Name: 고고학적 유적에서 고대 DNA를 검색하기 위한 최적화된 뼈 샘플링 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 학습하세요 중세 유골에서 고대 DNA 추출을 위한 최적화된 뼈 샘플링 프로토콜을. 치아와 척추 등 다양한 해부학적 부위에서 DNA 수율을 극대화하는 방법을 확인하세요. 이 기법은 법의학 잔해 분석에도 적용 가능합니다.

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저자는 이러한 프로토콜의 개발 및 구현에 도움을 준 막스 플랑크 인류 역사 과학 연구소의 실험실 직원에게 감사드립니다. 이 작업은 Guido Brandt 박사, Elizabeth Nelson 박사, Antje Wissegot 및 Franziska Aron의 의견과 노력이 없었다면 불가능했을 것입니다. 이 연구는 막스 플랑크 협회, 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램에 따라 유럽 연구위원회 (ERC)가 보조금 계약 No 771234 - PALEoRIDER (WH, ABR) 및 시작 보조금 번호 805268 CoDisEASe (KIB에)의 자금 지원을 받았습니다.

<ol><li>Adler, C. J., Haak, W., Donlon, D., Cooper, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+recovery+of+DNA+from+ancient+teeth+and+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Archaeological+Science%22%5BJournal%5D)">Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones.</a> Journal of Archaeological Science. 38 (5), 956-964 (2011).</li>
<li>Dabney, J., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+highly+degraded+DNA+from+ancient+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Ancient+DNA%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth.</a> Ancient DNA: Methods and Protocols. , 25-29 (2019).</li>
<li>Palsdottir, A. H., Bläuer, A., Rannamäe, E., Boessenkool, S., Hallsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+a+limitless+resource%3A+ethics+and+guidelines+for+destructive+sampling+of+archaeofaunal+remains%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Not a limitless resource: ethics and guidelines for destructive sampling of archaeofaunal remains.</a> Royal Society Open Science. 6 (10), 191059(2019).</li>
<li>Pinhasi, R., Fernandes, D. M., Sirak, K., Cheronet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+the+human+cochlea+to+generate+bone+powder+for+ancient+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating the human cochlea to generate bone powder for ancient DNA analysis.</a> Nature Protocols. 14 (4), 1194-1205 (2019).</li>
<li>Latham, K. E., Miller, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+recovery+and+analysis+from+skeletal+material+in+modern+forensic+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sciences+Research%22%5BJournal%5D)">DNA recovery and analysis from skeletal material in modern forensic contexts.</a> Forensic Sciences Research. 4 (1), 51-59 (2019).</li>
<li>Mundorff, A. Z., Bartelink, E. J., Mar-Cash, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+preservation+in+skeletal+elements+from+the+World+Trade+Center+disaster%3A+Recommendations+for+mass+fatality+management%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+Sciences%22%5BJournal%5D)">DNA preservation in skeletal elements from the World Trade Center disaster: Recommendations for mass fatality management.</a> Journal of Forensic Sciences. 54 (4), 739-745 (2009).</li>
<li>Gamba, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+flux+and+stasis+in+a+five+millennium+transect+of+European+prehistory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genome flux and stasis in a five millennium transect of European prehistory.</a> Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).</li>
<li>Alberti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+DNA+sampling+of+ancient+bones+using+Computed+Tomography+scans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Optimized DNA sampling of ancient bones using Computed Tomography scans.</a> Molecular Ecology Resources. 18 (6), 1196-1208 (2018).</li>
<li>Hansen, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+ancient+DNA+preservation+in+petrous+bone+and+tooth+cementum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0170940(2017).</li>
<li>Sirak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+auditory+ossicles+as+an+alternative+optimal+source+of+ancient+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Human auditory ossicles as an alternative optimal source of ancient DNA.</a> Genome Research. 30 (3), 427-436 (2020).</li>
<li>Parker, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+investigation+of+human+DNA+preservation+in+medieval+skeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A systematic investigation of human DNA preservation in medieval skeletons.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18225(2020).</li>
<li>Pinhasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+ancient+DNA+yields+from+the+inner+ear+part+of+the+human+petrous+bone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Optimal ancient DNA yields from the inner ear part of the human petrous bone.</a> PLoS ONE. 10 (6), 0129102(2015).</li>
<li>Sirak, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimally-invasive+method+for+sampling+human+petrous+bones+from+the+cranial+base+for+ancient+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A minimally-invasive method for sampling human petrous bones from the cranial base for ancient DNA analysis.</a> BioTechniques. 62 (6), 283-289 (2017).</li>
<li>Orfanou, E., Himmel, M., Aron, F., Haak, W. Minimally-invasive sampling of pars petrosa (os temporale) for ancient DNA extraction. protocols.io. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w">https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w</a> (2020).</li>
<li>Damgaard, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+access+to+endogenous+DNA+in+ancient+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving access to endogenous DNA in ancient bones and teeth.</a> Scientific Reports. 5 (1), 1-12 (2015).</li>
<li>Harney, É, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimally+destructive+protocol+for+DNA+extraction+from+ancient+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A minimally destructive protocol for DNA extraction from ancient teeth.</a> Genome Research. 31 (3), 472-483 (2021).</li>
<li>Cooper, A., Poinar, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+DNA%3A+Do+it+right+or+not+at+all%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ancient DNA: Do it right or not at all.</a> Science. 289 (5482), 1139(2000).</li>
<li>Llamas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+field+to+the+laboratory%3A+Controlling+DNA+contamination+in+human+ancient+DNA+research+in+the+high-throughput+sequencing+era%5BTitle%5D)+AND+%22STAR%3A+Science+%26+Technology+of+Archaeological+Research%22%5BJournal%5D)">From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era.</a> STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).</li>
<li>Llamas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+field+to+the+laboratory%3A+Controlling+DNA+contamination+in+human+ancient+DNA+research+in+the+high-throughput+sequencing+era%5BTitle%5D)+AND+%22STAR%3A+Science+%26+Technology+of+Archaeological+Research%22%5BJournal%5D)">From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era.</a> STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).</li>
<li>Boessenkool, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bleach+and+mild+predigestion+improves+ancient+DNA+recovery+from+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Combining bleach and mild predigestion improves ancient DNA recovery from bones.</a> Molecular Ecology Resources. 17 (4), 742-751 (2017).</li>
<li>García-Garcerà, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragmentation+of+contaminant+and+endogenous+DNA+in+ancient+samples+determined+by+shotgun+sequencing%3B+Prospects+for+human+palaeogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fragmentation of contaminant and endogenous DNA in ancient samples determined by shotgun sequencing; Prospects for human palaeogenomics.</a> PLoS ONE. 6 (8), 24161(2011).</li>
<li>Malmström, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+on+contamination%3A+The+use+of+asymmetric+molecular+behavior+to+identify+authentic+ancient+human+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">More on contamination: The use of asymmetric molecular behavior to identify authentic ancient human DNA.</a> Molecular Biology and Evolution. 24 (4), 998-1004 (2007).</li>
<li>Basler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+the+contaminant+fraction+of+DNA+obtained+from+an+ancient+giant+panda+bone%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Reduction of the contaminant fraction of DNA obtained from an ancient giant panda bone.</a> BMC Research Notes. 10, 754(2017).</li>
<li>Kemp, B. M., Smith, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bleach+to+eliminate+contaminating+DNA+from+the+surface+of+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%22%5BJournal%5D)">Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth.</a> Forensic Science International. 154 (1), 53-61 (2005).</li>
<li>Korlević, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+microbial+and+human+contamination+in+DNA+extractions+from+ancient+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teeth.</a> BioTechniques. 59 (2), 87-93 (2015).</li>
<li>Dabney, J., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+highly+degraded+DNA+from+ancient+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth.</a> Methods in Molecular Biology. 1963, 25-29 (2019).</li>
<li>Hansen, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+ancient+DNA+preservation+in+petrous+bone+and+tooth+cementum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0170940(2017).</li>
<li>Gansauge, M. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+library+preparation+from+highly+degraded+DNA+using+T4+DNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 79(2017).</li>
<li>Peltzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAGER%3A+efficient+ancient+genome+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">EAGER: efficient ancient genome reconstruction.</a> Genome Biology. 17 (1), 60(2016).</li>
<li>Korneliussen, T. S., Albrechtsen, A., Nielsen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANGSD%3A+analysis+of+next+generation+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ANGSD: analysis of next generation sequencing data.</a> BMC Bioinformatics. 15, 356(2014).</li>
<li>Renaud, G., Hanghøj, K., Willerslev, E., Orlando, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gargammel%3A+A+sequence+simulator+for+ancient+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Gargammel: A sequence simulator for ancient DNA.</a> Bioinformatics. 33 (4), 577-579 (2017).</li>
<li>Ponce de León, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bony+labyrinth+is+an+indicator+of+population+history+and+dispersal+from+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human bony labyrinth is an indicator of population history and dispersal from Africa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), 4128-4133 (2018).</li>
<li>Nagaoka, T., Kawakubo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+petrous+part+of+the+temporal+bone+to+estimate+fetal+age+at+death%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%22%5BJournal%5D)">Using the petrous part of the temporal bone to estimate fetal age at death.</a> Forensic Science International. 248, 188(2015).</li>
<li>Norén, A., Lynnerup, N., Czarnetzki, A., Graw, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+angle%3A+A+method+for+sexing+using+the+petrous+bone%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physical+Anthropology%22%5BJournal%5D)">Lateral angle: A method for sexing using the petrous bone.</a> American Journal of Physical Anthropology. 128 (2), 318-323 (2005).</li>
</ol>

저자는 보고할 이해 상충이 없습니다.

고대 인간 집단 유전학의 현재 관행은 가능할 때마다 pars petrosa (2.1 단계)에서 우선적으로 샘플링하는 것입니다. 그러나, pars petrosa는 무수한 골격 평가 (예 : 인구 이력 32, 사망시 태아 연령 추정33 및 성 결정34)에 대해 매우 가치가 있기 때문에 얻기 어려운 샘플이 될 수 있으며, 역사적으로 DNA 분석을위한 파스 페트로 사의 샘플링은 매우 파괴적 일 수 있습니다3,4 (여기에 제시된 프로토콜 포함, 이러한 우려를 완화하기 위해 새로운 최소 침습적 프로토콜13,14가 널리 채택되었지만). 이것은 아주 최근까지 골격을 가로지르는 인간 DNA 회복에 대한 대규모의 체계적인 연구가 시도되지 않았기 때문에 더욱 복잡해집니다.11, 소피라미드를 사용할 수 없을 때 적절한 샘플링 전략을 찾는 것이 어렵습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 pars petrosa를 포함한 고고학/법의학 골격 유적에서 DNA 샘플링을 위한 최적화된 절차 세트와 4개의 추가 골격 요소에 걸친 7개의 대체 해부학적 샘플링 위치를 제공함으로써 이러한 문제를 완화하는 데 도움이 됩니다. 포함된 중요한 단계는 모두 비효율적인 샘플링(2.1.6단계 및 3.2.1.3단계) 또는 드릴링/절단 중 샘플 과열(3.1.6단계)로 인한 DNA 손실/손상 가능성을 최소화하기 위한 것입니다. 또한 프로토콜 전반에 걸쳐 고도로 분해된 샘플에서 최상의 성능을 보장하기 위해 전처리 단계를 수정/생략해야 할 수도 있다는 점이 언급되었습니다. 또한 여기에 제시된 선택된 요소 중에도 몇 가지 가능한 대체 샘플링 기술 (특히 pars petrosa13,14의 경우)이 남아 있으며 여기에 제시된 미개발 된 해부학 적 샘플링 위치 (즉, 거골 : 2.5 단계 및 척추 : 2.3 단계).
또한 이러한 프로토콜은 내인성 인간 DNA 분석을 위해 고품질의 고대 청소년-성인 유골(우수한 형태학적 보존)을 사용하여 설계 및 테스트되었음을 명심하는 것이 중요합니다. 제시된 결과는 추가 맥락에서 이러한 프로토콜의 사용에 대한 더 큰 탐구가 여전히 필요하기 때문에 더 고도로 분해된 물질, 기타 보존 맥락, 유아 유해, 비인간 유해 또는 병원체 또는 미생물군집에 대한 연구로 확장되지 않을 수 있습니다. 또한 여기에 제시된 대체 골격 요소(치아, 척추, 원위 지골 및 탈리)는 혼합된 유골 중 단일 개체에 할당하기 어려울 수 있으므로 단일 기원을 보장하기 위해 여러 요소에서 샘플링해야 합니다. 이러한 한계에도 불구하고 이러한 프로토콜을 널리 사용할 수 있도록 하면 인간 유해에 대한 광범위한 미래 aDNA/법의학 연구에 사용할 수 있도록 일반화되고 정량적으로 최적화된 프레임워크를 제공함으로써 샘플 선택 및 처리를 둘러싼 일부 이질성을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

DNA 회수 및 분석을 목적으로 고대 인간 유해를 샘플링하는 것은 본질적으로 파괴적입니다 1,2,3,4. 샘플 자체는 귀중한 표본이며 가능한 한 형태 학적 보존을 보존해야합니다. 따라서 대체 할 수없는 재료의 불필요한 파괴를 피하고 성공 확률을 극대화하기 위해 샘플링 관행을 최적화해야합니다. 현재의 모범 사례 기술은 법의학 조사5,6, 최적의 샘플링 개발이 연구7의 직접적인 목표가 아닌 고대 표본에 대한 연구 또는 인간이아닌 유해8를 활용하거나 매우 작은 해부학적 샘플링 위치를 대상으로 하는전용 연구(여기서는 뼈 가루가 나오는 골격 요소의 특정 영역을 나타내는 데 사용됨, 다운스트림 DNA 분석에 사용하기 위해 생성됨)9,10. 여기에 제시된 샘플링 프로토콜은 여러 개인의 여러 골격 요소에 걸친 DNA 보존에 대한 최초의 대규모 체계적인 연구에서 최적화되었습니다11. 모든 샘플은 독일 작센안할트 페이센(Peißen) 근처의 버려진 중세 정착지 크라카우어 베르크(Krakauer Berg)의 교회 묘지에서 발굴된 11명의 개인으로부터 회수된 골격 요소에서 비롯되었으며(자세한 샘플 인구 통계는 표 1 참조) 따라서 이 지리적/시간적 범위를 벗어난 샘플과 함께 사용하기 위해 수정이 필요할 수 있습니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>개인</td>
			<td>성</td>
			<td>사망 예정 연령</td>
			<td>14 C 날짜 (CE, 칼 2 시그마)</td>
		</tr><tr><td>크라001</td>
			<td>남성</td>
			<td>25-35</td>
			<td>1058-1219</td>
		</tr><tr><td>크라002</td>
			<td>여성</td>
			<td>20-22</td>
			<td>1227-1283</td>
		</tr><tr><td>크라003</td>
			<td>남성</td>
			<td>25</td>
			<td>1059-1223</td>
		</tr><tr><td>크라004</td>
			<td>남성</td>
			<td>15</td>
			<td>1284-1392</td>
		</tr><tr><td>크라005</td>
			<td>남성</td>
			<td>10-12</td>
			<td>1170-1258</td>
		</tr><tr><td>크라006</td>
			<td>여성</td>
			<td>30-40</td>
			<td>1218-1266</td>
		</tr><tr><td>크라007</td>
			<td>여성</td>
			<td>25-30</td>
			<td>1167-1251</td>
		</tr><tr><td>크라008</td>
			<td>남성</td>
			<td>20</td>
			<td>1301-1402</td>
		</tr><tr><td>크라009</td>
			<td>남성</td>
			<td>알려지지 않은</td>
			<td>1158-1254</td>
		</tr><tr><td>크라010</td>
			<td>남성</td>
			<td>25</td>
			<td>1276-1383</td>
		</tr><tr><td>크라011</td>
			<td>여성</td>
			<td>30-45</td>
			<td>1040-1159</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 유전적으로 결정된 성별, 고고학적으로 결정된 사망 추정 연령, 샘플링된 11명 모두에 대한 방사성 탄소 연대 측정(14C Cal 2-sigma). 이 표는 Parker, C. et al. 202011.
이러한 프로토콜을 사용하면 실험실에서 유도 된 DNA 오염이 제한적으로 5 개의 골격 요소 (pars petrosa 포함)에 걸쳐 8 개의 해부학 적 샘플링 위치에서 비교적 간단하고 효율적인 뼈 분말을 생성 할 수 있습니다. 이 5 개의 골격 요소 중에서, 4 개의 골격 요소에서 발견되는 7 개의 해부학 적 샘플링 위치는 소피라미드11,12의 파괴적인 샘플링에 대한 실행 가능한 대안으로 결정되었습니다. 여기에는 영구 어금니의 시멘트, 상아질 및 펄프 챔버가 포함됩니다. 상부 척추 노치와 흉추의 몸에서 수집 된 피질 뼈; 정점 술의 하부 표면과 원위 지골의 축에서 비롯된 피질 뼈; 그리고 탈리의 외부 부분을 따라 조밀 한 피질 뼈. pars petrosa 4,12,13,14, 상아질 및 치수 챔버 1,2,15의 샘플링을 위해 널리 적용되는 몇 가지 방법이 있지만, 시멘트 16으로부터 뼈 분말의 성공적인 생성을 설명하는 발표 된 방법 , 척추체, 하부 척추 노치 및 거골은 얻기 어려울 수 있습니다. 따라서 여기에서는 petrous 피라미드에 최적화 된 샘플링 프로토콜을 보여줍니다 (3.1 단계). 성인 어금니의 시멘트 (단계 3.2.1), 상아질 (단계 3.2.2) 및 치수 (단계 3.2.3); 척추체의 피질 뼈 (단계 3.3.1) 및 상 척추 아치 (단계 3.3.2); 원위 지골 (단계 3.4); 및 talus (3.5 단계)는 aDNA 및 법의학 연구 모두에 이러한 골격 요소를보다 광범위하게 사용할 수 있도록합니다.

<table><tbody><tr><td># 16 치과 드릴 비트</td><td>NTI</td><td>H1-016-HP</td><td>예시 드릴링 비트</td></tr><tr><td>0.6mm 스크롤 톱 블레이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-097</td><td>블레이드 보석 톱</td></tr><tr><td>22mm 다이아몬드 커팅 휠</td><td>Kahla</td><td>SKU 806 104 358 514 220</td><td>Dremel 커팅 어태치</td></tr>먼트 <tr><td>상업용 표백제</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1818018</td><td></td></tr><tr><td>Control Company Ultra-Clean Supreme 알루미늄 호일</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-078-29X</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 튜브 (2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 225-01 Flex Shaft Attachment</td><td>Dremel</td><td>225-01</td><td>Dremel 유연한 확장</td></tr><tr><td>Dremel 4300 로터리 툴</td><td>Dremel</td><td>4300</td><td>예시 드릴</td></tr><tr><td>Dremel 콜릿 및 너트 키트</td><td>Dremel</td><td>4485</td><td>다양한 어댑터용 어댑터 Dremel 도구 부착물/비트</td></tr><tr><td>Eagle 33 갤런 레드 바이오하자드 폐기물 봉투</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-988-501</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf DNA LoBind 2 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-698-792</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(분자생물학 등급)</td><td>Millipore Sigma</td><td>1.08543</td><td></td></tr><tr><td>FDA 승인 레벨 2 수술용 마스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-206-0397</td><td>PPE</td></tr><tr><td>Fisherbrand 컴포트 니트릴 장갑</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-041-171X</td><td>PPE</td></tr><tr><td>Fisherbrand 안전 안경</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-130-208X</td><td>PPE</td></tr><tr><td>Granger 고정식 바이스</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1336173</td><td>벤치탑 바이스</td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure DNase/Rnase 무료 증류수</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>보석상 Saw</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-231</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>Labconco 정수기 로직 생물 안전 캐비닛</td><td>Fisher Scientific</td><td>30-368-1101</td><td></td></tr><tr><td>LookOut DNA 지우기</td><td>Millipore Sigma</td><td>L9042-1L</td><td></td></tr><tr><td>중형 계량 보트</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS120223</td><td></td></tr><tr><td>MSC 10pc 플라이어/클램프 세트</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-129-5352</td><td>기타&nbsp; 드릴링/커팅 시 시료를 안전하게 고정하기 위한 클램프/바이스 그립</td></tr><tr><td>Sartorius Quintix Semi-Micro Balance</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-560-019</td><td>밀폐형 밸런스</td></tr><tr><td>타이벡 작업복(후드 포함</td>) <td>Fisher Scientific</td><td>01-361-7X</td><td>PPE</td></tr><tr><td>계량지</td><td>히드로 과학</td><td>HS120116</td><td></td></tr></tbody></table>

고고학적 유적에서 고대 dna를 검색하기 위한 최적화된 뼈 샘플링 프로토콜

Optimized Bone Sampling Protocols for the Retrieval of Ancient DNA from Archaeological Remains

여기에 제시된 방법은 입력 샘플 자료를 제한하면서 고대 고고학 유적에서 인간 DNA를 회수 할 수있는 기회를 극대화하려고합니다. 이것은 골격을 가로지르는 DNA 회복의 비교 분석에서 가장 많은 양의 고대 DNA(aDNA)를 산출하는 것으로 이전에 결정된 해부학적 샘플링 위치를 대상으로 수행되었습니다. 이전 연구에 따르면 이러한 프로토콜은 고고학적 유적에서 고대 인간 및 병원체 DNA를 성공적으로 회수할 수 있는 기회를 극대화합니다. DNA 수율은 이전에 Parker et al. 2020은 독일 Peißen 근처의 버려진 중세 정착지인 Krakauer Berg의 묘지에서 회수된 중세(방사성 탄소(약 1040-1400 CE, 보정된 2시그마 범위) 묘지에서 회수된 11명의 개체에서 여러 골격 요소에 대한 aDNA 보존에 대한 광범위한 조사에서 평가되었습니다. 5 개의 골격 요소 (pars petrosa, 영구 어금니, 흉추, 원위 지골 및 거골)에 걸쳐있는이 8 개의 샘플링 지점은 모든 요소와 개인에 걸쳐 전체 평균보다 훨씬 높은 고품질 고대 인간 DNA를 성공적으로 산출했습니다. 수확량은 가장 일반적인 다운스트림 인구 유전자 분석에 사용하기에 적합했습니다. 우리의 결과는 고고학 유적에서 고대 인간 DNA를 분석하는 것과 관련된 대부분의 연구에서 이러한 해부학적 샘플링 위치를 우선적으로 사용하는 것을 뒷받침합니다. 이러한 방법을 구현하면 귀중한 고고학 표본의 파괴를 최소화하는 데 도움이됩니다.

별도의 연구 11에서, 석회화 된 조직2의 짧은 단편에 최적화 된 표준 DNA 추출 프로토콜을 사용하여11 명의 개인의 각 해부학 적 샘플링 위치에서 생성 된 뼈 분말로부터 DNA를 추출했습니다. 그런 다음 단일 가닥 라이브러리를28개로 생성하고 HiSeq 4000(75bp 쌍 끝)에서 샘플당 ~20,000,000회 읽기의 깊이로 시퀀싱했습니다. 이어서, 생성된 서열 데이터를 EAGER 파이프라인29(BWA 설정: 시드 길이 32, 미스매치 페널티 0.1, 매핑 품질 필터 37)를 사용하여 내인성 인간 DNA 함량에 대해 평가하였다. 모든 대표 결과는 일관성을 위해 Parker et al. 202011과 동일한 메트릭을 사용하여 보고됩니다. pars petrosa의 분말 부분의 라이브러리는 조사 된 다른 23 개의 해부학 적 샘플링 위치보다 평균적으로 더 높은 내인성 DNA를 산출했습니다 (그림 6A-B). 이 프로토콜에 제시된 7 개의 추가 해부학 적 샘플링 위치 (시멘트, 치수 챔버의 첫 번째 통과 및 영구 어금니의 상아질, 척추체의 피질 뼈 및 흉추의 상 척추 궁, 원위 지골의 정점 술의 피질 뼈 및 거골 목의 피질 뼈)는 다음으로 높은 수율을 생성했습니다 (이러한 해부학 적 샘플링 위치간에 통계적 유의성이 없음; 그림 6A-B; 보충 파일 1: 내인성 DNAPreCap). 이러한 대체 위치는 모두 미토콘드리아 분석 및 단일 염기 다형성(SNP) 분석과 같은 표준 집단 유전학 분석에 적합한 DNA 수율을 일관되게 생성했습니다. 모든 해부학적 샘플링 위치에서 비롯된 라이브러리의 중복률은 낮았습니다(클러스터 계수 &lt; 평균 1.2, 고유한 매핑 읽기에 대한 모든 매핑 읽기의 비율로 계산됨, 표 2; 보충 파일 1: ClusterFactor)를 참조하여 스크리닝된 모든 라이브러리가 매우 복잡함을 나타냅니다. 유사하게, 평균 외인성 인간 DNA 오염 추정치는 평균 &lt; 2%(남성의 X 염색체 오염, ANGSD30 파이프라인에 의해 보고됨)로 우월한 척추궁을 제외한 모든 해부학적 샘플링 위치(평균 추정 오염: 2.11%, 하나의 샘플이 이상치로 제거됨; KRA005: 19.52%, 표 2 참조; 보충 파일 1: X오염). 평균 단편 길이 (30 bp &lt; 모든 판독 값을 제거하기 위해 필터링 한 후)는 치수 챔버 및 상아질에서 수집 된 재료에서 가장 낮았으며 다른 해부학 적 샘플링 위치간에 유의 한 차이가 없었습니다 (각각 55.14 bp 및 60.22 bp, 평균 중앙값 62.87, 쌍별 p- 값 &lt; 0.019, 표 2; 보충 파일 1: AvgFragLength). 또한 치아와 흉추에는 각각 높은 내인성 DNA 회수가 관찰 된 여러 해부학 적 샘플링 위치가 포함되어있어 pars petrosa의 대안으로 특히 적합합니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63250/63250fig06.jpg"> 그림 6: 스크리닝된 모든 샘플에 대한 인간 DNA 함량. 검은색 선은 전체 평균을 나타내고 빨간색 선은 중앙값을 나타냅니다(고체: 인간 DNA 비율, 점선: 생성된 백만 건의 판독당 매핑된 인간 판독 수). 평균 인간 DNA 비율이 전체 평균 (8.16 %)보다 높은 개별 해부학 적 샘플링 위치는 모든 분석에서 채색됩니다. (A) hg19 참조 게놈에 매핑되는 판독의 비율. 파란색 점선은 파이프라인의 매핑 매개변수(시뮬레이션된 손상이 있는 hg19 참조 게놈에서 5,000,000회 읽기의 무작위 분포를 시뮬레이션하기 위해 Gargammel31 을 사용하여 생성됨)에 주어진 이론적 최대값을 나타냅니다. 개별 평균(검은색 X)과 중앙값(빨간색 원)은 전체 평균보다 평균 인간 DNA 비율이 높은 샘플에 대해 보고됩니다. 신뢰 구간은 통계적 특이치를 제외한 상한과 하한을 나타냅니다. (B) 시퀀싱 노력의 백만 판독 당 hg19 참조 게놈에 매핑되는 고유 판독 수 (75 bp 쌍 말단). 신뢰 구간은 통계적 특이치를 제외한 상한과 하한을 나타냅니다. 이 수치는 Parker, C. et al. 202011. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63250/63250fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 2: 모든 해부학적 샘플링 위치에 대한 평균 복제 수준(매핑 읽기/고유 읽기), 평균 및 중앙값 단편 길이, X 염색체 오염 추정치. 평균의 표준 오류로 보고된 오류입니다. 이 표는 Parker, C. et al. 202011.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>샘플링 위치</td>
			<td>평균 중복 계수(# 매핑된 읽기/# 고유한 매핑된 읽기)</td>
			<td>평균 조각 길이(bp)</td>
			<td>X 염색체 오염의 평균 추정 비율</td>
		</tr><tr><td>페트로스 피라미드</td>
			<td>1.188 ± 0.006</td>
			<td>65.40 ± 1.36</td>
			<td>0.000 ± 0.003</td>
		</tr><tr><td>시멘트</td>
			<td>1.197 ± 0.028</td>
			<td>67.28 ± 1.76</td>
			<td>0.011 ± 0.003</td>
		</tr><tr><td>상아질</td>
			<td>1.188 ± 0.061</td>
			<td>60.22 ± 2.37</td>
			<td>0.002 ± 0.007</td>
		</tr><tr><td>펄프</td>
			<td>1.179 ± 0.024</td>
			<td>55.14 ± 2.90</td>
			<td>0.013 ± 0.006</td>
		</tr><tr><td>원위 지골</td>
			<td>1.191 ± 0.049</td>
			<td>65.95 ± 1.08</td>
			<td>0.013 ± 0.005</td>
		</tr><tr><td>척추체</td>
			<td>1.194 ± 0.037</td>
			<td>66.14 ± 1.03</td>
			<td>0.008 ± 0.003</td>
		</tr><tr><td>우수한 척추 아치</td>
			<td>1.19 ± 0.017</td>
			<td>63.02 ± 1.23</td>
			<td>0.021 ± 0.009*</td>
		</tr><tr><td>거골</td>
			<td>1.198 ± 0.010</td>
			<td>68.20 ± 1.24</td>
			<td>0.011 ± 0.003</td>
		</tr><tr><td>*샘플 KRA005는 0.1952에서 이상치로 제거되었습니다.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>코드 가용성 이 원고의 분석에 사용된 모든 분석 프로그램과 R 모듈은 해당 저자로부터 자유롭게 구할 수 있습니다. 모든 사용자 지정 R 코드는 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
데이터 가용성 대표 결과 계산에 사용된 모든 원시 데이터는 유럽 뉴클레오티드 아카이브 ENA 데이터 저장소(수탁 번호 PRJ-EB36983) 또는 Parker, C. et al.11의 보충 자료에서 자유롭게 사용할 수 있습니다.
보충 파일 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63250/SupplementalFile1.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 중세 개인의 5가지 다른 골격 요소(방사성 탄소, 약 1040-1400 CE, 보정된 2-시그마 범위)에 걸쳐 8개의 권장 해부학적 샘플링 위치(주어진 골격 요소의 특정 위치)에서 뼈 분말을 수집하기 위한 일련의 모범 사례 프로토콜을 제시합니다.

고고학적 유적에서 고대 DNA를 검색하기 위한 최적화된 뼈 샘플링 프로토콜

The methods presented here seek to maximize the chances for the recovery of human DNA from ancient archaeological remains while limiting input sample ...

이러한 프로토콜은 다양한 골격 요소에 걸친 다운스트림 DNA 추출에 사용하기 위한 뼈 분말 생성에 대한 모범 사례 지침으로 사용됩니다. 상아질과 소피라미드 이외의 위치에 대해 발표된 고대 DNA 샘플링 프로토콜이 몇 가지 있습니다. 오늘은 세 가지 대안에 대한 자세한 샘플링 방법을 보여 드리겠습니다.이러한 방법은 또한 분해된 법의학 유해와 함께 사용할 수 있는 큰 잠재력을 보여줄 뿐만 아니라 비인간 표본으로 유사한 기술을 개발하기 위한 기준선으로도 사용됩니다. UV 조명이 장착된 PCR 후드 또는 생물안전 캐비닛 아래의 전용 클린룸에서 모든 샘플링을 수행합니다. 공기 흐름을 끄고 멸균 알루미늄 호일을 벤치 상단에 펴서 흩어진 뼈 가루나 파편을 잡습니다.계량 용지 한 장을 멸균 계량 트레이에 넣습니다. 휴대용 클램프를 사용하여 뿌리가 칭량 트레이 위를 향하도록 에나멜로 오염 제거 된 어금니를 잡습니다. 치과 용 드릴에 다이아몬드 가장자리 원형 커팅 휠을 장착하십시오.드릴을 중간 속도 설정으로 설정한 상태에서 드릴 가장자리를 약 20도 각도로 뿌리까지 가볍게 터치합니다. 샘플을 트레이 아래쪽으로 긁어 뿌리에서 가장 바깥쪽에 있는 노란색 재료를 수집합니다. 상아질의 더 가벼운 물질이 보이면 수집을 중지하십시오.분말을 2 밀리리터 LoBind Safe-Lock 튜브로 옮기고 최소 0.01 밀리그램의 정확도로 밀폐 된 저울을 사용하여 수집 된 분말 질량을 기록합니다. 추출을 위해 계량 용지에서 2밀리리터 LoBind 안전 잠금 튜브로 분말을 옮깁니다. 이 튜브를 섭씨 20도에서 보관하십시오.모든 뼈 조각과 가능한 한 많은 분말을 회수하십시오. 각 샘플링 사이에 호일을 교체하고 사용한 호일을 오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백에 폐기합니다. 작업 영역의 오염을 제거하고 다음 뼈로 이동하기 전에 매번 벤치 상단에 멸균 알루미늄 호일을 펼칩니다.작은 계량 용지를 표준 계량 트레이에 넣습니다. 치과 드릴을 사용하여 상 척추 궁의 피질 뼈의 가장 바깥 쪽 층을 제거하고 폐기하십시오. 그런 다음 척추를 핸드 클램프에 고정하고 가시 돌기를 바깥쪽으로 향하게하고 상반을 아래로 향하게합니다.척추를 잡고있는 동안 저속 및 높은 토크의 라멜라와 가시 돌기의 융합에 의해 형성된 V 자형 노치의 중심으로 위쪽으로 뚫습니다. 저항이 눈에 띄게 떨어지면 드릴링을 중단하십시오. 드릴링 위치를 약간 변경하고 50-100 밀리그램의 뼈 가루가 수집 될 때까지 반복하십시오.추출을 위해 계량 종이에서 2 밀리리터 LoBind 튜브로 뼈 가루를 옮기고 섭씨 20도에서 보관하십시오. 호일을 폐기하기 전에 모든 뼈 조각과 가능한 한 많은 분말이 회수되었는지 확인하십시오. 앞에서 설명한 대로 작업 영역의 오염을 제거하고 샘플 수집을 준비합니다.작은 계량 용지를 표준 계량 트레이에 넣습니다. 거골 돔을 위쪽으로, 내측 표면을 칭량 트레이 위로 집진기 쪽으로 잡습니다. 저속 및 높은 토크로 설정된 로우 게이지 비트가있는 치과 드릴을 사용하여 거골 목에서 약 1mm 깊이까지 피질 뼈를 긁습니다.드릴링 위치를 변경하고 약 50-100 밀리그램의 뼈 가루가 수집 될 때까지 이것을 반복하십시오. 이 뼈 분말을 계량 종이에서 추출을 위해 2 밀리리터 LoBind 튜브로 옮깁니다. 분말을 섭씨 20도에서 무기한 보관하십시오.남은 뼈와 여분의 분말은 섭씨 25도의 건조하고 온도가 조절되는 멸균 환경에 보관하십시오. 모든 폐기물은 오토클레이브 생물학적 위험 백 또는 용기에 폐기하십시오. 재사용 가능한 모든 장비를 멸균하거나 오염을 제거하고 각 샘플링 사이에 UV에 노출시킵니다.Pars petrosa는 조사 된 다른 23 개의 해부학 적 샘플링 위치보다 더 높은 내인성 DNA를 산출했습니다. 이 프로토콜에 제시된 7 개의 추가 해부학 적 샘플링 위치는 다음으로 높은 수율을 산출했습니다. 대체 위치는 표준 집단 유전학 분석에 적합한 DNA 수율을 일관되게 생성했습니다.모든 해부학적 샘플링 위치에서 비롯된 라이브러리의 중복률은 낮았으며 이는 높은 복잡성을 나타냅니다. 흉추뿐만 아니라 치아도 적절한 분자 회복을 보였다. 뼈 샘플링의 가장 어려운 측면 중 하나는 드릴을 잡는 방법, 드릴링할 위치, 드릴링을 중지할 시기와 같은 드릴링 프로세스입니다.

optimized-bone-sampling-protocols-for-retrieval-ancient-dna-from

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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