알리자린 레드 염색을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 화학적으로 유발된 뼈 손실 검출

이 방법은 제브라 피쉬의 화학 물질에 의해 유발 된 뼈 독성을 감지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 고정 조직의 Alizarin Red 염색은 여러 표본의 비교를 용이하게 할 수 있는 골격 변화의 영구적인 기록을 생성합니다. 이 기술은 골다공증의 특징 중 하나가 골량의 감소이기 때문에 제브라 피쉬 모델에서 골다공증을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

수정 후 9 일에 각 그룹에서 무작위로 10 개의 제브라 피쉬 유충을 제거하고 2 시간 동안 2 % 파라 폼 알데히드 1 밀리리터와 1X PBS에 물고기를 고정시킵니다. 용액을 따라 내고 pH 7.5 또는 10 밀리몰 염화 마그네슘의 100 밀리몰 트리스 HCL을 사용하여 제브라 피쉬 유충을 씻으십시오. 탈염색을 위해, 용액을 따라 내고 원고에 설명 된대로 일련의 용액에서 유충을 5 분 동안 배양하십시오.

최종 배양 후, 용액을 따라 내고 3 % 과산화수소와 0.5 % 수산화 칼륨으로 구성된 용액으로 표백하여 안료를 제거합니다. 안료가 완전히 제거 될 때까지 10 분마다 한 번씩 관찰하십시오. 제브라 피쉬 유충을 25 % 글리세린, 0.1 % 수산화 칼륨으로 거품이 없을 때까지 각각 10 분 동안 여러 번 헹굽니다.

0.01 % Alizarin 1 밀리리터에 담가 유충을 얼룩지게하십시오. 용액을 따라 내고 50 % 글리세린 또는 0.1 % 수산화 칼륨 1 밀리리터를 추가하여 배경을 제거합니다. 후속 관찰을 위해 신선한 50 % 글리세린 또는 0.1 % 수산화 칼륨에 생선을 보관하십시오.

한 번에 하나의 유충을 유리 슬라이드로 옮기고 유충을 액체 방울의 중앙에 유지합니다. 실체 현미경으로 유충을 관찰하십시오. 카메라를 켭니다.

소프트웨어를 열고 기본 설정을 유지합니다. AE를 클릭하고 적절한 노출 시간을 선택하여 최상의 이미지를 얻으십시오. 동일한 설정에서 모든 이미지를 캡처합니다.

나중에 분석할 수 있도록 이미지를 dot tiff 형식으로 저장합니다. imageJ 아이콘을 두 번 클릭합니다. 저장된 이미지를 분석하려면 파일을 클릭 한 다음 열기를 클릭하고 이미지를 클릭 한 다음 8 비트를 입력하고 선택하십시오.

편집을 클릭하고 반전하십시오. 분석을 클릭 한 다음 보정하십시오. 팝업 인터페이스에서 보정되지 않은 OD를 선택합니다.

하단 인터페이스의 왼쪽 하단에서 전역 보정을 확인하고 확인을 클릭합니다. 분석을 클릭하고 배율을 설정한 다음 배율을 제거합니다. 아래 글로벌을 확인하고 확인을 클릭하십시오.

분석을 클릭 한 다음 측정을 설정하십시오. 팝업 인터페이스에서 항목 영역을 선택합니다. 아래의 임계값 제한을 확인하여 선택한 범위만 측정하고 확인을 클릭합니다.

이미지를 클릭하고 임계 값을 조정 한 다음 팝업 인터페이스 중간에있는 슬라이더를 밉니다. 하나의 이미지에서 테스트할 모든 대상이 선택되도록 적절한 임계값을 선택합니다. 그리고 설정을 클릭합니다.

분석을 클릭 한 다음 측정하고 날짜를 저장하십시오. Alizarin Red Staining은 제브라 피쉬 유충의 뼈 광물 화 변화를 측정하기위한 민감하고 구체적인 방법입니다. 수정 후 9 일이 지나면 parasphenoid, opercular, ceratobranchial 및 notochord와 같은 머리 골격의 많은 뼈가 광물 화되어 빨간색으로 염색됩니다.

대조적으로, 이석과 같은 뼈가 없는 구조는 갈색으로 검은색으로 보입니다. 전체 염색 면적을 정량화하기 위해 수행된 디지털 분석은, 납 아세테이트 처리군의 리터당 10 및 20 밀리그램에 대해 염색 면적의 현저한 감소를 보였다. 뼈 광물화의 변화는 용량 의존성을 보였다.

더 나은 염색 효과와 관찰을 위해서는 제브라 피쉬 유충의 원래 색소를 제거하고 표백 후 거품을 제거하는 것이 중요합니다.