Name: 내인성 초파리 일시적인 수용체 잠재적 채널의 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 학습하세요 Drosophila의 전장 TRP 채널 정제 방법을 INAD 단백질 복합체 기반 친화성 정제 기술을 활용하여. 이 프로토콜은 전기생리학적 특성 연구와 구조 분석을 위한 효율적인 단백질 추출을 가능하게 합니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (제 31870746 호), 심천 기본 연구 보조금 (JCYJ20200109140414636) 및 중국 광동성 자연 과학 재단 (No. 2021A1515010796)이 W. L. L. 이 원고를 준비하는 동안 언어 적 도움을 주신 LetPub (www.letpub.com)에게 감사드립니다.

1. GST 태깅된 TRP 및 그의 태그된 NORPA 단편의 정제
<ol><li>GST 태그 TRP 1261-1275 단편 정화<ol>
<li>pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 플라스미드10을 CaCl2 열충격형질전환 방법 21을 이용하여 대장균(E. coli) BL21(DE3) 세포로 형질전환시킨다. 단일 콜로니를 10 mL의 루리아 베르타니(LB) 배지에 접종하고 37°C에서 밤새 성장시킨다. 이어서, 시딩 배양액 10 mL를 37°C에서 LB 배지 1 L로 증폭시킨다.</li>
		<li>세포의 광학 밀도 (OD600)가 0.5에 도달한 후, 세포를 16°C로 냉각시키고 0.1 mM 이소프로필β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG; 최종 농도)를 첨가하여 표적 단백질의 과발현을 유도하고16°C에서 18시간 동안 배양하였다.</li>
		<li>과발현 후, 3,993 × g에서 20 분 동안 원심분리하여 배양된 세포 펠릿 1 L를 40 mL의 포스페이트 완충 식염수(PBS) 완충액에 재현탁시켰다.</li>
		<li>재현탁된 세포를 4°C에서 예비냉각된 고압 호모게나이저에 로딩한다. 천천히 호모게나이저 압력을 800 bar로 증가시킨다. 입구 탭을 열고 재현탁 된 세포가 매우 좁은 슬릿이있는 밸브를 원형으로 통과하게하십시오. 참고: 세포는 큰 압력 강하 및 캐비테이션으로 인한 높은 전단력에 의해 균질화됩니다.</li>
		<li>5 mL의 글루타티온 비드를 중력 유동 컬럼에 로딩하고, 비드를 총 3회 동안 PBS 버퍼 50 mL로 세척한다.</li>
		<li>세포 용해물을 고압 호모게나이저로부터 48,384 x g로 원심분리한다. 원심분리된 세포 용해물(40 mL)의 상층액을 중력 유동 컬럼의 평형화된 글루타티온 비드에 첨가하고, 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 글루타티온 비드를 10분마다 재현탁합니다.</li>
		<li>30분 인큐베이션 후, 컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동 관통 분획을 분리하였다. 흐름 통과 분수를 버립니다. 나머지 글루타티온 비드를 PBS 버퍼 50 mL로 두 번 헹구십시오.</li>
		<li>15 mL의 용출 완충액을 글루타티온 비드에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션한다. 10 분마다 구슬을 재현탁하십시오.</li>
		<li>30분 인큐베이션 후, 50 mL 원뿔형 튜브에서 GST-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 용출시키고, 크기-배제 컬럼(준비 등급)에 로딩하고, 이는 50 mM 트리스(pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) 완충액을 사용하여 평형화된다.</li>
		<li>크기 배제 컬럼의 용출 유속을 3 mL/min으로 유지하십시오. 용출 된 단백질을 5 mL / 튜브의 속도로 수집하십시오.</li>
		<li>280 nm에서 UV 흡수 신호를 분석하여 크기 배제 컬럼에서 표적 단백질의 피크를 확인하고 SDS-PAGE 겔 분석으로 검증한다 (전기영동 파라미터: 스태킹 겔의 경우 150 V, 분해 겔의 경우 200 V). Coomassie blue R250으로 젤을 얼룩지게하십시오.</li>
		<li>크기 배제 컬럼으로부터 정제된 GST-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 1 mL로 농축하고, 15 mL 한외여과 스핀 컬럼을 사용하여 4°C에서 3,000 x g 에서 원심분리하여 데스크탑 냉장 원심분리기에서 농축하였다.</li>
		<li>Beer-Lambert Law를 사용하여 농축 단백질의 농도를 결정하십시오. 분광광도계를 사용하여 280 nm에서 GST 태깅된 TRP 1261-1275 단편의 UV 흡수를 측정하였다.</li>
		<li>단백질 서열을 Protparam 프로그램 (https://web.expasy.org/protparam/)으로 임포트하여 280 nm에서 흡광 계수를 구하십시오. 전형적으로, GST 태깅된 TRP 1261-1275의 1 L 배양물은 1 mL의 600 μM 단백질(6 x 10-7 mol)을 산출한다. 필요한 재료 에 대해서는 표 1을 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>그의 태그가 붙은 NORPA 863-1095 단편의 정제<ol>
<li>pETM.3C NORPA 863-1095 플라스미드 20을 CaCl2 열충격 형질전환 방법21을 이용하여 대장균 BL21(DE3) 세포로 형질전환시킨다. 단일 콜로니를 LB 배지 10 mL에 접종하고 37°C에서 밤새 성장시킨다. 이어서, 시딩 배양액 10 mL를 LB 배지 1 L에서 37°C에서 증폭시킨다.</li>
		<li>세포의 OD600이 0.5에 도달한 후, 세포를 16°C로 냉각시키고 0.1 mM IPTG (최종 농도)를 첨가하여 표적 단백질의 과발현을 유도하고16 °C에서 18시간 동안 배양한다.</li>
		<li>과발현 후, 펠릿 1 L를 3,993 x g에서 20분 동안 원심분리하여 배양된 세포를 40 mL의 결합 완충액에 재현탁시켰다. 다음에, 재현탁된 세포를 단계 1.1.4에 기재된 바와 같이 4°C의 고압 호모게나이저에서 용해시킨다.</li>
		<li>5 mL의 Ni-비드를 중력 유동 컬럼에 로딩하고 50 mL의 결합 완충액으로 세 번 세척한다.</li>
		<li>세포 용해물을 고압 호모게나이저로부터 48,384 x g로 원심분리한다. 원심분리된 세포 용해물의 상층액을 중력 유동 컬럼의 평형화된 Ni-비드에 첨가하고, 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. Ni 비드를 10분마다 재현탁합니다.</li>
		<li>30분 인큐베이션 후, 컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동 관통 분획을 분리하였다. 유동 스루 분획을 버리고 나머지 Ni-비드를 50 mL의 세척 완충액으로 두 번 세척한다.</li>
		<li>용출 완충액 15 mL를 Ni-비드에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션한다. Ni 비드를 10분마다 재현탁합니다.</li>
		<li>30분 인큐베이션 후, 용출된 His-태그된 NORPA 863-1095 단편을 50 mL 원뿔형 튜브에 수집하고, 50 mM 트리스(pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT)를 사용하여 평형화되는 크기 배제 컬럼(준비 등급)에 로딩한다.</li>
		<li>크기 배제 컬럼의 용출 유속을 3 mL/min으로 유지하십시오. 용출 된 단백질을 5 mL / 튜브의 속도로 수집하십시오.</li>
		<li>280 nm에서 UV 흡수 신호를 분석하여 크기 배제 컬럼에서 표적 단백질의 피크를 확인하고 SDS-PAGE 겔 분석으로 검증한다 (전기영동 파라미터: 스태킹 겔의 경우 150 V, 분해 겔의 경우 200 V). 쿠마시 블루 R250을 사용하여 젤을 얼룩지게하십시오.</li>
		<li>크기 배제 컬럼으로부터 정제된 His-태깅된 NORPA 863-1095 단편을 1 mL로 농축하고, 15 mL 한외여과 스핀 컬럼을 사용하여 4°C에서 3,000 x g 에서 원심분리하여 데스크탑 냉장 원심분리기에서 농축하였다.</li>
		<li>Beer-Lambert Law를 사용하여 농축 단백질의 농도를 결정하십시오. 분광광도계를 사용하여 280 nm에서 His-태깅된 NORPA 863-1095 단편의 UV 흡수를 측정하였다.</li>
		<li>단백질 서열을 Protparam 프로그램 (https://web.expasy.org/protparam/)으로 임포트하여 280 nm에서 흡광 계수를 구하십시오. 전형적으로, His-태깅된 NORPA 863-1095 단편의 1 L 배양물은 1 mL의 600 μM 단백질 (6 x 10-7 mol)을 산출한다. 필요한 재료 에 대해서는 표 2를 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 초파리 머리의 준비
<ol><li>CO2 마취 방법을 사용하여 50 mL 원뿔형 원심분리 튜브에서 성인 파리를 수집22,23; 즉시 액체 질소에서 10 분 동안 동결하고 -80 ° C 냉동고에 보관하십시오.</li>
	<li>충분한 수의 파리를 수집 한 후 얼어 붙은 50mL 원뿔형 튜브를 손으로 힘차게 흔들어 파리의 다리, 머리, 날개 및 몸을 분리하십시오. 혼합물을 순차적으로 적층된 3개의 미리 냉각된 스테인리스 스틸 체(각각 20/30/40 메쉬 크기)로 옮기고 체를 흔들어 준다.</li>
	<li>다음으로, 헤드가 40 메쉬 체를 통과 할 수 없으므로 브러시를 사용하여 플라이 헤드를 40 메쉬 체에서 쓸어 내고 50 mL 원뿔형 튜브로 옮긴 다음 -80 ° C에 보관하십시오.</li>
	<li>파리와 그들의 머리를 지속적으로 수집하여 실험에 필요한 양 (0.5 g)에 도달 할 때까지 -80 °C 냉동고에 보관하십시오. 일반적으로 0.5g의 머리를 수집하려면 50mL 원뿔형 튜브에 35mL의 파리가 필요합니다. 필요한 재료 에 대해서는 표 3을 참조하십시오.</li>
</ol>3. 초파리 TRP 채널 정제
<ol><li>총 0.5g의 헤드를 계량하고 사전 냉각 된 모르타르 페슬을 사용하여 액체 질소에서 완전히 균질화하십시오. 균질화된 헤드를 10x v/w 용해 완충액(5 mL)에 용해시키고, 4°C의 진탕기에서 20분 동안 인큐베이션한 다음, 4°C에서 20분 동안 20,817 x g 에서 원심분리한다.</li>
	<li>스핀다운 상청액("20817 g S", 도 4)을 수집하고, 이를 4°C에서 60분 동안 100,000 x g 에서 추가로 원심분리한다. 다음의 풀다운 분석을 위해 스핀 다운 상청액 ("100,000 g S", 도 4)을 사용한다.</li>
	<li>1 mL의 Ni 비드를 중력 유동 컬럼에 첨가하고, 비드를 10 mL의 이중 증류 H2O (ddH2O)로 4°C에서 총 3회 동안 세척하였다. 비드를 4°C에서 세 번 10 컬럼 부피의 용해 완충액으로 평형화시킨다.</li>
	<li>500 μL의 600 μM 정제된 His-태깅된 NORPA 863-1095 단백질 (3 x 10-7 mol)을 Ni 컬럼에 첨가하고, 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 10 분마다 구슬을 재현탁하십시오.</li>
	<li>컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동 스루 분획을 분리한다. SDS-PAGE 분석을 위해 플로우 스루 분획을 취한다(NORPA F, 도 4). 이 섹션에서는 미끼 단백질이 Ni 비드에 고정화됩니다.</li>
	<li>Ni 비드를 4°C에서 10 컬럼 부피의 용해 완충액(10 mL)으로 세척하고, SDS-PAGE 분석을 위해 세척 분획을 유지한다(세척 1, 도 4A). 상기 단계를 반복하고 SDS-PAGE 분석을 위해 샘플을 보관한다(세척 2, 도 4A). 이 섹션에서는 Ni 비드의 과도한 미끼 단백질이 제거됩니다.</li>
	<li>초파리 헤드 균질액의 상층액을 100,000 x g 원심분리 후 4°C에서 Ni 컬럼에 넣고, 여기서 His-태그된 NORPA 863-1095 단편이 고정화되었다.</li>
	<li>상청액을 Ni 비드와 함께 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 10 분마다 구슬을 재현탁하십시오. 이어서, 컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동-관통 분획을 분리한다.</li>
	<li>SDS-PAGE 분석을 위해 상청액을 수집한다(Dro head lysis F, 도 4A). 이 섹션에서, 헤드 균질물 내의 INAD 단백질 복합체 (INAD/TRP/ePKC)는 Ni-비드 상에 고정화된 NORPA 863-1095 단편에 의해 포획된다.</li>
	<li>Ni 비드를 4°C에서 10 컬럼 부피의 용해 완충액(10 mL)으로 세척하고, SDS-PAGE 분석을 위해 중력 침전으로부터 상청액을 유지한다(세척 3, 도 4A). 상기 단계를 반복하고 SDS-PAGE 분석을 위해 상청액을 수집한다(세척 4, 도 4A). 이 섹션에서는 Ni 비드 상의 결합되지 않은 단백질이 제거됩니다.</li>
	<li>500 μL의 600 μM의 GST-태깅된 TRP 1261-1275 단백질 (3 x 10-7 mol)을 Ni- 비드에 첨가하고, 4°C에서 20분 동안 인큐베이션한다. 10 분마다 구슬을 재현탁하십시오.</li>
	<li>내인성 초파리 TRP 채널을 포함하는 중력 컬럼 (TRP E1, 도 4B)으로부터 용출된 분획을 수집한다. 상기 단계를 반복하고 용출 분획을 수집한다(TRP E2, 도 4B). 이 단계에서, GST 태깅된 TRP 1261-1275 단편을 경쟁자로서 사용함으로써, TRP 채널은 Ni-비드 상의 포획된 INAD 단백질 복합체(INAD/TRP/ePKC)로부터 용출된다.</li>
	<li>Ni-비드를 10 컬럼 부피의 결합 완충액 (10 mL; 표 1) 4°C에서 SDS-PAGE 분석을 위해 세척 분획을 수집하였다(세척 5, 도 4B).</li>
	<li>500 μL의 용출 완충액(표 1)을 Ni 비드에 첨가하고, 4°C에서 20분 동안 인큐베이션한다. 중력 유동 컬럼으로부터 용출 분획을 수집한다(NORPA E1, 도 4B). 상기 단계를 반복하고, 용출 분획을 수집한다(NORPA E2, 도 4B).</li>
	<li>용출 완충액을 사용하여, INAD/ePKC 단백질 복합체와 함께 His-태깅된 NORPA 863-1095 단편을 용출시킨다. 다음에, Ni 비드를 500 μL의 결합 완충액에 재현탁시킨다.</li>
	<li>재현탁된 Ni 비드를 취하여 SDS-PAGE(쿠마시 블루 R250으로 염색)를 실행하여 용출의 효율을 분석하고 용출액이 작동하는지 평가하였다(비드, 도 4B). 필요한 재료 에 대해서는 표 4 를 참조하십시오.</li>
</ol>4. 초파리 TRP 채널의 크기 배제 컬럼 정제
<ol><li>단백질 정제 시스템에 크기 배제 컬럼 (분석 등급)을 설치하십시오. 컬럼을 컬럼 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0.75 mM DDM)으로 평형화시키고, 이는 0.45 μm 필터에 의해 여과된다.</li>
	<li>단계 3.14로부터의 TRP E1 및 E2 분획을 4 mL 한외여과 스핀 컬럼을 사용하여 농축시키고, 냉장 원심분리기에서 4°C에서 3,000 x g 에서 원심분리하였다.</li>
	<li>컬럼 버퍼로 샘플 루프를 헹구고 샘플을 샘플 루프에 로드합니다. 샘플을 크기 배제 컬럼에 주입하고 적절한 유량 (0.5 mL / 분)으로 단백질을 용출시킵니다.</li>
	<li>280 nm에서 흡수하여 표적 단백질의 피크를 확인하고 SDS-PAGE 겔을 실행하여 정제된 내인성 초파리 TRP 채널을 검출한다(도 5). 필요한 재료 에 대해서는 표 5를 참조하십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).</li>
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<li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li>
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다섯 개의 PDZ 도메인을 포함하는 INAD는 초파리 광전달 기계의 핵심 조직자입니다. 이전의 연구는 INAD PDZ3이 절묘한 특이성(KD = 0.3 μM)18을 갖는 TRP 채널 C 말단 꼬리에 결합한다는 것을 보여주었다. INAD PDZ45 탠덤은 매우 높은 결합 친화도(KD = 30 nM)를 갖는 NORPA 863-1095 단편과 상호작용한다. 이러한 발견은 친화성 정제와 경쟁 전략을 설계하기 위한 견고한 생화학적 기반을 제공하여 NORPA CC-PBM 단편을 풀다운 미끼로 사용할 수 있게 하는 반면, TRP C 말단 꼬리(단편 1261-1275)는 경쟁 시약으로 기능합니다. 따라서, 이 방법의 첫 번째 중요한 점은 INAD 복합체의 조립 메커니즘을 이해하고 충분한 NORPA 및 TRP 단편을 얻는 것이다. 동시에, TRP 채널은 멤브레인으로부터 추출되고 용액에서 안정화되어야하는 막 단백질이기 때문에 세제의 사용은이 방법의 ...

광전달은 흡수된 광자가 뉴런의 전기 코드로 변환되는 과정입니다. 그것은 독점적으로 척추 동물과 무척추 동물 모두에서 옵신과 다음 G 단백질 결합 신호 전달 캐스케이드를 전달합니다. 초파리에서, 그의 다섯 PDZ 도메인을 사용하여, 스캐폴드 단백질 불활성화-없음-사후 전위 D(INAD)는 일시적인 수용체 전위(TRP) 채널, 포스포리파제 Cβ/No 수용체 전위 A(PLCβ/NORPA) 및 눈 특이적 단백질 키나아제 C(ePKC)1로 구성된 초분자 신호전달 복합체를 조직한다. 이 초분자 신호 복합체의 형성은 Drosophila 광전달 기계의 정확한 세포 내 국소화, 고효율 및 특이성을 보장합니다. 이 복합체에서 빛에 민감한 TRP 채널은 NORPA의 하류 이펙터 역할을하며 칼슘 유입과 광수용체의 탈분극을 매개합니다. 이전의 연구는 초파리 TRP 채널의 개방이 양성자, 국소 지질 환경의 파괴 또는 기계적 힘 2,3,4에 의해 매개된다는 것을 보여주었습니다. 초파리 TRP 채널은 또한 calmodulin 5와 상호 작용하며 긍정적 인 피드백과 부정적인 피드백 6,7,8 모두에 의해 칼슘에 의해 변조됩니다.
지금까지 초파리 TRP 및 TRP 유사 (TRPL) 채널의 게이팅 메커니즘에 대한 전기 생리학 연구는 절제된 막 패치, 해리 된 야생형 초파리 광수용체로부터의 전체 세포 기록 및 S2, SF9 또는 HEK 세포 2,9,10,11,12,13의 헤테로 발현 채널을 기반으로했지만 정제 된 채널에서는 그렇지 않았습니다. 전장 초파리 TRP 채널의 구조 정보도 불분명하다. 재구성된 막 환경에서 정제된 단백질의 전기생리학적 특성을 연구하고 전장 초파리 TRP 채널의 구조적 정보를 얻기 위해, 정제된 전장 TRP 채널을 얻는 것은 포유동물 TRP 채널 연구14,15,16,17에서 사용된 방법론과 유사한 첫 번째 단계이다.
최근에, INAD 단백질 복합체18,19,20의 조립 메카니즘에 기초하여, 스트렙타비딘 비드5에 의해 초파리 머리 균질물로부터 TRP 채널을 정제하기 위해 친화성 정제 플러스 경쟁 전략이 처음 개발되었다. 스트렙타비딘 비드의 낮은 용량과 비싼 비용을 고려하여, His-태깅된 미끼 단백질과 훨씬 더 높은 용량의 상응하는 저가의 Ni-비드를 사용하는 개선된 정제 프로토콜이 여기에 도입된다. 제안된 방법은 구조적 각도에서 TRP 채널의 게이팅 메카니즘을 연구하고 정제된 단백질로 TRP 채널의 전기생리학적 특성을 측정하는 데 도움이 될 것이다.

<table><tbody><tr><td>Bacterial strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Competent Cells</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>Protein overexpression</td></tr><tr><td>Experiment models</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D.melanogaster: W1118 strain</td><td>블루밍턴 초파리 주식 센터</td><td>BDSC:3605</td><td>Drosophila head 준비</td></tr> <tr><td>< 강> 재질 </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>20 / 30 / 40 메쉬 스테인레스 스틸 체</td><td>Jiufeng 금속 메쉬 회사</td><td>GB / T6003.1</td> <td> head 준비</td></tr><tr><td>30 % 아크릴 아미드 -N, N &prime ; -Methylenebisacrylamide (29 : 1)</td> <td>Lablead</td><td>A3291</td><td>SDS-PAGE 젤 준비</td></tr><tr><td>과황산 암모늄</td><td>Invitrogen</td><td>HC2005</td><td>SDS-PAGE 겔 제제</td></tr><tr><td>칵테일 프로테아제 억제제</td><td>Roche</td><td>05892953001</td><td>프로테아제 억제제</td></tr><tr><td>Coomassie brilliant blue R-250</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100472-0025</td><td>SDS-PAGE 겔 염색</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A620058-0100</td><td>크기 배제 컬럼 완충액 준비</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐 염 (EDTA)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500838-0500</td><td>크기 배제 컬럼 완충액 준비</td></tr><tr><td>글리신</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610235-0005</td><td>SDS-PAGE 완충액 준비</td></tr><tr><td>글루타티온 세파로스 4 고속 유동 비드</td><td>Cytiva</td><td>17513202</td><td>친화성 크로마토그래피</td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0001</td><td>용리 완충액 Ni-column</td></tr><tr><td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td> 준비<td>Sangon Biotech</td><td>A600168-0025</td><td>단백질 과발현</td></tr><tr><td>유도 LB Broth Powder</td><td>Sangon Biotech</td><td>A507002-0250</td><td>E.coli. 세포 배양</td></tr><tr><td>L-Glutathione reduced (GSH)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G4251-100G</td><td>글루타티온 비드</td></tr><tr><td>용 용리 완충액 준비Ni-Sepharose 엑셀 비드</td><td>Cytiva</td><td>17371202</td><td>친화성 크로마토 그래</td></tr>피 <tr><td>N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610424-001</td><td>단백질 정제 용 세제</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td>SDS-PAGE 겔 준비</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607008-0500</td><td>E.coli. 세포 PMSF용 균질화 완충</td></tr>액 <tr><td>Lablead</td><td></td><td>P0754-25G</td><td>프로테아제 억제제</td></tr><tr><td>Prestained protein marker</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619/26616</td><td>Prestained protein ladder</td></tr><tr><td>Size exclusion column (preparation grade)</td><td>Cytiva</td><td>28989336</td><td>HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column</td></tr><tr><td>Size exclusion column (analytical grade)</td><td>Cytiva</td><td>29091596</td><td>Superose 6 Increase 10/300 GL column</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501218-0001</td><td>단백질 정제 완충액 준비</td></tr><tr><td>도데실황산나트륨 (SDS)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500228-0001</td><td>SDS-PAGE 젤 / 완충액 준비</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T1503-10KG</td><td>단백질 정제 완충액 준비</td></tr><tr><td>한외 여과 스핀 column</td>: <td>Millipore</td><td>UFC901096/801096</td><td>단백질 농도</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>DENVER</td><td>APX-60</td><td>Metage of Drosophila head</td></tr><tr><td>15mL 및 50mL 코니컬 원심분리 튜브용 탁상용 고속 냉장 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>단백질 농축</td></tr><tr><td>탁상용 고속 냉장 원심분리기 1.5mL 원심분리 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>균질화 후 Drosophila 헤드 용해물의 원심</td></tr>분리 <tr><td>빈 중력 흐름 컬럼(내경=1.0cm)</td><td>Bio-Rad</td><td>738-0015</td><td>TRP 단백질 정제</td></tr><tr><td>빈 중력 흐름 컬럼(내경=2.5cm)</td><td>Bio-Rad</td><td>738-0017</td><td>E.coli.</td></tr><tr><td>Gel 문서화 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>Universal Hood II Gel Doc XR 시스템</td><td>SDS-PAGE 이미징</td></tr><tr><td>고속 냉장 원심분리기</td><td>Beckman coulter</td><td>Avanti J-26 XP</td><td>E.coli. 세포/세포 용해물의 원심</td></tr>분리 고압 <tr><td>균질화</td><td>UNION-BIOTECH</td><td>UH-05</td><td>E.coli. 세포의 균질화</td></tr><tr><td>액체 질소 탱크</td><td>Taylor-Wharton</td><td>CX-100</td><td>Drosophila head 준비</td></tr><tr><td>단백질 정제 시스템</td><td>Cytiva</td><td>AKTA 정제</td>기 <td>단백질 정제</td></tr><tr><td>냉장고 (-80&deg; C)</td> <td>Thermo</td><td>900GP</td> <td> head 준비</td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>MAPADA</td><td>UV-1200</td><td>OD600 E.coli. 세포 측정</td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000c</td><td>단백질 농도 측정</td></tr><tr><td>초 원심 분리기</td><td>Beckman coulter</td><td>Optima XPN-100 초 원심 분리기</td><td>초원심분리</td></tr></tbody></table>

내인성 초파리 일시적인 수용체 잠재적 채널의 정제

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

초파리 광형질도입은 가장 빠르게 알려진 G 단백질 결합 신호전달 경로 중 하나이다. 이 캐스케이드의 특이성과 효율을 보장하기 위해, 칼슘 (Ca2+)-투과성 양이온 채널, 일시적 수용체 전위 (TRP)는 스캐폴드 단백질에 긴밀하게 결합하고, 불활성화-불활성화-무-전위 D(INAD), 그리고 눈 특이적 단백질 키나아제 C(ePKC) 및 포스포리파제 Cβ/No 수용체 전위 A(PLCβ/NORPA)와 함께 큰 신호전달 단백질 복합체를 형성한다. 그러나 초파리 TRP 채널의 생화학 적 특성은 불분명하다. INAD 단백질 복합체의 조립 메카니즘에 기초하여, 내인성 TRP 채널을 정제하기 위해 변형된 친화성 정제 플러스 경쟁 전략이 개발되었다. 먼저, 정제된 히스티딘 (His)-태깅된 NORPA 863-1095 단편을 Ni-비드에 결합시키고, 초파리 머리 균질물로부터 내인성 INAD 단백질 복합체를 끌어내리기 위한 미끼로 사용하였다. 이어서, 과량의 정제된 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 TRP 채널과 경쟁하기 위해 Ni-비드에 첨가하였다. 마지막으로, 상청액 내의 TRP 채널을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 과도한 TRP 1261-1275 펩티드로부터 분리하였다. 이 방법은 생화학 적 및 구조적 각도 모두에서 초파리 TRP 채널의 게이팅 메커니즘을 연구 할 수있게합니다. 정제된 초파리 TRP 채널의 전기생리학적 특성은 또한 미래에 측정될 수 있다.

이 기사에서는 내인성 초파리 TRP 채널을 정제하는 단백질 정제 방법을 시연합니다 (그림 1).
먼저, 재조합 단백질 발현 및 정제가 미끼 및 경쟁자 단백질을 얻기 위해 적용된다. 이어서, GST-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 LB 배지의 대장균 BL21 (DE3) 세포에서 발현시키고, 글루타티온 비드 및 크기 배제 컬럼을 사용하여 정제하였다 (도 2). 샘플을 쿠마시 블루 R250 염색을 사용한 SDS-PAGE 분석을 사용하여 검증하였다. SDS-PAGE 샘플 제조 공정에서, 30 μL의 단백질 샘플을 10 μL의 4x 로딩 염료와 혼합하고 100°C에서 10분 동안 비등시킨다. 이어서, 15 μL의 삶은 샘플이 각 웰에 개별적으로 로딩된다. His-태깅된 NORPA 863-1095 단편은 또한 LB 배지에서 대장균...

INAD 단백질 복합체의 조립 메카니즘에 기초하여, 이 프로토콜에서, 내인성 초파리 TRP 채널을 정제하기 위해 변형된 친화성 정제 플러스 경쟁 전략이 개발되었다.

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

이 프로토콜에서는 전기 생리학적 특성을 연구하고 전장 초파리 TRP 채널의 구조 정보를 얻는 데 필요한 첫 번째 단계인 정제된 전장 TRP 채널을 얻기 위한 정제 과정을 시연합니다. INAD 단백질 복합체의 샘플링 메카니즘에 기초하고 훨씬 더 높은 용량의 저가의 니켈 비드를 사용하여, 충분한 양의 TRP 채널이 플라이 헤드로부터 정제될 수 있다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자 인 Yuyang Liu가 될 것입니다.먼저, 염화칼슘 열충격 형질전환 방법을 이용하여 pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 플라스미드를 E.coli BL21 세포로 형질전환시킨다. Luria Bertani 배지 10 밀리리터에 단일 식민지를 접종하고 섭씨 37도에서 밤새 자랍니다. 10 밀리리터의 시딩 배양물을 Luria Bertani 배지 1 리터에 넣고 섭씨 37도에서 배양하십시오.세포의 광학 밀도가 0.5에 도달 한 후 세포를 섭씨 16도까지 냉각시키고 0.1 밀리몰 이소프로필 - 베타 -D-1- 티오갈락토피라노사이드를 첨가하십시오. 과발현 후, 원심분리에 의해 배양된 세포를 한 리터 펠릿하고, 40 밀리리터의 포스페이트 완충 식염수에 재현탁시켰다. 재현탁 된 세포를 고압 균질 기에 넣고 섭씨 네 도까지 미리 냉각하십시오.천천히 호모게나이저 압력을 800 bar로 증가시킨다. 입구 탭을 열고 재현탁 된 셀이 좁은 슬릿이있는 밸브를 원형으로 통과하도록하십시오. 글루타티온 비드 5 밀리리터를 중력 흐름 컬럼에 적재하고 50 밀리리터의 인산염 완충 식염수 완충액으로 비드를 총 세 번 세척하십시오.48, 384배 G.에서 고압 호모게나이저로부터 세포 용해물을 원심분리하고, 원심분리된 세포 용해물의 상등액 약 40 밀리리터를 중력 유동 컬럼 내의 평형화된 글루타티온 비드에 첨가하고, 섭씨 4도에서 30분 동안 인큐베이션한다. 글루타티온 비드를 10분마다 재현탁합니다. 30분 동안 인큐베이션한 후, 컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동 관통 분획을 분리하였다.유동 분획을 버리고, 나머지 글루타티온 비드를 50 밀리리터의 인산염 완충 식염수 완충액으로 두 번 헹구십시오. 글루타티온 비드에 15 밀리리터의 용출 완충액을 첨가하고, 10분마다 비드를 재현탁시킨다. GST 태그가 지정된 TRP 1261-1275 단편을 50 mL 원뿔형 튜브에 넣고 크기 배제 컬럼에 로딩한다.튜브 당 다섯 밀리리터의 용출된 단백질을 수집하고, 냉장 원심분리기의 한외여과 스핀 컬럼에서 원심분리하여 정제된 단편을 하나의 밀리리터로 농축시킨다. His-tagged NORPA 863-1095 단편을 정제하려면 니켈 비드를 사용하여 이전에 입증된 절차를 따르십시오. 성인 파리를 50 밀리리터 원뿔형 원심 분리 튜브에 모으고 액체 질소에서 10 분 동안 동결시킵니다.얼어 붙은 튜브를 손으로 격렬하게 흔들고 혼합물을 순차적으로 쌓인 세 개의 미리 냉각 된 스테인레스 스틸 체로 옮깁니다. 체를 흔들고 브러시를 사용하여 40 메쉬 체에서 플라이 헤드를 닦아냅니다. 다섯 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮겨 영하 80도에 보관하십시오.미리 냉각 된 모르타르와 유모차를 사용하여 액체 질소에서 0.5 그램의 머리를 균질화하십시오. 균질화된 헤드를 5밀리리터의 10X 용해 완충액에 용해시키고, 섭씨 4도에서 20, 817배 G에서 20분 동안 원심분리하였다. 스핀 다운 상청액을 섭씨 4도에서 60분 동안 100, 000배 G로 더 원심분리한다.중력 흐름 컬럼에 니켈 비드 1 밀리리터를 넣고 섭씨 4도에서 이중 증류수 10 밀리리터로 비드를 세 번 씻으십시오. 구슬을 섭씨 네 도에서 세 번 10 컬럼 부피의 용해 버퍼로 평형화하십시오. 500 마이크로리터의 600 마이크로몰 정제된 His-태깅된 NORPA 863-1095 단백질을 니켈 컬럼에 첨가하고, 컬럼을 인큐베이션한다.10 분마다 구슬을 재현탁하십시오. 컬럼 출구 탭을 열어 비드와 유동 스루 분획을 분리하고, 니켈 비드를 10 밀리리터의 냉 용해 완충액으로 세척한다. 그런 다음 Drosophila head homogenate의 차가운 상청액을 니켈 컬럼에 첨가하십시오.인큐베이션 후, 비드를 10 밀리리터의 용해 완충액으로 세척하고 500 마이크로리터의 600 마이크로몰 GST-태깅된 TRP 1261-1275 단백질을 비드에 첨가한다. 중력 컬럼으로부터 용출된 분획을 수집한다. 니켈 비드를 10 밀리리터의 결합 완충액으로 씻으십시오.그런 다음, 용출 완충액을 첨가하고, 중력 유동 컬럼으로부터 용출 분획을 수집한다. 초파리 TRP 채널 정제로부터 용출된 분획을 네 밀리리터 한외여과 스핀 컬럼을 사용하여 농축한다. 샘플을 크기 배제 컬럼에 주입하고, 합리적인 유속으로 단백질을 용출시킨다.GST-태깅된 TRP 1261-1275 단편을 E.coli 세포에서 발현시키고, 글루타티온 비드 및 크기 배제 컬럼을 사용하여 정제하였다. 유사하게, His-태깅된 NORPA 863-1095 단편을 니켈 비드 및 크기 배제 컬럼을 사용하여 발현되고 정제되었다. 용출된 TRP 채널은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 과도한 GST 태깅된 TRP 1261-1275 펩티드로부터 분리된다.부산물로서, INAD, ePKC, NORPA 863-1095 복합체는 TRP 1261-1275 펩티드 경쟁 후에 수득된다. 이 프로토콜을 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 액체 질소에서 플라이 헤드를 균질화하고 DDM이라는 세제를 함유 한 완충액에서 균질액을 해결하는 것입니다. 이 절차에 따라, 우리는 또한 조립 및 조절 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수있는 전체 INAD 단백질 복합체를 정제 할 수 있습니다.이 방법의 잠재적 인 향후 적용은 Cryo-EM 기술을 사용하여 내인성 초파리 TRP 채널의 구조 정보를 연구하는 것입니다. 또한, 인공 이중층 지질막에서 정제된 내인성 초파리 TRP 채널의 전기생리학적 특성을 측정하는 것도 실현 가능하다.

purification-endogenous-drosophila-transient-receptor-potential

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 절차에 신경근육학 교차로 (NMJ)에서 광 펄스로 신경 잠재력을 보여주고에 푸른 빛을 활성화 algal 채널 및 셀 - 특정 유전자 표현 도구를...

에서 시냅틱 후보의 Channelrhodopsin2 중재 ​​자극 Drosophila 신경근육학 분기점

현장 패치에 클램프 녹음은 그대로 회로의 뉴런의 electrophysiological 특성에 사용됩니다. CNS는 작고 강력한 피복에 둘러싸여 있기 때문에 Drosophila 유전자 모델 패치를 고정으로 어렵습니다. 이 문서는 이후의 패치 클램프 녹음의 집과 깨끗한 뉴런을 제거 할 수있는 절차에 대해 설명합니다.

의 작성<em&gt; Drosophila</em에 대한&gt; 중부 뉴런<em&gt; 현장에서</em&gt; 패치 클램핑

이 비디오는 흰눈초파리에서 장기간의 탈분극 후전위(PDA)를 조사하기 위한 실험 프로토콜을 보여줍니다. 파리의 눈은 강렬한 청색광 펄스에 노출되어 광색소 로돕신을 메타로돕신으로 변환하여 양이온 채널을 열고 막 탈분극을 유발하는 신호 폭포를 시작합니다. 청색광은 메타로돕신이 로돕신으로 재전환되는 것을 막기 때문에 양이온의 지속적인 유입은 장기간의 탈분극 후전위(PDA)로 알려진 지속적인 탈분극을 초래합니다.

초파리 광수용체(Drosophila Photoreceptor)에서 PDA(Prolonged Depolarizing Afterpotential) 조사

출처: Wagner, K. et al., eGFP 태그가 지정된 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포의 막 단백질 이동을 연구합니다.J. vis. 특급 (2022). 이 동영상은 eGFP 표지된 TRPL 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 이동을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이미징을 위한 형질전환 파리의 준비, 광수용체 세포의 형광 이미지 캡처, 횡문막에서 상대적 eGFP 형광을 측정하여 TRPL 트래픽의 정량화에 대해 자세히 설명합니다.

Drosophila Photoreceptor Cells의 막 단백질 이동에 대한 연구

Drosophila melanogaster photoreceptor의 전체 세포 기록은 다양한 조건 에서 자연스런 어두운 범프, 양자 범프, 빛에 대한 거시적 반응 및 전류 - 전압 관계를 측정 할 수있게합니다. D. melanogaster 유전자 조작 도구와 결합하여이 방법은 유비쿼터스 이노시톨 - 지질 신호 전달 경로와 그 표적 인 TRP 채널에 대한 연구를 가능하게합니다.

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

이 프로토콜의 목표는 중형 규모 (0.5-1g)에서 초파리 ( Drosophila) 배아를 수집하고 친화도 정화 - 질량 분광 분석 (AP-MS)과 같은 하류의 단백질 응용 분야에서 사용할 수있는 단백질 추출물을 제조하는 간단하고 저렴한 접근법을 제공하는 것입니다 ).

중간 규모의<em&gt; Drosophila</em&gt; 프로테옴 실험을위한 배아 추출물

이 문서는 테트로도톡신와 테트로도톡신 저항 나트륨 채널, NaChBac 채용 하 여 뉴런 사이의 monosynaptic 연결을 테스트 하는 방법을 갖추고 있습니다.

Drosophila 테트로도톡신 저항 나트륨 채널을 사용 하 여 Monosynaptic 연결 검사

이 문서에는 분 광 분석에 대 한 세제 solubilized TRPV1의 생 화 확 적인 수량을 얻기 위해 특정 방법을 설명 합니다. 결합 된 프로토콜 막 제어 환경에서 포유류 이온 채널에 대 한 구조 및 기능 연구를 촉진 하기 위하여 적응 시킬 수 있다 생 화 확 및 생물 도구를 제공 합니다.

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

이 프로토콜 비용 효율적이 고 편리한 약리학 대리인, 신경 단백질의 유전자 돌연변이의 테스트를 가능 하 게 초파리 melanogaster 중앙 신경 시스템의 하강 전기 활동을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 또는 미개척된 생리 적인 통로의 역할입니다.

제 3-탈피 초파리 Melanogaster 의 중앙 신 경계 활동의 electrophysiological 녹음

여기에서, 광수용체 막 단백질의 국소화 및 eGFP 형광을 이용한 초파리 화합물 안구에서의 망막 변성의 평가를 위한 비침습적 방법이 기재되어 있다.

eGFP 태그 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 밀매를 연구하기

우리는 전기생리학적으로 이중 안정한 광안료를 특성화하기 위한 프로토콜을 제시한다: (i) 광자-흡수 및 광수용체에서의 그들의 엄청난 양에 뒤따르는 광안료 분자 내의 전하 변위를 이용하고, (ii) 로돕신과 메타로돕신 광안료 상태의 흡수-스펙트럼 차이를 이용한다. 이들 프로토콜은 이중-안정한 광안료 시스템에 영향을 미치는 돌연변이를 스크리닝하는데 유용하다.

초파리 광수용체에서 광안료 수준을 측정하기 위한 전기생리학적 방법

학습하세요 Drosophila의 전장 TRP 채널 정제 방법을 INAD 단백질 복합체 기반 친화성 정제 기술을 활용하여. 이 프로토콜은 전기생리학적 특성 연구와 구조 분석을 위한 효율적인 단백질 추출을 가능하게 합니다.

내인성 초파리 일시적인 수용체 잠재적 채널의 정제

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