Name: 제브라피쉬 유충의 척수 재생 연구를위한 제어 된 반자동 레이저 유도 부상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 학습하세요 제브라피쉬 유충의 반자동 레이저 유도 부상 기법으로 척수 재생 연구를 수행하는 방법을. UV 레이저와 회전 유리 모세관을 활용하여 주변 조직 손상을 최소화하고 재현성을 높입니다.

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이 연구는 BBSRC (BB/S0001778/1)에 의해 지원되었다. CR은 Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Program의 지원을 받습니다. 우리는 데이비드 그린 알드 (CRH, 에딘버러 대학)와 케이티 리드 (CDBS, 에딘버러 대학)에게 트랜스제닉 물고기의 친절한 선물에 감사드립니다 ( 보충 파일 참조). 우리는 Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh)에게 3i 회전 디스크 공초점에 대한 친절한 접근에 감사드립니다.

모든 동물 연구는 영국 내무부의 승인과 규정에 따라 프로젝트 라이센스 PP8160052에 따라 수행되었습니다. 이 프로젝트는 University of Edinburgh Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 실험 분석을 위해, 어느 성별의 5 일까지의 제브라 피쉬 유충을 다음과 같은 사용 가능한 트랜스제닉 라인으로 사용했습니다 : Tg (Xla.Tubb : DsRed; mpeg1 : GFP), Tg (Xla.Tubb : DsRed), Tg (betaactin : utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb : GCaMP6s) 및 Tg (mnx1 : gfp) (트랜스 제브라 피쉬 라인의 생성에 관한 보충 파일 1 참조). 자동화된 제브라피쉬 유충 처리 플랫폼을 이용한 프로토콜의 개략도가 도 1에 도시되어 있다. 이 작업에 사용 된 모든 사용자 정의 소프트웨어, 스크립트 및 자세한 실험 프로토콜은 https://github.com/jasonjearly/micropointpy/ 에서 사용할 수 있습니다.
1. 시료 준비
<ol><li>수정 후 5 시간에, 올바른 발달 단계를 위해 배아를 정렬하십시오21. 죽은 알과 저조한 발달과 과잉 발달 된 배아를 버리십시오.</li>
	<li>수정 후 3 일 (dpf)에, 90 mm 페트리 접시에 물고기 시설 물 50 mL에 0.4 % 아미노 벤조산 에틸 메틸 에스테르 2 mL를 첨가하여 유충을 마취시킵니다. 페닐티오우레아(PTU)로 기른 동물( 물자 표 참조)을 사용하여 문제가 되는 경우 피부 색소침착을 방지하며, 이는 이 프로토콜에 설명된 3dpf 유충의 척수 손상의 경우에는 해당되지 않습니다. 참고 :이 비교적 높은 마취 농도는 레이저 충격 후 유충의 움직임을 예방하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>형광 리포터 발현을 위해 배아를 스크리닝한다 (보충 파일 1). 참고 : 척수 (또는 관심있는 다른 구조)에 대한 형광 리포터는 종종 부상의 효율성을 평가하기 위해 필요합니다. tg (Xla.Tubb : DsRed)의 사용은 척수를 식별하는 데 도움이됩니다.</li>
	<li>선택한 유충을 VAST 시스템 ( 재료 표 참조)에 사용하기 위해 96 웰 플레이트로 옮기고 우물 당 300 μL의 어류 시설 물을 사용하십시오. 90 mm 페트리 접시에서 마취제를 함유 한 배지를 직접 사용하십시오. 우물 당 하나의 유충 만 있어야합니다. 병변 유충을 수집하기 위해 여분의 빈 96 웰 플레이트를 준비하십시오. 참고 : 다른 레이저 병변 시스템을 사용하는 경우 유충을 적절한 관찰 챔버의 1 % 저융점 (LMP) 아가로스 겔에 장착하십시오.</li>
</ol>2. 현미경 준비
<ol><li>절제용 레이저를 포함한 모든 시스템 구성 요소(VAST, 현미경, 레이저, PC)를 켭니다.</li>
	<li>하드웨어가 완전히 초기화되면 현미경 소프트웨어, ImageJ / Fiji, 파이썬 통합 개발 환경 (IDE) 및 자동화 된 제브라 피쉬 이미징 (VAST 시스템) 소프트웨어를 시작하십시오 ( 재료 표 참조).</li>
	<li>아래 단계에 따라 VAST 소프트웨어를 설정합니다.<ol>
<li>VAST 소프트웨어가 시작되면 첫 번째 창에서 플레이트 를 선택하고 완료 단추를 클릭합니다(그림 2A). 모세관이 비어 있고 깨끗한지 묻는 또 다른 작은 창이 나타납니다. 내부에 기포가 있는지 모세관 이미지를보고 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 예를 클릭하십시오. 거품이 있으면 아니요 를 클릭하고 2.3.2-2.3.3단계를 수행합니다(그림 2B).</li>
		<li>대형 파티클(LP) 샘플러 창에서 프라임( Prime )을 클릭하여 기포를 제거합니다(그림 2C).</li>
		<li>기본 소프트웨어 창 (모세관 이미지 포함)으로 이동하여 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오. 팝업 메뉴에서 빈 모세관 이미지 녹화 를 선택합니다(그림 2B).</li>
		<li>LP 샘플러 창에서 파일 메뉴로 이동하여 스크립트 열기 옵션을 선택합니다. 수행할 실험에 해당하는 스크립트가 포함된 파일을 선택합니다.</li>
		<li>기본 VAST 소프트웨어 창에서 파일로 이동하여 실험 열기를 선택합니다. 계획된 실험에 해당하는 실험 파일을 선택합니다. 주: 상자 자동 언로드 및 폐기물에 대한 대량 출력이 선택되어 있지 않은지 확인하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미징을 위해 현미경 소프트웨어를 설정합니다.<ol>
<li>현미경 이미징 소프트웨어( 자료 표 참조)를 실행하여 하드웨어를 초기화합니다. 시스템에 따라 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.</li>
		<li>획득 설정으로 이동하여 유충에서 발현 된 형광단을 이미징하기위한 현미경을 설정하십시오. 10x NA0.5 침지 목표를 사용하여 초점 부피가 척수 또는 표적 조직의 전체 깊이를 병변시키기 위해 광축을 따라 충분히 길쭉하게 되도록 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>레이저 병변에 대한 ImageJ / 피지를 설정하십시오.<ol>
<li>파일 메뉴로 이동하여 새로 만들기/스크립트를 선택하여 스크립트 창을 엽니다.</li>
		<li>새 창에서 파일 메뉴로 이동하여 열기를 선택하여 레이저 병변 스크립트(Manual_MP_Operation.ijm)를 로드합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>파이썬 IDE를 설정합니다.<ol>
<li>파이썬 IDE를 시작하십시오.</li>
		<li>파일 메뉴로 이동하여 파일 열기를 선택하여 레이저를 관리하는 스크립트를 로드합니다(Watch_for_ROIs_py3.py).</li>
		<li>실행 메뉴로 이동하여 디버깅 없이 실행 을 선택하여 스크립트를 실행합니다. 레이저 감쇠기가 초기화되는 동안 TERMINAL 패널의 메시지 시퀀스가 일부 노이즈와 함께 나타나는지 확인합니다(그림 2D).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. VAST 시스템에서 레이저 병변 수행
<ol><li>VAST 소프트웨어의 주 창에 있는 화살표 버튼을 클릭하여 스테이지를 이동하여 현미경 목표물에 대한 모세관을 중앙에 맞춥니다(그림 2B).</li>
	<li>아이피스를 통해 보고 현미경의 투과된 빛을 사용하여 모세관의 상단에 초점을 맞춥니다. 주의: 모세관은 매우 약하며 목표에 닿으면 부서질 수 있습니다. 초점을 맞추고 초점을 맞출 때 현미경 손잡이를 천천히 움직입니다.</li>
	<li>96웰 플레이트를 VAST 시스템의 LP 샘플러의 플레이트 홀더에 놓습니다. 유충이 들어있는 접시를 왼쪽 홀더에 놓고 수집을위한 접시를 오른쪽에 놓습니다. 플레이트의 방향이 올바른지 확인하십시오: A1 웰은 홀더의 왼쪽 앞면 모서리에 있어야 합니다.</li>
	<li>VAST 소프트웨어의 LP 샘플러 창에서 플레이트 템플릿 버튼을 클릭하고 애벌레가 들어있는 모든 우물을 선택하십시오. 확인 단추를 클릭하여 창의 유효성을 검사하고 닫습니다(그림 2C).</li>
	<li>LP 샘플러 창에서 플레이트 실행 버튼을 클릭하여 애벌레 로딩을 시작하십시오. 참고 : 잠시 후, 유충은 위치 (실험 정의 파일에 미리 정의되어 있음)의 모세관에서 볼 수족을 손상시킬 수 있어야합니다. VAST 트레이 조명은 현미경 목표를 향한 측면 측면으로 유충을 설정하기 위해 몇 번의 회전 후에 꺼집니다.</li>
	<li>현미경 소프트웨어로 이동하여 라이브 버튼을 클릭하여 애벌레를 이미지화하십시오.</li>
	<li>척수 중앙 운하가 보일 때까지 현미경 초점 손잡이를 돌립니다. 참고: 투과된 빛을 사용하여 먼저 초점을 맞춘 다음 형광으로 미세화하는 것이 더 쉬울 수 있습니다.</li>
	<li>형광에서 스냅 샷을 찍고 이미지를 전용 폴더에 저장하십시오.</li>
	<li>ImageJ에서 이미지를 열고 필요한 경우 대비를 조정합니다(ImageJ의 이미지/조정/밝기/대비... 메뉴 사용).</li>
	<li>관심 영역(ROI) 선 도구를 클릭하고 척수 중앙에 짧은 선(20μm)을 그립니다(그림 3A).</li>
	<li>현미경을 100% 반사 거울 위치로 전환합니다.</li>
	<li>ImageJ 스크립트를로드하고 실행 버튼을 클릭하십시오. 다음 매개 변수를 사용하십시오 : 반복 - 2; 샘플 - 1; 폭 - 40 미크론; 감쇠 - 89(전체 레이저 출력)(그림 3C).</li>
	<li>레이저 샷 시퀀스가 완료되면 이미징 소프트웨어에서 형광 이미징으로 전환하고 필요한 경우 초점을 조정하십시오. 참고: 초점의 변화는 레이저 노출 중 꼬리 변위로 인해 종종 관찰됩니다.</li>
	<li>새 스냅숏을 만들어 저장합니다.</li>
	<li>ImageJ에서 이 새 이미지를 열고 척수 자체(~80μm)보다 커야 하는 새 선을 그립니다. 노토코드 위쪽에 있는 척수의 복부 쪽 아래에서 시작하여 등쪽을 향해 가면서 척수와 피부 사이의 공간에서 끝납니다(그림 3B).</li>
	<li>현미경을 100% 반사 거울 위치로 전환합니다.</li>
	<li>ImageJ 스크립트 창으로 이동하여 실행 버튼을 클릭하십시오. 다음 매개 변수를 사용하십시오 : 반복 - 2; 샘플 - 1; 폭 - 40 미크론; 감쇠 - 89 (전체 레이저 출력).</li>
	<li>(더 긴) 레이저 샷 시퀀스가 완료된 후, 형광을 이미징하고 초점을 맞추어 트랜섹션 품질을 검증합니다. 병변 부위에 세포나 축삭돌기가 손상되지 않은 상태로 남아 있지 않은지 확인하십시오.이 부위는 어둡거나 희미하고 균질한 형광 영역으로 나타나야합니다 (그림 3D, 하단 패널).</li>
	<li>병변 유충을 빈 96 웰 플레이트 (원래 우물과 동일한 우물 좌표가 있음)에 모아 메인 VAST 소프트웨어 창으로 이동하여 수집 버튼을 클릭하십시오.</li>
	<li>창의 왼쪽 하단에 있는 트레이 표시등 확인란을 클릭하여 VAST 시스템 표시등을 다시 켭니다.</li>
	<li>부상을 입을 각각의 새로운 유충에 대해 3.3-3.17 단계를 반복하십시오.</li>
</ol>4. 병변 후 처리 및 추가 실험
<ol><li>가능한 한 빨리 96 웰 플레이트에서 유충을 꺼내어 신선한 생선 시설 물이 담긴 깨끗한 페트리 접시로 옮겨 유충이 병변 후 회복 할 수 있도록하십시오. 페트리 접시를 28°C의 인큐베이터에 넣는다. 참고: 손상은 종종 병변 후 첫 시간 동안 계속 전파됩니다. 따라서 병변의 실제 정도는 약 1 시간의 지연 후 형광 이미징에 의해 평가되어야한다.</li>
</ol>5. 문제 해결
<ol><li>VAST 시스템의 튜브와 모세관에 기포가 있으면 LP 샘플러 창에서 프라임 버튼을 클릭하여 제거하십시오.</li>
	<li>실패한 병변 (예상되는 잔류 및 균질 배경과는 별개로 병변 부위의 나머지 형광으로부터 평가 된 바와 같이)을 고려하십시오.이 병변은 아래에 언급 된 몇 가지 이유로 인한 것일 수 있습니다.<ol>
<li>낮은 레이저 출력 : 이런 일이 발생하면 더 높은 값으로 시도하십시오. 참고: VAST 시스템에는 염료 레이저가 장착되어 있습니다. 이것은 레이저 광 생성에 사용되는 염료 용액의 농도가 시간이 지남에 따라 변하여 레이저 전력의 감소로 이어질 수 있음을 의미합니다. 새로운 솔루션으로 대체하면 일반적으로 문제가 해결됩니다22.</li>
		<li>불량한 교정: 이 경우 5.2.2.1-5.2.2.4 단계에 따라 레이저 시스템의 교정 및 전력을 확인합니다. 올바르게 보정되지 않으면 레이저가 원하는 위치로 향하지 않아 인접한 조직에서 병변이 실패하거나 바람직하지 않은 손상이 발생합니다.<ol>
<li>거울 슬라이드를 모세관 챔버 위에 놓습니다. 코팅 된면에 집중하십시오 (목표에 직면해야합니다). 슬라이드에서 이전 기본값을 사용하여 초점을 더 쉽게 맞출 수 있습니다.</li>
			<li>교정 스크립트를 사용하여 레이저 절제 패턴을 적용합니다.</li>
			<li>패턴의 품질을 평가합니다. 반점이나 선이 날카롭고 흐릿하지 않아야 합니다.</li>
			<li>전력이 증가하는 램프를 사용하여 레이저 전력이 이전 세션과 비교하여 변경되었는지 여부를 평가합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>병변 중 애벌레 운동 : 유충은 마취에 다르게 반응합니다. 따라서, 레이저 병변은 과정 동안 꼬리의 움직임을 유발할 수 있으며, 따라서 성공적인 횡단을 예방할 수 있다. 이런 일이 발생하면 레이저 병변 단계를 추가로 반복하여 주변 조직의 손상을 피하면서 완료하십시오.</li>
		<li>나쁜 초점 : 이것이 발생하면 최상의 결과를 얻기 위해 중앙 운하의 중앙에 집중하십시오.</li>
		<li>ROI 도면, 위치 및 크기: ROI의 위치와 크기는 성공적인 횡단을 위해 매우 중요합니다. ROI는 척수보다 커야하며 척수 중앙에 집중되어야합니다. 이 문제를 해결하려면 척수의 복부 쪽에서 ROI를 그리기 시작하고 등쪽쪽으로 올라가 성공적인 횡단을 얻으십시오. 이것은 절제 절차 중 레이저 샷의 시퀀스에 의해 유발 된 꼬리 움직임 때문일 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+long-term%2C+multi-channel+and+non-invasive+electrophysiology+platform+for+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li>
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저자는 공개 할 것이 없습니다.

제브라 피쉬에서 재생하는 동안 재생되는 과정에 대한 더 깊은 이해가 시급히 필요합니다. 이 동물 모델은 생물 의학 연구, 특히 척수 손상에 많은 이점을 제공합니다1. 대부분의 연구는 잘 훈련 된 작업자를 필요로하고 다중 조직 손상을 유도하는 수동 병변을 포함합니다. 레이저 병변 프로토콜이 여기에 제시되어 병변 특성을 제어하고 주변 조직의 손상을 줄일 수 있습니다. 또한이 기술은 상대적으로 훈련받지 않은 실험자가 성공적으로 사용할 수있을만큼 쉽습니다.
프로토콜의 중요한 단계는 레이저의 교정과 ROI의 정의입니다. 실제로 교정은 매우 안정적이며 (심지어 몇 달 동안도) ROI의 올바른 크기와 위치가 결정되면이 기술의 사용은 간단합니다. 프로토콜이 특정 장비에서 병변을 수행하는 방법을 설명했지만, 레이저 병변의 이점의 대부분은 스핀 디스크 현미경과 같은 다른 시스템에 사용할 수 있습니다.
이 ...

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Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

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Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

포유류와는 달리, 제브라피쉬(Danio rerio)는 부상 후 중추신경계(CNS)를 회복시킬 수 있습니다1. 척수 재생을위한 모델로 제브라 피쉬 유충을 사용하는 것은 비교적 최근입니다. 수리의 기초가되는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 것이 가치가 있음이 입증되었습니다2. 이것은 조작의 용이성, 짧은 실험주기 (매주 새로운 애벌레), 조직의 광학 투명성 및 유충의 작은 크기 때문에 생체 내 형광 현미경 검사에 이상적입니다.
척수 재생의 경우, 애벌레 사용의 두 가지 추가 이점은 회복 속도, 성인의 경우 몇 주에 비해 며칠, 수동 기술을 사용하여 부상을 유발할 수 있다는 것입니다. 이것은 최근의 조사6,7을 포함하여 많은 연구3,4,5에서 성공적으로 사용되었습니다. 전반적으로 이로 인해 의미 있는 데이터 생산이 증가하고 실험 프로토콜의 적응성이 높으며 실험 비용이 절감됩니다. 수정 후 5 일 미만의 유충을 사용하면 동물 연구에서 3R 원칙에 따라 동물의 사용이 줄어 듭니다.8.
제브라피쉬 유충의 척수 손상 후, 염증 반응, 세포 증식, 신경 발생, 생존 또는 새로 생성 된 세포의 이동, 기능성 축삭의 개혁, 신경 과정 회로 및 척추 조직의 글로벌 리모델링을 포함한 많은 생물학적 과정이 발생합니다6,7,9,10 . 성공적으로 조율되기 위해, 이러한 과정은 다양한 세포 유형, 세포외 매트릭스 성분 및 생화학적 신호들 사이의 미세하게 조절된 상호작용을 수반한다11,12. 척수와 같은 복잡한 조직의 이러한 중요한 재구성에 대한 세부 사항을 풀기 위해서는 정밀하고 통제 된 실험 접근법의 사용과 개발이 필요합니다.
제브라피쉬에서 척수 재생을 연구하는 데 사용되는 주요 실험 패러다임은 절제술, 찌르기 또는 냉동 손상에 의한 조직 손상을 유도하기 위해 외과 적 수단을 사용하는 것입니다3,13. 이러한 접근법은 미세 수술 기술에 대한 특정 교육이 필요하다는 단점이 있으며, 이는 새로운 운영자에게 시간이 많이 걸리고 단기 프로젝트에서 사용하지 못할 수 있습니다. 또한, 그들은 일반적으로 재생에 영향을 줄 수있는 주변 조직의 손상을 유도합니다.
또 다른 접근법은 화학적으로14 또는 유전자 조작에 의해 세포 손상을 유도하는 것이다15. 후자는 고도로 표적화 된 피해를 허용합니다. 그러나 이러한 기술은 실험을 수행하기 전에 새로운 트랜스제닉 물고기를 생성하기 위해 오랜 준비 작업이 필요하며 고유 한 세포 유형이 타겟팅 될 때마다 갱신됩니다.
따라서, 재생에 있어서의 다양한 연구에 적합한 표적화되지만 다재다능한 병변을 허용하는 방법에 대한 필요성이 존재한다. 해결책은 레이저를 사용하여 관심있는 조직에서 국소 손상을 유도하는 것입니다.16,17,18,19,20. 실제로, 레이저-유도된 조직 손상의 사용은 많은 이점을 갖는 척수 병변을 생성하기 위한 강력한 접근법을 제시한다. 이러한 레이저 조작 모듈이 장착 된 현미경을 사용하면 세포 절제가 발생할 맞춤형 모양의 영역을 지정할 수 있으며 시간적 제어의 추가 이점이 있습니다. 따라서 병변의 크기와 위치는 모든 질문을 해결하기 위해 적응 될 수 있습니다.
대부분의 레이저 병변 시스템의 누락 된 특징은 일련의 유충에 대해 재현성이 높은 방식으로 부상을 유발할 수있는 가능성입니다. 여기서 원래의 프로토콜은 UV 레이저를 사용하여 자동화 된 유충 취급을 위해 설계된 미세 유체 플랫폼을 기반으로 제브라 피쉬 유충에서 반자동화된 정밀하고 통제 된 병변을 유도하기 위해 설명됩니다21. 또한, 여기에 제시된 시스템에서 유충은 유리 모세관에 삽입되어 로스트로 코달 축 주위의 동물의 자유로운 회전을 허용합니다. 사용자는 유충의 어느 쪽이 레이저에 제시할지 선택할 수 있으며 형광 이미징이 레이저 빔을 정확하게 타겟팅하고 병변 후 손상을 평가할 수 있습니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 UV 레이저 (이하 VAST 시스템으로 지정됨)가 장착 된 회전 디스크와 결합 된 반자동 제브라 피쉬 유충 이미징 시스템과 함께 사용됩니다. 그러나, 프로토콜의 주요 요점 및 기술의 대부분의 청구항은 이광자 레이저 스캐닝 현미경, UV 레이저(FRAP 모듈)와 함께 제공되는 방사-디스크 현미경, 또는 사진 조작을 위한 레이저 모듈을 갖는 비디오 현미경을 포함하는 세포 절제가 가능한 레이저를 장착한 임의의 시스템에 유효하다. VAST 시스템과 기존 샘플 처리의 주요 차이점 중 하나는 후자의 경우 96 웰 플레이트에 적재하는 대신 유리 커버 슬립 / 유리 바닥 페트리 접시에 저융점 아가로스에 유충을 장착해야한다는 것입니다.
이 방법이 제공하는 이점은 재생 과정에서 세포 및 분자 메커니즘에 대한 혁신적인 연구를위한 기회를 열어줍니다. 또한 높은 데이터 품질로 인해 여러 분야의 맥락에서 정량적 조사가 가능합니다.

<table><tbody><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope software Zen Blue 2.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/FIJI</td><td>Open-Source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visual Studio Code</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope and accessories</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApoTome microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-Plan-Apochromat 10X(0.5NA) 디핑 렌즈</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>듀얼 AxioCam 506m CCD 카메라</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 LSM880</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스피닝 디스크 모듈 CSU-X1</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>정립 현미경Axio Examiner D1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV 레이저</td><td>Micropoint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VAST BioImager</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>90 mm 페트리 접시</td><td>Thermo-Fisher</td><td>101R20</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3841</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-It EdU 이미징 키트</td><td>, Invitrogen</td><td>C10637</td><td></td></tr>, <tr><td>아미노벤조산-에틸 메틸 에스테르(MS222),</td> <td>시그마-알드리치</td>, <td>A5040</td><td></td></tr>, <tr><td>페닐티오우레아(PTU),</td> <td>시그마-알드리치</td>, <td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey, anti-chicken, Alexa Fluor 488</td>, <td>Jackson</td>, <td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 Cy3</td><td>Jackson</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 GFP</td><td>Abcam</td><td>AB13970</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 튜불린 아세틸화 항체</td><td>Sigma</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>Transgenic zebrafish lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)</td><td></td><td>N/A</td><td>David Greenhald에 의해 설립, University of Edinburgh</td></tr><tr><td>Tg(mnx1:gfp)</td><td></td><td>N/A</td><td>[Flanagan-Steet et al. 2005]</td></tr><tr><td>Tg(Xla.Tubb:DsRed)</td><td></td><td>N/A</td><td>[Peri and Nusslein-Volhard 2008]</td></tr><tr><td>Tg(Xla.Tubb:DsRed; mpeg1:GFP)</td><td></td><td>N/A</td><td>에든버러 대학교 케이티 리드(Katy Reid)</td></tr> 설립 <tr><td>TG(Xla.Tubb:GCaMP6s)</td><td></td><td>N/A</td><td>에든버러 대학교 데이비드 그린할드(David Greenhald)</td></tr></tbody></table> 설립

제브라피쉬 유충의 척수 재생 연구를위한 제어 된 반자동 레이저 유도 부상

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Zebrafish 유충은 수정 후 며칠 만에 높은 재생 능력을 가진 완전히 기능적인 중추 신경계 (CNS)를 가지고 있습니다. 이것은이 동물 모델을 척수 손상 및 재생을 연구하는 데 매우 유용합니다. 이러한 병변을 유도하기 위한 표준 프로토콜은 트렁크의 등쪽 부분을 수동으로 횡단하는 것이다. 그러나이 기술은 광범위한 훈련이 필요하며 추가 조직을 손상시킵니다. 레이저로 인한 병변이 이러한 한계를 우회하기 위해 프로토콜이 개발되어 훈련받지 않은 작업자에게도 많은 동물과 다른 세션 사이에 척수 횡단의 높은 재현성과 완전성을 허용했습니다. 또한, 조직 손상은 주로 척수 자체에 국한되어, 다른 조직, 예를 들어, 피부, 근육 및 CNS를 손상시키는 것으로부터 혼란스러운 효과를 감소시킨다. 또한, 척수의 헤미 병변이 가능합니다. 레이저 손상 후 조직 무결성의 향상된 보존은 전기 생리학과 같은 추가 분석에 필요한 추가 해부를 용이하게합니다. 따라서이 방법은 수동으로 달성 할 수없는 부상 정도를 정확하게 제어 할 수 있습니다. 이것은 미래에이 강력한 모델에서 새로운 실험 패러다임을 허용합니다.

척수 횡단 절제술의 유효성 검사 프로토콜이 완전한 척수 횡단을 허용하는지 여부를 평가하기 위해 구조적 및 기능적 조사가 수행되었다.
먼저, 병변 부위에서의 형광 손실이 레이저 조명으로부터 형광 광표백이 아닌 신경 조직 손상에 기인하였음을 확인하기 위해, 아세틸화된 튜불린에 대한 항체를 이용한 면역염색( 표 1 자료 및 보충 파일 1 참조)을 수행하였다. 병변의 인과측과 로스트랄 측면 사이의 축삭기의 완전한 파괴가 관찰되어 척수의 완전한 횡단을 확인했다(도 4B). 성공적인 척수 횡단 절제술은 병변 부위를 가로 질러 남아있는 신경 돌출부를 남겨 두어서는 안됩니다 (실패한 병변의 예는 그림 4C 참조). 이 기술을 사용하여 척수 레이저 병변의 성공률은 75 % (16 마리의 동물에서...

본 프로토콜은 유충 취급을 위한 자동화된 미세유체 플랫폼과 결합된 레이저 병변 시스템을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 조직 특이적이고 재현성이 높은 부상을 유도하는 방법을 기술한다.

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

우리가 여기서 제안하는 기술은 경험이 부족한 작업자의 경우에도 인접한 조직의 손상을 줄이고 재현성을 향상시킴으로써 수동 병변 프로토콜의 한계를 극복 할 수있게합니다. 이 기술을 사용하면 표적 UV 레이저와 결합 된 회전 유리 모세관 덕분에 주변 조직을 손상시키지 않고 병변을 유도 할 위치를 정확하게 선택할 수 있습니다. VAST 장비 작동에는 많은 단계가 관련되어 있으므로 모든 단계가 올바르게 수행되도록하기 위해 모든 단계를 수행하는 것이 좋습니다.마취제를 함유 한 배지를 사용하여 유충을 마취시킨 다음 웰 당 300 마이크로 리터의 배지를 함유 한 96 웰 플레이트로 옮깁니다. 절제용 레이저를 포함한 모든 시스템 구성 요소를 켭니다. 그런 다음 자동화 된 제브라 피쉬 이미징 또는 VAST 소프트웨어를 실행하고 첫 번째 창에서 플레이트를 선택한 다음 완료 버튼을 클릭하십시오.모세관이 비어 있고 깨끗한지 묻는 작은 창이 나타납니다. 모세관 이미지에 내부에 기포가 있는지 확인하십시오. 내부에 기포가 없으면 팝업 창에서 예를 클릭하십시오.다음으로 LP 샘플러 창에서 파일 메뉴로 이동하여 스크립트 열기 옵션을 선택하십시오. 수행할 실험에 해당하는 스크립트가 포함된 파일을 선택합니다. 그런 다음 기본 VAST 소프트웨어 창에서 파일로 이동하여 실험 열기를 선택합니다.계획된 실험에 해당하는 실험 파일을 선택합니다. ImageJ / Fiji 소프트웨어를 실행하고 파일 메뉴로 이동 한 다음 새 스크립트를 선택하여 스크립트 창을 엽니 다. 그런 다음 파일 메뉴로 이동하여 열기를 선택하여 레이저 병변 스크립트를로드하십시오.그런 다음 Python IDE를 시작하려면 파일 메뉴로 이동하여 파일 열기를 선택하여 레이저를 관리하는 스크립트를로드하십시오. 그런 다음 실행 메뉴를 클릭하고 디버깅하지 않고 실행을 선택하여 스크립트를 실행합니다. 레이저 감쇠기가 초기화되는 동안 터미널 패널의 메시지 시퀀스가 일부 노이즈와 함께 나타나는지 확인하십시오.VAST 소프트웨어의 메인 창에서 화살표 버튼을 클릭하여 스테이지를 이동하고 현미경 목표를 기준으로 모세관을 중앙에 맞춥니다. 접안 렌즈를 살펴보고 현미경의 투과 된 빛을 사용하여 모세관 상단에 집중하십시오. 유충이 들어있는 96-웰 플레이트를 LP 샘플러의 왼쪽 플레이트 홀더에 놓습니다.그런 다음 수집을 위해 다른 플레이트를 샘플러의 오른쪽 플레이트 홀더에 놓습니다. 플레이트의 A1 웰이 홀더의 왼쪽 앞쪽 모서리에 있는지 확인하십시오. VAST 소프트웨어의 LP 샘플러 창에서 플레이트 템플릿 버튼을 클릭하고 애벌레가 들어있는 모든 웰을 선택하십시오.확인 버튼을 클릭하여 창의 유효성을 검사하고 닫습니다. 그런 다음 LP 샘플러 창에서 플레이트 실행 버튼을 클릭하여 애벌레 로딩을 시작하십시오. 그런 다음 현미경 소프트웨어로 이동하여 라이브 버튼을 클릭하여 애벌레를 이미지화하십시오.척수 중앙 운하가 보일 때까지 현미경 초점 손잡이를 켭니다. 형광에서 스냅 샷을 찍고 이미지를 폴더에 저장하십시오. ImageJ에서 이미지를 열고 필요한 경우 대비를 조정합니다.관심 영역 선 도구를 클릭하고 척수 중앙에 짧은 선을 그립니다. 현미경을 100% 반사 거울 위치로 전환합니다. ImageJ 스크립트를 로드하고 반복을 2로, 샘플을 1로, 너비를 40미크론으로, 감쇠를 89로 설정합니다.모든 매개 변수를 설정 한 후 OK 버튼을 클릭하십시오. 레이저 촬영 시퀀스가 완료되면 이미징 소프트웨어에서 형광 이미징으로 전환하고 초점을 조정합니다. 새 스냅숏을 만들어 저장합니다.ImageJ에서이 새 이미지를 열고 척수 자체보다 큰 새 선을 그립니다. 현미경을 100% 반사 거울 위치로 전환합니다. ImageJ 스크립트 창으로 이동하여 반복을 2로, 샘플을 1로, 너비를 40미크론으로, 감쇠를 89로 설정합니다.모든 매개 변수를 설정 한 후 OK 버튼을 클릭하십시오. 레이저 샷 시퀀스가 끝나면 형광을 이미징하고 초점을 맞추어 트랜섹션 품질을 검증하십시오. 병변 부위에 세포나 축삭이 손상되지 않았는지 확인하십시오.주요 VAST 소프트웨어 창으로 이동하여 수집 버튼을 클릭하여 병변 유충을 빈 96 웰 플레이트에 수집하십시오. 그런 다음 확인란 트레이 표시등을 클릭하여 VAST 시스템 표시등을 다시 켭니다. 가능한 한 빨리 96 웰 플레이트에서 유충을 꺼내어 유충이 병변 후 회복 할 수 있도록 신선한 생선 물이 담긴 깨끗한 페트리 접시로 옮깁니다.페트리 접시를 섭씨 28도의 인큐베이터에 넣으십시오. 아세틸화 튜불린 면역 염색 및 칼슘 이미징은 레이저 병변이 척추 조직의 연속성을 완전히 방해한다는 것을 나타냅니다. 이 이미지에는 손상되지 않은 척수가 표시됩니다.병변의 caudal 및 rostral 측면 사이의 축삭의 완전한 붕괴는 척수의 완전한 횡단을 확인합니다. 불완전한 횡단의 예가 여기에 나와 있습니다. NBTG cAMP 6-S 유충의 횡단 척수가이 이미지에 표시됩니다.사각형은 병변의 rostral 및 caudal 측에서 형광 강도를 정량화하는 데 사용되는 ROI를 보여줍니다. 그래픽 이미지는 로스트랄 및 인과적 분석 ROI에서 시간에 따른 형광 강도 변화를 나타냅니다. NBT:dsRed 유충의 최대 강도 프로젝션 형광 이미지, 레이저 병변의 세 시간, 24시간 및 48시간 후의 레이저 병변이 여기에 도시되어 있다.부상 후 24 시간 후, 상처가 닫히기 시작하여 48 시간 후에 척수의 초기 구조가 부분적으로 회복되었습니다. 부분적인 기능적 재연결은 칼슘 이미징을 사용하여 손상 후 48시간 후에 확인되었다. 인과 부위의 스파이크 진폭과 로스트랄 영역 사이의 비율은 부상 후 3, 24 및 48 시간 사이에 증가한 것으로 나타났습니다.대식세포 모집은 NBT:dsRed mpeg1 GFP 유충 레이저 병변을 사용하여 레이저 병변 후에 관찰되었다. 수동 병변과 레이저 병변 사이의 표지된 세포의 수에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 병변이없는 물고기는 두 병변 조건에서 병변 된 물고기보다 이중 표지 된 세포가 적습니다.레이저 병변은 수동 병변보다 근육과 피부 손상을 덜 유도합니다. 병변이 완전한지 여부를 확인하는 것이 중요합니다. 손상되지 않은 세포나 구조는 병변 부위에 보이지 않아야하며 희미한 배경 만 볼 수 있어야합니다.척수 재생을 연구하기 위해, 우리는 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징을 포함한 많은 방법을 사용합니다. 중요하게도, 우리는 또한 조직이 수동으로 병변 한 동물과는 달리 해부를 견딜 수 있기 때문에 전기 생리학을 할 수 있습니다. 이 새로운 기술을 통해 우리는 재현 가능하고 통제 된 병변을 허용함으로써 손상 후 척수의 구조적 및 기능적 조직 조직을 정량적으로 연구 할 수 있습니다.

controlled-semi-automated-laser-induced-injuries-for-studying-spinal

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

여기 우리는 장기적인 영상, 두 광자 이미징 및 조직 손상을 기술하고, 시간 경과 공촛점 이미징에 대한 zebrafish 배아를 장착하는 방법을 설명합니다.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

여기에 제시된 방법은 고 에너지 레이저 펄스와 시간을 통해 이러한 부상과 회복의 후속 분석 라이브 zebrafish 배아의 정확한 부상을 포함한다. 우리는 또한 유전자 하나의 표시 또는 골격근 세포의 그룹이 동안 레이저 광 유도 손상 후 추적 할 수있는 방법을 보여줍니다.

Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상

이 비디오는 레이저 손상을 사용하여 성인 제브라피시의 망막 변성을 유도하는 절차를 보여줍니다. 레이저는 망막의 광수용체 세포를 표적으로 삼아 세포 사멸과 퇴행성 과정을 유발합니다. 이 손상은 뮐러 신경교세포(MG) 세포를 활성화하여 망막 재생을 돕는 줄기세포 전구세포로 역분화시킵니다.

Targeting Retinal Degeneration and Regeneration in Zebrafish Using a Focal Laser Injury(초점 레이저 손상을 사용한 제브라피시의 망막 퇴행 및 재생 모델링)

출처: Volpe, B. A.,  et al. 제브라피시 신경마스트 세포에서 컨포칼 현미경 기반 레이저 절제 및 재생 분석. J. Vis. 특급{{TAG_ 31}} (2020) 이 비디오는 컨포칼 현미경을 사용하여 제브라피쉬의 신경마스트 간 세포 회수를 모니터링하고 타임 랩스 형광 이미징을 통해 세포 사멸 및 복구를 추적하는 방법을 보여줍니다.

컨포칼 현미경을 사용한 제브라피시의 레이저 절제 신경마스트 세포의 회복 모니터링

말초 신경계 (PNS)가 부상 후 중요한 수리 할 수​​ 있지만, 거의가이 현상을 제어하는​​ 세포 및 분자 메커니즘에 대해 잘 알려져 있습니다. 라이브 형질 전환 제브라 피쉬와 재현 신경 절개 분석하여, 우리는 신경 변성과 재생 중에 동적 아교 세포의 행동을 공부할 수 있습니다.

모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

척추 절개 한 후, 성인 zebrafish의 육주 후 손상에 의한 기능 회복이있다. 유생의 투명성과 빠른 복구를 이용하려면, 우리는 애벌레 척수에 병행하는 방법을 제시한다. 절개 한 후, 우리는 3 일 후 부상으로 이일 후 상해에서 시작 감각 회복을 관찰하고 C-굴곡 운동.

애벌레 Zebrafish의 척수 절개

제브라피시 성체 신경 발생 및 재생의 세포 및 분자 메커니즘을 밝히기 위해 우리는 제브라피시 성체 텔렌스팔론에서 기계적 손상을 일으키는 침습적 수술과 면역조직화학 또는 현장 교잡화에 의한 찌른 반구의 변화를 모니터링하는 프로토콜을 개발했습니다.

Zebrafish의 성인 Telencephalon의 자상 부상 : 척추 동물의 뇌 신경 발생과 재생을 조사하는 방법

개별 세포에 지시된 스트레스나 사멸을 일으키는 표적 조작은 상대적으로 수행하기가 어려웠습니다. 여기에서는 세포 배양 및 살아있는 동물에서 개별 세포에 선택적으로 스트레스를 가하고 죽이는 단일 세포 해상도 절제 접근법을 표준 컨포칼 UV 레이저를 기반으로 설명합니다.

기존의 UV 레이저 공 초점 현미경을 사용하여 트리거 세포 스트레스와 죽음

Zebrafish는 척추 동물의 망막 변성/중생의 메커니즘 연구 인기 동물 모델입니다. 이 프로토콜에서는 내부 망막에 최소한의 손상으로 외부 망막을 방해 하는 지역화 된 상해를 유도 하는 방법을 설명 합니다. 망막 형태학 및 망막 재생 내내 뮐러 명과 응답 이후, vivo에서 모니터링합니다.

레이저 유도 된 망막 변성 및 재생 Zebrafish 모델 뮐러 명과 셀 활성화

레이저 절제는 생물학적 시스템의 재생을 연구하는 데 널리 적용되는 기술입니다. 제시된 프로토콜은 제브라피시 측면에서 신경마비 세포를 재생시키는 레이저 절제 및 후속 시간 경과 화상 진찰을 위한 표준 레이저 스캐닝 공초점 현미경의 사용을 설명합니다.

제브라피시 간 신경종 세포의 공초점 현미경 기반 레이저 절제 및 재생 분석

이 프로토콜은 제브라피시 유충에서 수행된 이광자 레이저 절제 접근법을 설명하며, 이는 뼈 재생과 절제에 대한 면역 반응의 효과를 연구하기 위한 모델 역할을 합니다.

발달 중인 제브라피시 유충에서 조골세포의 Two-photon 레이저 매개 절제

학습하세요 제브라피쉬 유충의 반자동 레이저 유도 부상 기법으로 척수 재생 연구를 수행하는 방법을. UV 레이저와 회전 유리 모세관을 활용하여 주변 조직 손상을 최소화하고 재현성을 높입니다.

제브라피쉬 유충의 척수 재생 연구를위한 제어 된 반자동 레이저 유도 부상

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