Name: 알리자린 레드 염색을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 화학적으로 유발된 뼈 손실 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: 학습하세요 알리자린 레드 염색을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 화학적으로 유발된 뼈 손실을 검출하는 방법을. 이 기술은 Danio rerio를 이용한 골다공증 연구 및 다양한 유해 독성 물질에 의한 골 독성 평가에 활용될 수 있습니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81872646; 81811540034; 81573173)과 강소 고등 교육 기관의 우선 학업 프로그램 개발 (PAPD)의 지원을 받았습니다.

여기에 설명 된 모든 동물 절차는 Soochow 대학의 윤리위원회 동물 관리 연구소에서 검토하고 승인했습니다.
1. 어류 사육 및 배아 수집 14
<ol><li>매일 세 번 물고기를 먹이십시오. 제브라 피쉬가 28.5 ± 0.5 ° C에서 14:10 시간의 명암 주기로 유지되도록하십시오.</li>
	<li>저녁에 수컷과 암컷 성체 물고기를 산란 탱크의 격리 보드로 2 : 1 수컷 대 암컷 비율로 분리하십시오.</li>
	<li>다음날 아침 9:00 AM에 격리 보드를 제거하고 2 시간 후에 배아를 수집합니다.</li>
	<li>실험 전에 28.5°C로 유지되는 생화학적 인큐베이터에 배아를 넣었다.</li>
</ol>2. 화학 물질 노출
<ol><li>모국을 준비하십시오 : 아세트산 납 삼수화물 (5g)을 계량하고 교반하면서 초순수 (50mL)에 녹입니다. 주의 : PbAc는 독성이 있습니다. 적절한 방진 마스크, 보호 복 및 장갑을 착용하십시오. 흄 후드 아래에서 실험을 수행하십시오.</li>
	<li>제브라 피쉬 배아를 선택하여 깨끗한 6 웰 플레이트 (제브라 피쉬 사육수 3mL에 웰 당 30 개의 배아, 조성은 표 1 참조)에 무작위로 분배합니다. 수정 후 2 시간에서 120 시간 (hpf)까지 PbAc (0, 5, 10, 20 mg / L)로 배아를 처리하십시오. 참고: PbAc의 농도는 용량 범위 측정 실험에 따라 선택되었습니다. 결과는 제브라 피쉬 배아에서 납 아세테이트의 LC50이 120 hpf에서 41.044 mg / L임을 보여주었습니다. 따라서, 최고 농도는LC50 의 절반으로 설정되고 일련의 용액은 2배 희석에 의해 제조되었다.</li>
	<li>수정 후 5 일부터 하루에 두 번 유충을 먹이십시오 (dpf). 제브라 피쉬 배아를 28.5 ± 0.5 ° C에서 14:10 시간의 명암 주기로 유지하십시오.</li>
	<li>9dpf까지 24시간마다 무연 배지(제브라피쉬 번식수)를 새로 고칩니다. 참고 : 실험 완료 후, 모든 납 함유 용액을 지정된 액체 탱크에 붓고 실험 관리 센터에서 처리했습니다.</li>
</ol>3. 알리자린 레드 염색
알림: 전체 염색 과정에서 적절한 방진 마스크, 보호 복 및 장갑을 착용하십시오. 모든 용액의 조성은 표 1에 나타내었다.
<ol><li>특정 염색 단계 참고: 염색 공정은 실온에서 24-웰 플레이트에서 수행되었다. 각 용액을 첨가한 후 24웰 플레이트를 저속으로 설정된 쉐이킹 테이블 위에 놓습니다.<ol><li>9dpf에서 각 그룹에서 무작위로 10마리의 제브라피쉬 유충을 제거하고 1mL의 2% 파라포름알데히드/1x 인산염 완충 식염수에 2시간 동안 물고기를 고정합니다.</li>
		<li>용액을 따라 내고 제브라 피쉬 유충을 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 10 mM MgCl2 로 10 분 동안 세척하십시오.</li>
		<li>용액을 따라 내고 무수 에탄올 (EtOH) 용액 (80 % EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 10 mM MgCl2, 50 % EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH = 7.5) 및 25 % EtOH / 100mM Tris-HCl (pH = 7.5).</li>
		<li>용액을 따라 내고, 3%H2O2및 0.5% KOH로 이루어진 용액으로 표백하여 안료를 제거하고, 안료가 완전히 제거될 때까지 10분마다 한 번씩 관찰한다.</li>
		<li>제브라 피쉬 유충을 25 % 글리세린 / 0.1 % KOH로 거품이 없을 때까지 각각 10 분 동안 여러 번 헹굽니다. 알림: 거품을 피하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 제브라 피쉬 몸체의 거품이 현미경 아래에서 검은 색 시야로 나타나 관찰 및 정량 분석에 영향을 미칩니다.</li>
		<li>0.01 % 알리자린 1mL에 50 분 동안 담가 유충을 염색합니다.</li>
		<li>용액을 따라 내고 1mL의 50 % 글리세린 / 0.1 % KOH를 10 분 동안 첨가하여 배경을 제거합니다. 후속 관찰을 위해 신선한 50 % 글리세린 / 0.1 % KOH에 물고기를 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 이미지 획득
<ol><li>매번 하나의 유충을 유리 슬라이드에 옮겨 유충을 액체 방울의 중간에 유지합니다.</li>
	<li>실체 현미경으로 유충을 관찰하십시오.</li>
	<li>카메라를 켜고 소프트웨어를 열고( 재료 표 참조) 기본 설정을 유지합니다.</li>
	<li>AE를 클릭하고 적절한 노출 시간(이 실험에서는 60ms)을 선택하여 최상의 이미지를 얻습니다.</li>
	<li>동일한 설정에서 모든 이미지를 캡처합니다. 나중에 분석할 수 있도록 이미지를 .tif 형식으로 저장합니다.</li>
</ol>5. 이미지 분석
참고: 이미지 분석을 위한 샘플 그래프 세트가 있는 예는 보충 파일을 참조하십시오.
<ol><li>ImageJ 아이콘을 두 번 클릭하고 4.5단계에서 저장한 이미지를 분석합니다.<ol><li>파일 | 열기 4.5단계에서 저장한 이미지를 엽니다.</li>
		<li>클릭 이미지 | 입력하고 8비트를 선택합니다.</li>
		<li>편집 | 반전.</li>
		<li>분석 | 보정, 팝업 인터페이스에서 보정되지 않은 OD를 선택하고 하단 인터페이스의 왼쪽 하단에서 전역 보정을 확인한 다음 확인을 클릭합니다.</li>
		<li>분석 | 스케일 설정 | 클릭하여 스케일 제거 팝업 인터페이스에서 글로벌 아래, 클릭 OK.</li>
		<li>분석 | 측정을 설정하고 팝업 인터페이스에서 항목 영역을 선택한 다음 아래의 임계값 제한(선택한 범위만 측정)을 확인하고 확인을 클릭합니다.</li>
		<li>클릭 이미지 | 조정| 임계값에서 팝업 인터페이스 중간에 있는 슬라이더를 밀어 적절한 임계값(각 이미지의 임계값 변경)을 선택하여 하나의 이미지에서 테스트할 모든 대상이 선택되도록 하고 설정을 클릭합니다.</li>
		<li>분석 | 측정. 각 그룹의 날짜를 기록한다.</li>
	</ol></li>
	<li>일원 분산 분석과 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 차이를 분석하고 유의 수준을 p < 0.001(***)로 설정합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Compston, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+registration+of+agents+for+prevention+and+treatment+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%3A+an+update+from+the+Group+for+the+Respect+of+Ethics+and+Excellence+in+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science.</a> Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).</li>
<li>Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+preventing+bone+loss+induced+by+aromatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors.</a> Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).</li>
<li>Kataba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+exposure+to+environmentally+relevant+lead+levels+induces+oxidative+stress+and+neurobehavioral+alterations+in+larval+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio).</a> Aquatic Toxicology. 227, 105607(2020).</li>
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<li>Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+as+a+model+to+assess+chemical+toxicity+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fish as a model to assess chemical toxicity in bone.</a> Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GH%2FIGF+axis+in+arsenite-induced+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos.</a> Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820(2020).</li>
<li>Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+osteoporosis%3A+a+primary+testing+platform+for+screening+new+osteo-active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 6(2019).</li>
<li>Charles, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+quantitative+micro-computed+tomographic+analysis+in+zebrafish+to+define+gene+function+during+skeletogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis.</a> Bone. 101, 162-171 (2017).</li>
<li>Hammond, C. L., Moro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+transgenic+reporters+to+visualize+bone+and+cartilage+signaling+during+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 91(2012).</li>
<li>Bensimon-Brito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+in+vivo+staining+with+alizarin+red+S--a+valuable+approach+to+analyse+zebrafish+skeletal+mineralization+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration.</a> BMC Developmental Biology. 16, 2(2016).</li>
</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

제브라 피쉬는 뼈 대사 질환을 연구하기에 적합한 모델입니다. 설치류 모델에 비해 제브라 피쉬 모델은 비교적 빠르게 확립 할 수 있으며 질병의 중증도 측정이 더 쉽습니다. 야생형 제브라 피쉬 유충에서 머리 골격의 광물 화는 5dpf에서 발생하고 축 골격은 7dpf15에서 발생합니다. 따라서 PS, OP, CB 및 NC와 같은 두개골 뼈는 9dpf에서 잘 발달되어 있습니다. 유충이 완전히 염색되고 표백 된 후 연조직이 제거되어 물고기 몸체가 투명하게 보입니다. 알리자린 레드 염색 시약을 첨가하여 제브라피쉬의 미네랄 뼈를 빨간색으로 염색하고 시각화했습니다. 
이미지 분석은 이 실험에서 신뢰할 수 있는 실험 결론을 얻는 데 중요합니다. 좋은 자세와 깨끗한 배경을 가진 제브라 피쉬의 사진이 정량 분석을 위해 선택되었습니다. 단일 이미지에 대해 염색 된 영역을 정량화하면 한 물고기의 빨간색으로 염색 된 모든 광물 화 된 뼈가 계산됩니다. 따라서 납...

최근 연구에 따르면 글루코 코르티코이드, 아로마 타제 억제제 및 과도한 알코올 섭취로 인한 골다공증이 흔하다는 것이 확인되었습니다 1,2. 납 (Pb)은 식물, 토양 및 수생 환경에서 발견되는 독성 금속입니다3. 인체에 대한 Pb의 악영향이 많은 관심을 끌었지만 뼈에 대한 돌이킬 수없는 영향은 더 조사해야합니다. 납 중독은 발달 중과 성인 골격 모두에서 다양한 병리학 적 변화를 일으켜 정상적인 생활 활동에 영향을 미칩니다. 연구에 따르면 만성 Pb 노출과 뼈 손상4 사이의 연관성이 발견되었으며, 여기에는 뼈 구조 손상5,6, 골밀도 감소, 골다공증 위험 증가7가 포함됩니다.
광물화된 조직은 뼈 강도8에 매우 중요하며, 골 광물화 매트릭스 침착은골 형성의 중요한 지표입니다9. 알리자린 레드는 칼슘 이온에 대한 친화력이 높으며 알리자린 레드 염색은 골 형성을 평가하기위한 표준 절차입니다10. 이 방법에 따르면, 광물 화 된 조직은 빨간색으로 염색되고 다른 모든 조직은 투명하게 유지됩니다. 염색 된 영역은 디지털 이미지 분석(11)에 의해 정량화된다.
제브라피쉬는 약물 발견 및 질병 모델에 널리 사용되는 중요한 모델 유기체입니다. 제브라 피쉬와 인간에 대한 유전 연구는 분자 수준12에서 골격 형태 형성의 기본 메커니즘에서 유사성을 입증했습니다. 더욱이, 고처리량 약물 또는 생체 분자 스크리닝은 쥐 모델보다 제브라피쉬의 큰 클러치에서 더 실현 가능하여, 프로오스테겐 또는 골독성 분자13의 기계론적 연구를 용이하게 한다. 토토10 에서 골격의 차별 염색은 작은 척추 동물과 포유류 태아에서 골격 이형성증을 연구하는 데 자주 사용됩니다. 알리자린 레드 염색은 제브라피쉬 유충에서 화학 물질의 골 발생 독성을 조사하기 위해 수행되었습니다. 여기에서는 제브라피쉬 유충에서 납 아세테이트 유발 뼈 결함을 검출하기 위한 프로토콜을 설명하기 위해 납을 예로 사용했습니다.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl (pH = 7.5)</td> <td>Solarbio, 베이징, 중국</td><td>21</td><td></td></tr> 4 <tr><td>% 파라 포름 알데히드 고정 용액</td><td>BBI, 상하이, 중국</td><td>14</td><td>고정 조직</td></tr><tr><td>10x PBS 버퍼</td><td>BBI, 상하이, 중국</td><td>15</td><td></td></tr><tr><td>35 % H2O2 </td><td>Yonghua, Jiangsu, China</td><td>8</td><td>안료 제거</td></tr><tr><td>50 mL 원심 분리기 튜브</td><td>AKX, 장쑤 성, 중국</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>95 % 무수 에탄올</td><td>에녹스, 장쑤 성, 중국</td><td>2</td><td>염색</td></tr><tr><td>알리자린 레드 (순도 99.5 %)</td> <td>Solarbio, 베이징, 중국</td><td>1</td><td>염색</td></tr><tr><td>생화학 인큐베이터</td><td>Yiheng, 상하이, 중국</td><td>3</td><td>제브라 피쉬 배아 키우</td></tr>기 <tr><td>전자 저울</td><td>Sartorius, 독일</td><td>5</td><td>고형 원료 계량</td></tr><tr><td>글리세린 (순도 99.5 %)</td><td>, BBI, 상하이, 중국</td><td>7</td><td>염색 물고기 저장</td></tr><tr><td>ImageJ (소프트웨어)</td> <td>미국</td><td>9</td><td>디지털 분석</td></tr><tr><td>KOH (순도 99.9 %)</td> <td>시그마, 미국</td><td>10</td> 표백 <td>용액</td></tr><tr><td>아세테이트 납 (순도 99.5 %)</td><td>, 알라딘, 상하이, 중국</td><td>11</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (순도 99.9%)</td><td>알라딘, 상하이, 중국</td><td>12</td><td>세척</td></tr>액 <tr><td>NIS-Elements F (소프트웨어)</td><td>니콘, 일본</td><td>13</td><td>관찰 및 사진 촬영</td></tr><tr><td>파이프</td><td>AKX, 장쑤성, 중국</td><td>18</td><td>배아 및 용액</td></tr><tr><td>플레이트 제거(24-well)</td><td>코닝, 미국</td><td>17</td><td>배아 플레이트 염색용 용기</td></tr><tr><td>(6-well)코</td><td>닝, 미국</td><td>16</td><td>배아 번식을 위한 용기</td></tr><tr><td>흔들리는 테이블</td><td>중국 Beyotime</td><td>19</td><td>용액 혼합</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>일본 니콘</td><td>20</td> 제브라피시 <td>관찰 및 사진 촬영</td></tr> 중국 <tr><td></td><td>쑤저우 대학교 수저우 대학교 제브라피시 실험 센터</td><td>22</td><td>실험 동물</td></tr></tbody></table>

알리자린 레드 염색을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 화학적으로 유발된 뼈 손실 검출

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

납(Pb) 노출로 인한 화학적으로 유발된 뼈 손실은 인간과 동물의 골격계 모두에 일련의 부정적인 영향을 유발할 수 있습니다. 그러나 제브라 피쉬의 구체적인 효과와 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. Alizarin red는 칼슘 이온에 대한 친화력이 높으며 뼈를 시각화하고 골격 미네랄 덩어리를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 연구에서는 알리자린 레드 염색을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 아세트산납(PbAc)으로 인한 뼈 손실을 감지하는 것을 목표로 했습니다. 제브라피쉬 배아는 수정 후 2시간에서 120시간 사이에 일련의 PbAc 농도(0, 5, 10, 20mg/L)로 처리되었습니다. 수정 후 9일에 유충에 대해 전체 마운트 골격 염색을 수행하고, 전체 염색 면적을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화했습니다. 결과는 광물화된 조직이 빨간색으로 염색되었고, PbAc 노출 그룹에서 염색된 영역이 유의하게 감소했으며, 뼈 광물화의 용량 의존적 변화가 있음을 나타냈다. 이 논문은 PbAc 유발 뼈 결함의 골격 변화를 조사하기 위한 염색 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 다른 화학 물질에 의해 유도 된 뼈 손실을 감지하기 위해 제브라 피쉬 유충에서도 사용할 수 있습니다.

Alizarin 적색 염색은 제브라 피쉬 유충의 뼈 광물 화 변화를 측정하는 민감하고 구체적인 방법입니다. 이 연구에서 우리는 PbAc가 사망, 기형, 심박수 감소 및 신체 길이 단축을 포함하여 제브라피쉬 유충에 악영향을 미친다는 것을 관찰했습니다. 또한, 제브라피쉬 유충의 미네랄 골격 영역을 평가하여 PbAc로 인한 뼈 손실을 조사했습니다. 9dpf(그림 1A)에서 머리 골격의 많은 뼈가 광물화되어 파라스페노이드(PS), 수술(OP), 세라토브랜치(CB) 및 노토코드(NC)와 같이 빨간색으로 염색됩니다. 대조적으로, 이석(OT)(비뼈 구조)은 빨간색이 아닌 갈색-검은색으로 보입니다. 각 이미지에서 전체 염색 영역을 정량화하기 위해 디지털 분석을 수행했습니다. 대조군과 비교하여 10 및 20 mg / L PbAc로 처리 된 납 아세테이트 그룹은 염색 된 영역에서 상당한 감소 (p &lt; 0.001)를 보였습니다 (그림 1...

여기에서는 아세트산 납 노출이 제브라 피쉬 유충의 뼈 질량 변화를 유발한다는 것을 보여주기 위해 알리자린 레드 염색을 사용했습니다. 이 염색 방법은 다른 위험한 독성 물질에 의해 유도 된 제브라 피쉬 유충 손실의 뼈 손실 조사에 적용될 수 있습니다.

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

이 방법은 제브라 피쉬의 화학 물질에 의해 유발 된 뼈 독성을 감지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 고정 조직의 Alizarin Red 염색은 여러 표본의 비교를 용이하게 할 수 있는 골격 변화의 영구적인 기록을 생성합니다. 이 기술은 골다공증의 특징 중 하나가 골량의 감소이기 때문에 제브라 피쉬 모델에서 골다공증을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.수정 후 9 일에 각 그룹에서 무작위로 10 개의 제브라 피쉬 유충을 제거하고 2 시간 동안 2 % 파라 폼 알데히드 1 밀리리터와 1X PBS에 물고기를 고정시킵니다. 용액을 따라 내고 pH 7.5 또는 10 밀리몰 염화 마그네슘의 100 밀리몰 트리스 HCL을 사용하여 제브라 피쉬 유충을 씻으십시오. 탈염색을 위해, 용액을 따라 내고 원고에 설명 된대로 일련의 용액에서 유충을 5 분 동안 배양하십시오.최종 배양 후, 용액을 따라 내고 3 % 과산화수소와 0.5 % 수산화 칼륨으로 구성된 용액으로 표백하여 안료를 제거합니다. 안료가 완전히 제거 될 때까지 10 분마다 한 번씩 관찰하십시오. 제브라 피쉬 유충을 25 % 글리세린, 0.1 % 수산화 칼륨으로 거품이 없을 때까지 각각 10 분 동안 여러 번 헹굽니다.0.01 % Alizarin 1 밀리리터에 담가 유충을 얼룩지게하십시오. 용액을 따라 내고 50 % 글리세린 또는 0.1 % 수산화 칼륨 1 밀리리터를 추가하여 배경을 제거합니다. 후속 관찰을 위해 신선한 50 % 글리세린 또는 0.1 % 수산화 칼륨에 생선을 보관하십시오.한 번에 하나의 유충을 유리 슬라이드로 옮기고 유충을 액체 방울의 중앙에 유지합니다. 실체 현미경으로 유충을 관찰하십시오. 카메라를 켭니다.소프트웨어를 열고 기본 설정을 유지합니다. AE를 클릭하고 적절한 노출 시간을 선택하여 최상의 이미지를 얻으십시오. 동일한 설정에서 모든 이미지를 캡처합니다.나중에 분석할 수 있도록 이미지를 dot tiff 형식으로 저장합니다. imageJ 아이콘을 두 번 클릭합니다. 저장된 이미지를 분석하려면 파일을 클릭 한 다음 열기를 클릭하고 이미지를 클릭 한 다음 8 비트를 입력하고 선택하십시오.편집을 클릭하고 반전하십시오. 분석을 클릭 한 다음 보정하십시오. 팝업 인터페이스에서 보정되지 않은 OD를 선택합니다.하단 인터페이스의 왼쪽 하단에서 전역 보정을 확인하고 확인을 클릭합니다. 분석을 클릭하고 배율을 설정한 다음 배율을 제거합니다. 아래 글로벌을 확인하고 확인을 클릭하십시오.분석을 클릭 한 다음 측정을 설정하십시오. 팝업 인터페이스에서 항목 영역을 선택합니다. 아래의 임계값 제한을 확인하여 선택한 범위만 측정하고 확인을 클릭합니다.이미지를 클릭하고 임계 값을 조정 한 다음 팝업 인터페이스 중간에있는 슬라이더를 밉니다. 하나의 이미지에서 테스트할 모든 대상이 선택되도록 적절한 임계값을 선택합니다. 그리고 설정을 클릭합니다.분석을 클릭 한 다음 측정하고 날짜를 저장하십시오. Alizarin Red Staining은 제브라 피쉬 유충의 뼈 광물 화 변화를 측정하기위한 민감하고 구체적인 방법입니다. 수정 후 9 일이 지나면 parasphenoid, opercular, ceratobranchial 및 notochord와 같은 머리 골격의 많은 뼈가 광물 화되어 빨간색으로 염색됩니다.대조적으로, 이석과 같은 뼈가 없는 구조는 갈색으로 검은색으로 보입니다. 전체 염색 면적을 정량화하기 위해 수행된 디지털 분석은, 납 아세테이트 처리군의 리터당 10 및 20 밀리그램에 대해 염색 면적의 현저한 감소를 보였다. 뼈 광물화의 변화는 용량 의존성을 보였다.더 나은 염색 효과와 관찰을 위해서는 제브라 피쉬 유충의 원래 색소를 제거하고 표백 후 거품을 제거하는 것이 중요합니다.

using-alizarin-red-staining-to-detect-chemically-induced-bone-loss

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 Alizarin Red 염료를 사용하여 배양된 1차 조골세포에서 광물화 또는 칼슘 침착 정도를 감지하기 위한 염색 기술을 보여줍니다.

Alizarin Red Staining: 배양된 조골세포에 의한 광물화를 시각화하는 기술

이 비디오에서는 음이온 성 염료 인 Alizarin Red S를 사용하여 조골 세포 분비 칼슘 침전물을 검출하는 방법을 설명합니다. 배양된 조골세포를 먼저 염색한 다음 칼슘 침전물의 비색 정량화 또는 조골세포 광물화 정도를 위해 염료를 회수합니다.

In vitro mineralization assay: Alizarin Red S 염색 및 추출에 의한 뼈 이식 대체체의 골아세포 칼슘 침전물을 정량화하는 비색 방법

신경 및 비 신경 질환의 많은 지브라 피쉬의 모델 성어보다는 배아 / 유생으로 연구되어 있기 때문에, 우리는 성인 zebrafish의 질병 모델에 적용 할 수있는 양적 측면 라인 회생 분석법을 개발 하였다. 분석은 1) neuromast 2) 개별 머리 세포 수준의 해상도를하고있었습니다.

성인 Zebrafish의의 측면 라인 재생을위한 분석

이 연구에서는 제브라피시 유충에 대해 EBD(Evans Blue Dye) 분석을 수행하는 간단한 방법을 설명합니다.  이 기술은 골격근 무결성의 특성화와 근이영양증의 제브라피시 모델을 묘사하기 위한 강력한 도구이며 새로운 치료법 개발을 위한 귀중한 방법입니다.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

작은 실험용 물고기는 인간의 뼈 질환의 기저에 있는 메커니즘에 대한 뼈 연구와 뼈 조절 약물의 스크리닝을 위한 인기 있는 모델이 되었습니다. 이 보고서에서는 골다공증성 병변이 있는 medaka 유충의 뼈 세포에 대한 alendronate의 효과를 평가하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

약물 치료와<em&gt; 생체</em&gt;은 메다카 물고기 골다공증 모델에서 조골 파골 세포 상호 작용의 영상

이 프로토콜의 목표 zebrafish에 치명적인 골격 돌연변이 고기 penetrance 선택적인 breeding에 의해 변경 하는 것입니다. 치명적인 돌연변이 성인 기에 성장 될 수 없는 자신을 사육, 따라서이 프로토콜 추적 하 고 여러 세대에 걸쳐 penetrance 테스트 자손에 의해 선택 하는 방법에 설명 합니다.

Zebrafish 치명적인 골격 돌연변이 Penetrance 자손 테스트 하 여 이동

여기, 우리 3 성인 zebrafish 부상 모델 및 면역 억제 약물 치료와 결합 된 그들의 사용을 설명합니다. 우리는 거기에 뼈 강화 작용을 감지 및 조직 재생의 이미징에 지침을 제공 합니다.

성인 Zebrafish 부상 모델 뼈 조직 재생에 Prednisolone의 효과 연구

이 프로토콜은 in vivo 재생 중 제브라피쉬의 엘라스모이드 비늘을 채취하고 시각화하는 방법을 설명합니다. 또한, 수확 후 최대 7일 동안 이러한 스케일의 생체 외 배양이 제시됩니다.

토토에서의 제브라피시 비늘 재생 및 비늘의 Ex Vivo 배양

이 프로토콜은 간단한 체외 배양 기법을 사용하여 세포 역학을 연구하는 방법을 제공합니다. 제브라피시 연구자와 교육자들은 비늘 내에서 형광 핵 및 세포 사멸 세포를 시각화하여 뼈 항상성 및 기본 세포 생물학과 관련된 것과 같은 세포 과정을 연구할 수 있는 기회를 제공합니다.

제브라피시 비늘의 세포 역학을 연구하기 위한 체외 배양 기법

이 프로토콜은 제브라피시 유충에서 수행된 이광자 레이저 절제 접근법을 설명하며, 이는 뼈 재생과 절제에 대한 면역 반응의 효과를 연구하기 위한 모델 역할을 합니다.

발달 중인 제브라피시 유충에서 조골세포의 Two-photon 레이저 매개 절제

여기에 설명된 프로토콜은 생후 5일 된 제브라피쉬 유충의 두개안면 연골을 염색하고 해부하기 위한 간단하고 따라하기 쉬운 절차를 제시합니다. 다양한 발달 조건에서 이러한 구조의 해부학, 모양 및 크기를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Alcian Blue로 염색한 Zebrafish 두개안면 조직의 해부

학습하세요 알리자린 레드 염색을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 화학적으로 유발된 뼈 손실을 검출하는 방법을. 이 기술은 Danio rerio를 이용한 골다공증 연구 및 다양한 유해 독성 물질에 의한 골 독성 평가에 활용될 수 있습니다.

알리자린 레드 염색을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 화학적으로 유발된 뼈 손실 검출

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