Name: 체외에서 파라크린 비정규 Wnt 신호 전달 모델링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 배우세요 체외에서 파라크린 비정규 Wnt 신호 전달을 기능적·분자적으로 평가하는 재현 가능한 방법을. C2C12 근육세포와 O9-1 신경줄기세포를 사용하여 Wnt5a 신호의 세포 이동 효과를 연구합니다.

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이 작업은 NIH 상 F30HL154324를 O.T.에, K08HL121191 및 R03HL154301을 S.R.K.에 부분적으로 지원했습니다. 저자는 이 원고의 그림 1 에 있는 도식이 biorender.com 로 작성되었음을 인정하고자 합니다.

<ol><li>Ho, H. Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a-Ror-Dishevelled+signaling+constitutes+a+core+developmental+pathway+that+controls+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).</li>
<li>Čapek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+Frizzled7+reveals+a+permissive+role+of+noncanonical+wnt+signaling+in+mesendoderm+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration.</a> Elife. (8), 42093(2019).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+regulates+polarized+second+heart+field+morphogenesis+to+promote+both+arterial+and+venous+pole+septation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation.</a> Development. 146 (20), 181719(2019).</li>
<li>Lutze, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+WNT-signaling+controls+differentiation+of+lymphatics+and+extension+lymphangiogenesis+via+RAC+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4739(2019).</li>
<li>Buttler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maldevelopment+of+dermal+lymphatics+in+Wnt5a-knockout-mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice.</a> Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).</li>
<li>Betterman, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+cadherin+FAT4+orchestrates+lymphatic+endothelial+cell+polarity+in+response+to+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).</li>
<li>Descamps, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+4+regulates+arterial+network+organization+through+noncanonical+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling.</a> Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).</li>
<li>Weeraratna, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+signaling+directly+affects+cell+motility+and+invasion+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma.</a> Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).</li>
<li>Henry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+novel+Wnt+receptor+ROR2+is+increased+in+breast+cancer+and+may+regulate+both+%CE%B2-catenin+dependent+and+independent+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).</li>
<li>Anastas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+complex+of+SCRIB%2C+NOS1AP+and+VANGL1+regulates+cell+polarity+and+migration%2C+and+is+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression.</a> Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).</li>
<li>Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+world+of+WNT+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The complex world of WNT receptor signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).</li>
<li>Dong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+redundancy+of+frizzled+3+and+frizzled+6+in+planar+cell+polarity+control+of+mouse+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles.</a> Development. 145 (19), (2018).</li>
<li>Bernascone, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sfrp3+modulates+stromal-epithelial+crosstalk+during+mammary+gland+development+by+regulating+Wnt+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 2481(2019).</li>
<li>Hendrickx, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT16+requires+G%CE%B1+subunits+as+intracellular+partners+for+both+its+canonical+and+noncanonical+WNT+signalling+activity+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts.</a> Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).</li>
<li>Avgustinova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cell-derived+Wnt7a+recruits+and+activates+fibroblasts+to+promote+tumour+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness.</a> Nature Communications. (7), 10305(2016).</li>
<li>Tseng, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAPE+suppresses+migration+and+invasion+of+prostate+cancer+cells+via+activation+of+noncanonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling.</a> Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Wnt%2FCa2%2B+signaling+in+actin+cytoskeleton+remodeling+and+cell+motility+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer.</a> PLoS One. 5 (5), 10456(2010).</li>
<li>Gibbs, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle1+mutation+causes+planar+cell+polarity+and+directional+cell+migration+defects+associated+with+cardiac+outflow+tract+anomalies+and+other+structural+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects.</a> Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).</li>
<li>Cui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+PCP+protein+required+for+ciliogenesis%2C+regulates+directional+cell+migration+and+cell+polarity+by+direct+modulation+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton.</a> PLoS Biology. 11 (11), 1001720(2013).</li>
<li>Gombos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formin+DAAM+functions+as+molecular+effector+of+the+planar+cell+polarity+pathway+during+axonal+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).</li>
<li>Toubat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Crest+Cell-derived+Wnt5a+Regulates+Planar+Cell+Polarity+in+Cranial+Second+Heart+Field+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells.</a> Circulation. 142, Suppl_3 12540(2020).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+cell+cohesion+by+Wnt5a+during+second+heart+field+progenitor+deployment%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment.</a> Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).</li>
<li>Sinha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Wnt5a+disrupts+second+heart+field+cell+deployment+and+may+contribute+to+OFT+malformations+in+DiGeorge+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).</li>
<li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+instruction+to+output%3A+Wnt%2FPCP+signaling+in+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).</li>
<li>Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Dishevelled-Mediated+Wnt+Signaling+in+Vertebrate+Early+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370(2020).</li>
<li>Butler, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity in development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).</li>
<li>Bradshaw, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+neural+crest+cells+during+outflow+tract+septation+in+the+neural+crest-deficient+mutant+Splotch2H%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H.</a> Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).</li>
<li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Sema3c+and+the+interaction+between+cardiac+neural+crest+and+second+heart+field+during+outflow+tract+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6771(2017).</li>
<li>Waldo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+is+necessary+for+normal+addition+of+the+myocardium+to+the+arterial+pole+from+the+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field.</a> Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).</li>
<li>Schleiffarth, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+is+required+for+cardiac+outflow+tract+septation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice.</a> Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).</li>
<li>Nguyen, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+Manipulation+of+O9-1+Neural+Crest+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).</li>
<li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).</li>
<li>Martinotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).</li>
</ol>

저자는 잠재적 인 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 관계가없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.

비표준 Wnt/평면 세포 극성(PCP) 신호 전달 경로는 다중 발달 24,25 및 질병 과정24,26과 관련된 매우 중요한 세포 신호 전달 경로입니다. 배아 발달 동안, 비표준 Wnt 신호전달은 신호-수신 세포(11)에서 형태, 비대칭 조직 및 방향 이동의 변화를 궁극적으로 유도하는 신호-송신 세포로부터의 분자 신호의 광대한 네트워크를 포함한다. 이전 연구에 따르면 이 신호 전달을 유도하는 특정 리간드-수용체 경로는 다양하고 상황에 따라 다르며 종종 세포 유형12,13,14,15...

비표준 Wnt 신호 전달은 세포 필라멘트 조직과 방향 이동을 조절하는 진화적으로 보존된 경로입니다. 이 경로는 배아 조직 형태 형성 1,2,3, 림프 및 혈관 신생 4,5,6,7, 암 성장 및 전이 8,9,10을 포함한 여러 생물학적 과정과 관련이 있습니다. . 세포 수준에서 비표준 Wnt 신호 전달은 신호 송신 세포와 신호 수신 세포 간의 조정된 파라크린 상호 작용을 통해 수행됩니다. 이러한 상호작용은 상이한 계통 또는 유형의 세포 사이에서 빈번하게 발생하며, 최대 19개의 리간드 및 다중 수용체, 공동-수용체 및 다운스트림 신호 전달 이펙터(11)를 포함하는 다양한 분자 네트워크를 포함한다. 이러한 신호전달 과정을 더욱 복잡하게 만드는 것은 이전 연구에서 리간드-수용체 조합이 문맥 및 조직 의존적 방식으로 다양할 수 있으며12,13, 신호 수신 세포에서 비표준 Wnt 신호전달을 유도하는 동일한 소스 리간드가 여러 신호 전달 세포 유형에 의해 생성될 수 있음을 보여주었습니다.14,15 . 비표준 Wnt 신호 전달과 관련된 세포 및 분자 복잡성을 감안할 때 생체 내에서 개별 및 임상적으로 관련된 메커니즘을 연구하는 능력은 제한적이었습니다.
 시험관 내에서 세포 배양 기술을 사용하여 비표준 Wnt 신호 전달을 연구하려는 시도가 있었습니다. 예를 들어, 세포 단층에서 수행된 상처-치유 분석은 세포 방향 이동 4,16,17,18,19를 기능적으로 평가하기 위해 사용되었다. 면역염색 기술은 세포 형태 7,10, 아키텍처및 비대칭 편광(18,19,20)에서 비표준 Wnt 유도 변화를 평가하기 위해 표면 단백질 발현의 공간 분석을 수행하는 데 사용되었습니다. 이러한 접근법이 신호 수신 세포에서 Wnt 관련 표현형을 특성화하는 데 중요한 도구를 제공했지만, 이러한 프로토콜에 신호 전달 성분이 없기 때문에 생체 내에서 관찰되는 파라 크린 신호 전달 메커니즘을 정확하게 모델링하는 능력이 제한됩니다. 결과적으로, 비표준 Wnt 경로의 신호 송신 및 수신 세포, 특히 다른 세포 유형의 세포 간의 파라크린 신호 상호 작용에 대한 강력하고 재현 가능한 평가를 허용하는 시험관 내 시스템을 개발할 중요한 필요성이 남아 있습니다.
이를 위해, 본 연구의 주요 목적은 시험관 내에서 파라크린 비표준 Wnt 신호 상호작용을 모델링하기 위한 프로토콜을 확립하는 것이었다. 우리는 이러한 상호 작용의 신호 전송 및 신호 수신 구성 요소를 요약하고 표준 분자, 유전 적 또는 약리학 적 접근법을 사용하여 비표준 Wnt 경로에서 특정 리간드 수용체 메커니즘을 독립적으로 연구 할 수있는 비접촉 공동 배양 시스템을 개발했습니다. NCC 매개 Wnt 신호 전달의 메커니즘은 확립 된 쥐 세포주를 사용하여 근세포 세포에서 조사되었습니다. 원리의 증거로서, 이 모델은 Wnt5a-ROR2 축을 NCC 21과 SHF 심근세포 전구세포 전구세포 3,22,23 사이의 관련 비표준 Wnt 신호 전달 경로로 암시하는 마우스에서의 이전 생체내 연구 결과를 확증하는 데 사용되었다.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td>이 있는 페이드 방지 장착 매체</td><td>4°°C에 보관; C</td></tr><tr><td>둔감한 혈청 알부민</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2323</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>C2C12 쥐 근아세포 세포주</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크, 75 cm2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>챔버 슬라이드 시스템, 4웰</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 매체 (DMEM), 고 포도당 (4.5 g / L), L- 글루타민 (2 mM)</td> <td>코닝</td><td>10-017-CV</td>는 <td>4 °C에 보관됩니다. C</td></tr><tr><td>Falcon 원추형 원심분리기 튜브, 15mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>0.4 &micro의 24웰 플레이트용 Falcon 투과성 지지대; M 투명 PET 멤브레인</td><td>Corning</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3381E</td><td>-20°C에서 50mL 분취액에 보관; C</td></tr><tr><td>젤라틴 용액, 0.1%</td> <td>ATCC</td><td>PCS-999-027</td><td>4°C에 저장; C</td></tr><tr><td>눈금이 매겨진 멸균 피펫 팁, 10 & 마이크로; L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3810</td><td></td></tr><tr><td>백혈병 억제 인자(LIF), 106 unit/mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산(MEM NEAA) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>최소 필수 매체(MEM)</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>미토마이신 C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>붙지 않는 자동 유리 커버슬립, 24 x 55 mm</td><td>Springside Scientific</td><td>HRTCG2455</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 신경능능선 세포주</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I, 1x</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 PBS의 솔루션, 4 %</td> <td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>sc-281692</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL 페니실린 및 10,000 &mu; g/mL 스트렙토마이신)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3470H</td><td>-20°C에서 10mL 분취량에 보관; C</td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td>-20 &deg에 저장; C, 가벼운</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS), 1x, 칼슘 및 마그네슘 없음, pH 7.4</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td>는 <td>4 °C에 보관되지 않습니다. C</td></tr><tr><td>재조합 인간 섬유아세포 성장인자-염기성 (rhFGF-basic)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간/마우스 Wnt5a 단백질</td><td>R& D Systems</td><td>645-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨, 100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>그리드가 있는 사각 페트리 접시</td><td>Thomas Scientific</td><td>1219C98</td><td></td></tr><tr><td>STO 쥐 섬유아세포 공급</td>세포 <td>ATCC</td><td>CRL-1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA, 0.25%</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3513C</td><td>는 4°C에 보관됩니다. C</td></tr><tr><td>Zeiss Apotome.2 형광 현미경</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 반전 Axio Vert.A1 광학 현미경</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen lite 2012 현미경 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>이미징 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

체외에서 파라크린 비정규 wnt 신호 전달 모델링

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

비표준 Wnt 신호 전달은 배아 발생 동안 세포 내 액틴 필라멘트 조직 및 전구 세포의 분극 이동을 조절합니다. 이 프로세스에는 신호 전송 셀과 신호 수신 셀 간의 복잡하고 조정된 파라크린 상호 작용이 필요합니다. 이러한 상호 작용이 서로 다른 계통의 다양한 유형의 세포 간에 발생할 수 있다는 점을 감안할 때 세포 특이적 결함의 생체 내 평가는 어려울 수 있습니다. 본 연구는 시험관 내에서 파라크린 비표준 Wnt 신호전달을 평가하기 위한 고도로 재현성 있는 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 (1) 관심있는 두 세포 유형 사이에서 비표준 Wnt 신호 전달의 기능적 및 분자 평가를 수행하는 능력으로 설계되었습니다. (2) 비표준 Wnt 신호 전달 경로에서 신호 전송 대 신호 수신 분자의 역할을 해부합니다. (3) 표준 분자 또는 약리학적 접근으로 표현형 구조 실험을 수행합니다.
이 프로토콜은 근모세포에서 신경 볏 세포(NCC) 매개 비표준 Wnt 신호 전달을 평가하는 데 사용되었습니다. NCC의 존재는 근아세포에서 팔로이딘 양성 세포질 필로포디아 및 라멜리포디아의 증가와 상처 치유 분석에서 개선된 근세포 이동과 관련이 있습니다. Wnt5a-ROR2 축은 NCC와 제 2 심장 필드 (SHF) 심근 세포 전구 세포 사이의 중요한 비표준 Wnt 신호 전달 경로로 확인되었습니다. 결론적으로, 이것은 시험관 내에서 파라크린 비표준 Wnt 신호 전달 메커니즘을 연구하기 위한 매우 다루기 쉬운 프로토콜입니다.

쥐 근원 세포의 이동 능력에 대한 NCC의 영향 이 분석은 NCC가 근모세포의 이동 능력에 미치는 영향을 평가하기 위해 처음 적용되었습니다. 그림 1 은 분석의 개략적 모델을 간략하게 설명합니다. 이 영향을 테스트하기 위해 스크래치 분석은 삽입물이있는 상태에서 성장한 것과 비교하여 단독으로 성장한 근세포 (NCC 삽입물없이)로 수행되었습니다. 양성 대조군으로, 500ng/mL의 재조합 Wnt5a(rWnt5a)를 NCC 인서트가 있는 챔버 웰에 첨가하였다. 이 rWnt5a 농도는 C2C12 세포에서 수행된 용량-반응 분석에 의해 결정되었습니다(보충 그림 S1). NCC 인서트의 대표적인 이미지는 보충 그림 S2에 표시되어 있으며, 이는 NCC가 이 시점에서 정상임을 보여줍니다. 면역형광법은 50nM의 Wnt5a siRNA와 함께 배양한 후 단백질 수준에서 Wnt5a ...

본 연구는 시험관 내에서 파라크린 비표준 Wnt 신호 전달 사건을 연구하기 위한 매우 재현성 있고 다루기 쉬운 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 쥐 신경 볏 세포 및 근모세포에서 파라크린 Wnt5a 신호 전달의 영향을 평가하기 위해 적용되었습니다.

체외에서 파라크린 비정규 Wnt 신호 전달 모델링

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This ...

이 프로토콜은 관심 있는 모든 세포 집단에서 파라크린 비표준 Wnt 신호 전달을 기능적 및 분자적으로 평가하는 매우 재현 가능한 방법을 설명합니다. 기능 및 분자 평가는 동일한 세포 집단에서 수행되며 Wnt/PCP 경로의 모든 구성 요소를 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 시작하려면 이전에 펠릿화된 C2C12 셀을 10ml의 C2C12 배지에 재현탁합니다.세포를 1:20의 비율로 희석하려면 9.5 밀리리터의 신선한 C2C12 배지가 들어있는 15 밀리리터 튜브에 0.5 밀리리터의 세포 현탁액을 넣고 P1000 피펫을 사용하여 혈청 학적 피펫과 부드럽게 혼합하고 희석 된 세포 현탁액 1 밀리리터를 새로운 4 개의 챔버가있는 웰의 각 웰에 넣고 인큐베이터에 넣습니다. O9-1 세포 삽입물을 도금하려면 O9-1 세포 펠릿을 10ml의 O9-1 성장 배지에 재현탁합니다. C2C12 세포 희석과 유사하게, O9-1 세포를 1:20의 비율로 희석한다.다음으로, 1 밀리리터의 O9-1 성장 배지로 채워진 새로운 4 개의 챔버가있는 우물의 각 웰 내부에 단일 투과성 삽입물을 놓습니다. 희석된 O9-1 세포 현탁액 300마이크로리터를 각 인서트에 추가하고 인서트가 완전히 잠기도록 합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 우물을 배양하십시오.O9-1 세포에서 siRNA 녹다운을 수행하려면 제조업체의 권장 사항에 따라 감소된 혈청 배지에서 siRNA 및 형질주입 시약을 원하는 농도로 희석합니다. 희석된 siRNA와 형질주입 시약을 부드럽게 혼합하고 혼합물을 실온에서 7분 동안 인큐베이션합니다. 18 내지 24시간의 세포 도금 후, siRNA 지질 복합체를 O9-1 세포 삽입물에 첨가하고 대략 34 내지 48시간 동안 배양한다.세포가 70 내지 80%confluency에 도달할 때, C2C12 약실 우물에서 매체를 제거하고 PBS에 가진 세포를 한번 세척하십시오. PBS를 제거한 후, 멸균된 P10 피펫 팁을 단일 방향으로 단단히 통과시켜 세포 단분자층의 전체 길이 또는 너비에 걸쳐 세포를 긁기 시작합니다. 세포가 긁히면 PBS 1 밀리리터를 빠르게 추가하십시오.그런 다음 컴퓨터와 현미경을 켭니다. 챔버 슬라이드를 스테이지에 놓고 대물 다이얼을 5배 배율로 돌립니다. 이미징 소프트웨어를 엽니다.카메라 탭을 클릭한 다음 라이브 버튼을 클릭하여 AxioCam IC 탭의 셀을 시각화합니다. 빛이 카메라와 컴퓨터 화면으로 전달될 수 있도록 조명 필터를 완전히 당겨 빼냈는지 확인하고 챔버 슬라이드를 수동으로 이동하거나 회전하여 AxioCam IC 탭의 라이브 이미지 중앙에 상처 영역을 배치합니다. 이미지를 촬영하려면 스냅을 클릭하여 이미지가 포함된 AxioCam IC 탭 옆에 있는 새 탭을 엽니다.이 정지 이미지를 저장하려면 파일을 클릭하고 다른 이름으로 저장을 선택한 다음 왼쪽 막대에서 바탕 화면을 선택하여 파일을 바탕 화면에 저장하고 파일 이름 상자에 파일 이름을 입력하고 그림을 czi 파일 형식으로 저장합니다. 사진을 tiff로 저장하려면 파일을 클릭하고 다른 이름으로 저장을 선택한 다음 파일 이름 상자에 파일 이름을 입력합니다. 파일 형식 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 tiff를 선택합니다.챔버 슬라이드를 수동으로 재배치하여 동일한 웰에 있는 상처의 다른 지점에서 2-3개의 이미지를 더 촬영합니다. 이미징 후 각 웰에서 PBS를 제거하고 C2C12 배지 1밀리리터를 추가합니다. 챔버 웰의 각 웰에 O9-1 세포를 포함하는 삽입물을 수동으로 배치하여 웰 삽입 공동 배양 시스템을 조립합니다.인서트의 바닥이 기본 C2C12 셀 바로 위에 오도록 인서트를 웰 아래로 부드럽게 밀어 넣습니다. 웰 인서트 구조체를 인큐베이터로 되돌리고 세포가 총 9-12시간 동안 이동하도록 합니다. 최적의 이동 시간을 결정하려면 상처 생성 후 6 시간에 세포를 확인한 다음 그 후 2-3 시간마다 세포를 확인하십시오.대조군 조건에서 세포가 상처를 완전히 덮을 때 실험을 종료합니다. 마이그레이션 분석 종료를 시작하고 마이그레이션 기간의 9 내지 12시간 후에 O9-1 세포 삽입물을 제거하여 웰 삽입 시스템 해체를 시작한다. C2C12 배지를 조심스럽게 흡인합니다.챔버 웰에 0.5ml의 PBS를 추가하고 이동 후 세포의 최종 이미지를 촬영합니다. 배지와 혼합 된 모든 PBS를 조심스럽게 흡입하고 키트 지침을 사용하여 챔버 웰에서 플라스틱 챔버를 제거합니다. C2C12 세포를 포함하는 하부 슬라이드를 남겨 둡니다.면역 염색을 위해 즉시 슬라이드를 4% 파라폼 알데히드로 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 파라포름알데히드를 제거하고 PBST가 포함된 0.1% 트리톤 X-100으로 슬라이드를 실온에서 15분 동안 세척합니다. 15분 후, PBST를 붓고 슬라이드를 PBS로 각각 10분 동안 2회 세척한다.그런 다음 슬라이드 주위에 소수성 펜으로 소수성 경계를 만들어 슬라이드에서 용액이 쏟아져 부착 세포의 파괴를 방지하는 것을 방지합니다. 다음으로, 약 0.5ml의 1%BSA 차단 용액을 소수성 경계 내의 슬라이드에 첨가하고 가습된 슬라이드 챔버에서 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다. 배양이 끝나면 블로킹 용액을 제거하고 소수성 경계 내에서이 슬라이드에 phalloidin 항체를 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.다음날 슬라이드를 빛에 노출되지 않도록 슬라이드 홀더에 넣으십시오. 세포를 실온에서 각각 10분 동안 PBS로 세 번 세척한다. DAPI 함유 장착 매체를 추가하고 유리 커버 슬립으로 슬라이드를 장착하고 표준 형광 현미경을 사용하여 세포를 캡처합니다.본 연구에서, 재조합 Wnt5a를 공동 배양 웰에 첨가하면 일부 영역의 완전한 회복과 함께 근원세포 이동이 9시간 가속화되었습니다. 세 가지 조건 모두에서 이동 근아세포는 잘 형성되고 돌출된 필로포디아 및 라멜리포디아와 액틴 세포골격 돌기의 비대칭 분극화를 포함하여 정상적인 이동 세포 형태를 나타냈습니다. 근원세포 이동에 대한 NCC 유래 Wnt5a의 파라크린 효과가 연구되었습니다.Wnt5a에 대해 50 나노 몰 siRNA로 처리하면 음성 대조군에 비해 Wnt5a 유전자 발현이 64 % 감소했습니다. NCC에서 Wnt5a 녹다운 후 크게 감소된 C2C12 마일 블라스트의 이동과 외인성 재조합 Wnt5a의 추가는 이러한 근모세포에서 이러한 이동 결함 및 형태학적 결함을 구출했습니다. 파라 크린 모델에서 신호 수신 세포 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 ROR2 수용체를 녹다운하고 유전자 발현을 54 % 감소시켰다근세포에서 ROR2의 녹다운은 NCC의 존재에도 불구하고 이동 능력을 감소시킵니다.외인성 재조합 Wnt5a는 ROR2 녹다운 후 근원세포 이동을 구출하지 못했으며, 이는 ROR2 고갈이 Wnt5a 신호를 수신하는 근원모세포의 능력을 방해함을 시사합니다. 배양 세포는 P10 팁으로 적절한 밀도로 스크래치를 한 번만 조립하고 조립되지 않은 공동 배양 시스템은 기본 세포를 방해하지 않고 조심스럽게 조립합니다. 이 기술은 신경 볏 세포 및 두 번째 심장 분야 생물학과 관련된 복잡한 Wnt/PCP 경로 내에서 특정 분자 신호 축을 연구하기 위한 개념 증명으로 사용되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

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