늘려 큰 수정을 식별합니다. 실행 탭을 클릭하여 FragPipe의 출력 위치를 정의한 다음 실행 단추를 클릭하여 검색을 시작합니다. 고신뢰 글리코펩티드가 할당되면서, 글리코펩티드의 동정을 개선하기 위해 일반적으로 관찰되는 글리칸 관련 이온을 동정한다.그런 다음 MSFragger 탭을 클릭하고 관찰된 글리칸의 결정된 델타 질량을 슬래시로 구분된 개별 질량이 있는 변수 수정 및 질량 오프셋 섹션에 추가합니다. 그런 다음 이러한 글리칸의 글리칸 관련 단편 덩어리를 MSFragger의 글리코 / 불안정 모드 섹션에 추가하십시오. 마지막으로, 프로테오믹 연구와 관련된 모든 MS 데이터를 PRIDE 또는 MassIVE 저장소와 같은 중앙 집중식 프로테오믹 저장소에 업로드합니다.Acinetobacter baumannii 균주 AB307-0294의 공개 검색은 648.25 및 692.28 달톤에 상응하는 두 개의 우세한 델타 질량을 밝혀냈다. ACICU 캡슐은 843.31 달톤의 예측된 질량에 상응하는 사당류 K 단위로 구성되는 것으로 알려져 있다. 이 캡슐 구조는 ACICU 내에서 가장 빈번하게 관찰되는 델타 질량과 일치한다.균주 D1279779의 공개 검색 분석은 203.08, 794.31 및 1588.62 달톤과 일치하는 다중 델타 질량의 존재를 밝혀냈다. 인터랙티브 펩티드 스펙트럼 주석기를 사용하여, 세 개의 A.baumannii 균주에 걸쳐 확인된 글리코펩티드가 잠재적인 글리칸-관련 이온을 드러내는 것으로 평가되었다. 글리칸 중심의 검색은 세 가지 A.baumannii 균주 모두에서 확인 된 글리코 펩타이드 / 펩티드 스펙트럼 일치의 총 수가 눈에 띄게 증가했으며, 이는 ACICU의 37 % 증가, AB307-0294의 117 % 증가, D1279779의 363 % 증가에 해당합니다.개별 MS 이벤트의 경우, 글리칸 특이적 정보의 포함은 전형적으로 관찰된 하이퍼스코어를 증가시키지만, 이러한 증가는 고도로 글리칸 의존적이다. ZIC-HILIC 농축을 수행 할 때 용매의 손실로 인해 글리코 펩타이드의 분리가 손상 될 수 있으므로 수지가 항상 젖은 상태로 유지되도록하십시오. 글리코실화의 차이에 대한 데이터는 돌연변이유발 연구를 알리거나 글리칸 생합성을 담당하는 유전자 클래스를 확인하는 데 사용될 수 있다.개방형 데이터베이스 검색을 사용하여, 우리는 박테리아 유전자에 걸쳐 글리칸 다양성을 특성화하기 시작했습니다. 이것은 박테리아 글리코실화가 우리가 생각했던 것보다 더 흔하고 훨씬 다양하다는 것을 보여주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS) 및 분자 기술(16S rRNA 유전자 염기서열 분석)을 통해 일상적인 진단에서 희귀 박테리아 병원체를 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터를 제공하는 두 기술의 조합에 있습니다.

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액체 크로마토그래피, 질량 분석법 및 생물정보학에 의한 펩티도글리칸의 반정량 분석

여기서 우리는 MALDI-TOF-TOF 탠덤 질량 분광법 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 사내에서 개발된 단백질을 신속히 서열화한 병원성 박테리아에 의해 생성되는 단백질의 신속한 식별을 위한 프로토콜을 제시합니다. 메타안정 단백질 이온 단편 때문에 아파르트산 효과 및 이러한 특이성은 단백질 식별을 위해 이용된다.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별

EUCAST는 자동 혈액 배양을 위한 직접 항균제 감수성 검사(AST) 프로토콜을 개발했습니다. 그러나 질량 분석 기반 미생물 식별에 대한 의존성은 자동화된 미생물 식별 시스템에서 직접 접종 준비 프로토콜을 사용하여 제거할 수 있습니다. 이 접근 방식은 검체 채취 후 24시간 이내에 AST 보고서를 제공할 수 있습니다.

질량 분석법 없이 EUCAST RAST 방법을 용이하게 하기 위해 자동 미생물 식별 시스템을 사용한 직접 미생물 식별

Acinetobacter baumannii의 빠르고 정확한 검출을 촉진하기 위해 A. baumannii 감염을 식별하기 위해 LbaCas12a 엔도뉴클레아제와 함께 Recombinase Polymerase Amplification(RPA)을 사용하는 프로토콜을 제시합니다.

Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a 기반 시스템을 사용한 Acinetobacter Baumannii 감염의 빠르고 특이적 검출

우리는 지방산을 정제할 필요 없이 지방산을 식별할 수 있는 프로토콜을 제안합니다. 머무름 시간에 대한 정보와 지방산 유도체의 세 가지 유형, 즉 지방산 메틸 에스테르(FAME), 4,4-디메틸 옥사졸린 유도체(DMOX) 및 3-피리딜카르비닐 에스테르(피콜리닐)의 질량 스펙트럼을 결합합니다.

지방산의 확인 시험<em&gt; 바실러스 세레 우스</em

학습하세요 Acinetobacter baumannii의 O-결합 글리코펩타이드 확인을 위한 개방형 검색 기반 프로토콜. STB-RPS 추출 및 ZIC-HILIC 농축을 활용하여 세균 당화 이벤트를 효율적으로 식별하는 방법을 익히세요.

Acinetobacter baumannii O 결합 글리코 펩타이드의 확인을위한 개방형 검색 기반 접근법의 적용

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