Name: 박테리아 발현 및 친화성 크로마토그래피를 이용한 인간 매트릭스 메탈로프로테이나제-3의 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 배우세요 E. coli에서 MMP-3 촉매 영역을 발현하고 His-tag 친화성 크로마토그래피로 정제하는 방법을. R2DP 균주를 활용하여 단백질 수율을 높이고 활성 단백질을 얻어 치료제 개발에 활용할 수 있습니다.

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저자들은 플로리다 주 잭슨빌의 메이요 클리닉에서 에베트 라디스키 박사와 알렉산드라 호클라 박사가 Hisx6pro-MMP-3cd 유전자를 복제하기 위한 주형으로 pET-3a-pro-MMP-3cd 플라스미드를 제공한 것에 대해 인정하고 싶고, 그들의 의견은 리노의 네바다 대학의 네바다 유전체학 센터의 폴 하틀리 박사와 함께 DNA 시퀀싱을 위해 제시하고 싶다. 저자는 또한 단백질 발현의 일부를 도와 준 카산드라 헤르겐라더에게 감사하고 싶습니다. M.R.-S. NIH-P20 GM103650-COBRE 통합 신경 과학 보조금과 UNR R & D mICRO SEED Grant Award에 감사드립니다.

<ol><li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+for+structural+biology+in+HEK+293F+suspension+cells%3A+A+novel+and+accessible+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897(2014).</li>
<li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568(2015).</li>
<li>Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+protein+purification+facilitated+by+a+small+bispecific+affinity+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370(2012).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+production+of+soluble+proteins+from+insoluble+inclusion+bodies+by+a+two-step-denaturing+and+refolding+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method.</a> PLoS One. 6 (7), 22981(2011).</li>
<li>Hu, X., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+functional+matrix+metalloproteinases+by+zymography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445(2010).</li>
<li>Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+matrix+metalloproteinase+inhibition+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).</li>
<li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteinases+and+their+inhibitors%3A+Potential+for+the+development+of+new+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics.</a> Cells. 9 (5), 1313(2020).</li>
<li>Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+matrix+metalloproteinases+and+TIMPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs.</a> Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).</li>
<li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+the+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+reveals+that+its+N-+and+C-terminal+domains+cooperate+in+matrix+metalloproteinase+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).</li>
<li>Batra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-10+%28MMP-10%29+interaction+with+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+TIMP-1+and+TIMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).</li>
<li>Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K. Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSingh%2C+KK+%22Matrix+Metalloproteases%22">Matrix Metalloproteases</a>. Galea, C. A. , Humana Press. New York, NY. 3-16 (2017).</li>
<li>Manka, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+triple-helical+collagen+cleavage+by+matrix+metalloproteinase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).</li>
<li>Gomis-Ruth, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inhibition+of+the+human+matrix+metalloproteinase+stromelysin-1+by+TIMP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1.</a> Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).</li>
<li>Shirian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converting+a+broad+matrix+metalloproteinase+family+inhibitor+into+a+specific+inhibitor+of+MMP-9+and+MMP-14%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14.</a> FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+histidine-tagged+catalytic+domain+of+MMP-13+in+one+step+using+affinity+column+and+renaturation+of+it+with+histidine+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Liquid+Chromatography+%26+Related+Technologies%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag.</a> Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).</li>
<li>Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+and+general+expression+platform+for+the+production+of+secreted+proteins+from+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041(2012).</li>
<li>McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+fusion+construct+enables+high-yield+production+of+soluble%2C+active+matrix+metalloproteinase-8+%28MMP-8%29+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli.</a> Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).</li>
<li>Maity, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GST-His+purification%3A+A+two-step+affinity+purification+protocol+yielding+full-length+purified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320(2013).</li>
<li>Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+benefits+of+protein+co-expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431(2015).</li>
<li>Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HeLa+based+cell+free+expression+systems+for+expression+of+Plasmodium+rhoptry+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772(2015).</li>
<li>Zeytuni, N., Zarivach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+M.+magneticum+strain+AMB-1+magnetosome+associated+protein+MamA%CE%9441%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamAΔ41.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844(2010).</li>
</ol>

저자들은 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

가용성, 인간, 재조합 MMP의 대규모 생산은 여전히 어려운 과제입니다. 포유동물 세포는 높은 비용과 긴 대기 시간으로 기능적 MMP를 발현할 수 있는 반면, 대장균은 정제되고 재접혀져야 하는 다량의 MMP 봉입체를 빠르게 생산한다11,16. R2DP 세포는 MMP 봉입체의 수율을 상당히 증가시켜, 보다 비용 효율적이고 생산적인 MMP 리폴딩 공정을 가능하게 한다. 그러나 대장균은 MMP를 접는 데 필요한 번역 후 기계가 부족하며, 조작된 균주가 크게 향상된 발현 수준을 보여 주지만, 변성제 제거시 일부 중간체 만 적절하게 접힙니다4. 결과적으로, MMPs의 가끔 침전은 리폴딩 및 활성화 동안 여전히 예상된다. 이들 결과는 정제된 Hisx6-pro-MMP-3cd 수율의 상당 부분이 재폴딩, 활성화 및 탈염 후에 손실된다는 것을 보여준다.
<p ...

대부분의 복잡한 진핵 단백질은 발현 후 정교한 번역 후 변형을 거치며, 고도로 보조된 단백질 폴딩 및 보조 인자가 기능적이어야 합니다1. 박테리아 숙주에서 다량의 가용성 인간 단백질을 생산하는 것은 소규모 실험실 실험에서도 높은 비용과 강력한 발현 및 정제 방법의 부족으로 인해 중요한 과제로 남아 있습니다2,3. MMPs, 큰 분자량을 가진 인간 endopeptidases는 일반적으로 대장균 에서 발현될 때 불용성 봉입체로서 발현된다. 가용성 인간 MMP의 추출은 종종 힘들고 시간이 많이 걸리는 가용화 및 재접힘 공정4으로 이어진다.
MMP는 생리적 및 병원성 과정 모두에서 중요한 역할을 한다. 인간 MMPs는 구조 및 기질 특이성에 의해 분류되고, 고도로 보존된 촉매 도메인5,6에도 불구하고 차등적으로 발현되는 23개의 아연 엔도펩티다제의 패밀리이다. MMPs는 비활성 효소원으로서 분비되고, 번역 후 활성화 및 이들의 내인성 억제제, 메탈로프로테이나제 (TIMPs)의 조직 억제제 7,8,9,10을 통해 조절된다. 처음에는 ECM 회전율에서 그들의 역할에 대해 인정되었지만, MMP는 또한 발달, 형태 형성, 조직 복구 및 리모델링에 연루되어 있습니다8. MMPs의 조절 장애는 다른 질병 중에서도 신경 퇴행성, 심장 혈관 및 섬유성 질환과 함께 암과 특히 관련이 있습니다5,7.
강력한 대규모 MMP 생산 방법의 개발은 생화학 및 세포 기반 분석을 통해 MMP 메커니즘에 대한 향후 연구의 성공을 보장하는 데 중요합니다. 다양한 MMP가 MMP 활성을 변경하지 않고 Hisx6-태그된 MMP를 포함하는 박테리아11에서 이전에 발현되었다12,13,14,15. 그러나 이러한 방법에는 복제하기 어려울 수 있는 지루하고 긴 단계가 포함됩니다.
포유동물 세포는 또한 적절한 번역 후 변형을 보장하면서 많은 상이한 인간 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다16. 포유동물 발현 시스템이 적절한 번역 후 변형을 갖는 재조합 인간 단백질을 생산하기 위한 이상적인 선택이지만, 이 방법의 주요 단점은 초기 낮은 수율, 값비싼 성장 배지 및 시약, 안정적인 발현 라인에 도달하기 위한 긴 타임라인, 진균 또는 박테리아와 같은 다른 종과의 오염 위험이다2,11 . 더욱이, 포유동물 세포주에서의 MMP 생산은 TIMPs 또는 피브로넥틴11과 같은 관련 세포 단백질로부터의 불순물을 산출한다. 포유류 세포에서 관찰되는 느린 세포 성장과는 달리, 박테리아 발현 시스템은 더 간단한 배지 및 성장 요건과 함께 단기간에 대규모 단백질 생산을 제공합니다. 그러나, 박테리아 발현 시스템에서 다른 관련 세포 단백질(즉, TIMPs)의 부족으로 인해, 더 높은 농도에서의 활성 MMP는 자가단백질 분해를 통해 분해될 수 있고, 결과적으로 불량한 MMP 수율17을 초래한다.
이 논문은 MMPs2,3,18의 더 높은 수율을 생산하는데 있어서 경제성, 단순성 및 성공으로 인해 대장균을 발현 숙주로 사용하는 재조합 Hisx6-pro-MMP-3cd의 박테리아 발현, 정제 및 활성화를 위한 상세한 방법을 기술한다. 대장균은 재조합 MMP 및 기타 복잡한 단백질에 필요한 단백질 폴딩 기계 및 번역 후 처리가 부족하기 때문에 많은 대장균 균주가 이러한 한계를 극복하도록 설계되어 대장균을 재조합 인간 MMP-3cd,19,20의 발현에 더 적합한 숙주로 만들었습니다. . 예를 들어, 본 연구에 사용된 R2DP 균주는 대장균에서 거의 사용되지 않는 코돈을 함유하는 클로람페니콜 내성 플라스미드를 공급함으로써 진핵 발현을 향상시킨다.
이 프로토콜에 기재된 바와 같이, R2DP 세포에서 pET-3a 벡터 (도 1)로부터 비교적 순수한 봉입체를 과발현시킨 후, Hisx6-pro-MMP-3 촉매 도메인 (MMP-3cd) 단백질이 추출되고 변성된다4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19는 친화성 태그 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 재접힘 및 투석시에, 프로-MMP-3cd (자이모겐)를 4-아미노페닐머큐릭 아세테이트 (APMA)에 의해 활성화시키고, SDS-PAGE 분석은 수율 및 추가 정제의 필요성을 평가하기 위해 사용된다5,21. 이러한 프로토콜은 가용성 MMP-3cd의 발현, 정제 및 활성화를 예로 들어 설명한다. 그러나, 유사한 발현 및 활성화 메카니즘을 갖는 다른 MMPs 및 인간 프로테아제의 발현을 위한 가이드로서 또한 사용될 수 있다(도 2). MMP-3cd 이외의 다른 단백질의 경우, 독자는 이 프로토콜을 시도하기 전에 그들의 표적 단백질에 대한 최적의 완충액 조성물 및 방법을 결정하는 것이 권고된다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig01.jpg"> 도 1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 플라스미드의 플라스미드 맵. pET-3a 벡터는 암피실린 내성 유전자를 포함한다. N 말단 Hisx6-태그 서열은 프로-MMP-3cd를 포함하는 pET-3a 기반 벡터 내로 클로닝되어, BamHI 및 NdeI 제한 부위 사이의 T7 프로모터의 제어 하에 pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 구축물을 수득한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig02.jpg"> 도 2: 프로-MMP-3cd의 박테리아 발현, 정제, 리폴딩 및 활성화. 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd 플라스미드를 BL21(DE3) 또는 R2DP 세포로 형질전환시켰다. 1.2: 프로-MMP-3cd 단백질 발현은 IPTG를 사용하여 유도하였다. 1.3 : 화학적 용해 및 초음파 처리는 주로 불용성이며 봉입체에서 발견되는 Hisx6-pro-MMP-3cd 단백질을 추출하는 데 사용됩니다. 우레아는 봉입체로부터 단백질을 변성시키고 가용화하는데 사용되었다. 2.1. 변성된 Hisx6-pro-MMP-3cd 단백질을 친화성 크로마토그래피 정제를 통해 정제하였다. 3. 용출된 Hisx6-pro-MMP-3cd를 완충제로부터 요소들의 점진적인 제거를 통해 투석 동안 천천히 재접었다. 4. 마지막으로, 재접힌 MMP-3cd 단백질은 N 말단 프로펩타이드 도메인을 제거함으로써 APMA를 사용하여 활성화시켰다. APMA는 나중에 탈염을 통해 용액에서 제거됩니다. 숫자는 이러한 단계를 설명하는 프로토콜 섹션에 해당합니다. 약어: MMP-3cd = 매트릭스 메탈로프로테이나제-3 촉매 도메인; APMA = 4-아미노페닐머큐릭 아세테이트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>0.22 & 마이크로; m 멸균 필터</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLGP033RS</td><td>정제 전에 단백질 추출물에서 일부 오염 물질을 제거하고 Ni-NTA 컬럼이 막히는 것을 방지하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>1L 삼각 플라스크</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S76106F</td><td>n/a</td></tr><tr><td>1L 유리병</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>06-414-1D</td><td>n/a</td></tr><tr><td>1.5mL 마이크로퓨지 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-002</td><td>해당 없음</td></tr><tr><td>15 mL 코니컬 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>n/a</td></tr><tr><td>18 G, 1-in. beveled needle</td><td>Amazon</td><td>B07S7VBHM2</td><td>투석 케이스</td></tr><tr><td>2 mL 탈염 컬럼</td>과 함께 사용 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89890</td><td>활성화 후 APMA 제거</td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAA1610422</td><td>n/a</td></tr><tr><td>250mL 원뿔형 병 쿠션</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-538-53A</td><td>대용량 원심분리 시 원뿔형 병 안정화</td></tr><tr><td>250mL 원뿔형 병</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-538-53</td><td>n/a</td></tr><tr><td>400mL 교반 셀</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UFSC40001</td><td>원심 필터 장치보다 훨씬 더 많은 부피를 다시 농축합니다. Rosetta2(DE3)pLysS 세포는 원심 필터 장치</td></tr><tr><td>4-아미노페닐머큐어 아세테이트(APMA)</td>의 15mL 한도를 초과할 수 있는 단백질을 대량으로 생성합니다. <td>Sigma Aldrich</td><td>A9563-5G</td><td>프로펩타이드 5mL 주사기를 절단하여 MMP-3 활성화</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0829167</td><td>투석 케이스</td></tr><tr><td>50mL 코니컬 튜브</td>와 함께 사용 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>다양한 정제 단계에서 보관에 사용</td></tr><tr><td>50mL 재농축 튜브</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UFC901024D</td><td>투석 후 단백질 시료를 재농축하거나 오염 물질을 제거하는 데 사용</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td>냉각 시 오토클레이브 LB 매체를 응고시키는 완충액</td></tr><tr><td>성분 Ampicillin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td>pET3a 벡터와 함께 사용되는 항생제; 100 &micro에서 사용; g/mL in LB media</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td>pET3a 벡터와 함께 사용되는 제한 효소</td></tr><tr><td>염화칼슘(CaCl2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>600-30-23</td><td>칼슘 이온은 MMP 구조를 안정화합니다</td></tr><tr><td>세포 스프레더</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-189-7544</td><td>형질전환 후 페트리 접시를 가로질러 세포를 퍼뜨리는 데 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-055-125GM</td><td>pET3a 벡터와 함께 사용되는 항생제; 34 &micro에서 사용; LB 매체</td></tr><tr><td>투석 완충액 1</td><td>n / a</td> n <td>/ a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &micro; M ZnCl2, 4M 요소.</td></tr><tr><td>투석 버퍼 2</td><td>n / a</td> n <td>/ a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &micro; M ZnCl2, 2M 요소.</td></tr><tr><td>투석 버퍼 3</td><td>n / a</td> n <td>/ a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &micro; M ZnCl2입니다.</td></tr><tr><td>투석 클립</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>68011</td><td>뱀 피부 투석 튜빙과 함께 사용</td></tr><tr>투석<td>튜빙</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88243</td><td>훨씬 더 많은 시료를 보유하지만 샘플 손실 위험이 더 높은 대체 투석 방법</td></tr><tr><td>분해 버퍼</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>pET3a 벡터</td></tr><tr><td>일회용 큐벳</td> 분해에 사용되는 버퍼 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-200-257</td><td>성장 및 발현 중 박테리아 배양 OD를 측정하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D107125G</td><td>이황화 결합을 줄여 단백질 변성 지원</td></tr><tr><td>DNA 어셈블리 믹스</td><td>NEB</td><td>E2621S</td><td>Hisx6-pro-MMP-3cd PCR 산물 및 분해된 pET3a 벡터</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>를 접합하는 데 사용됨나중에 단백질 정제에 영향을 미칠 수 있는 바람직하지 않은 DNA 오염 물질을 분해하기 위한 엔도뉴클레아제</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A995-4</td><td>n/a</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J15694-AE</td><td>변성에 사용됩니다. 이황화 결합의 산화 및 후속 형성을 방지합니다</td></tr><tr><td>겔 회수 키트</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>아가로스 겔에서 DNA를 분리 및 정제합니다</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td>-80 &deg에서 동결된 글리세롤 스톡을 만드는 데 사용됩니다. C</td></tr><tr><td>중력 플로우 컬럼</td><td>BioRad</td><td>7321010</td><td>재조합 His-태그 단백질의 Ni-NTA 정제에 사용됨</td></tr><tr><td>고형질전환 효율 셀</td><td>NEB</td><td>C2987</td><td>N-말단 His-태그를 pET3a-pro-MMP-3cd 구조로 클로닝할 수 있는 성공 가능성이 더 높은 고형질전환 효율 셀</td></tr><tr><td>HT 용리 버퍼</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM 트리스 -HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M 요소, 250 mM 이미다졸. pH를 7.4</td></tr><tr><td>HT 평형 버퍼</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM NaCl, 6M 요소로 조정합니다. pH를 7.4</td></tr><tr><td>HT 재생 완충액</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM MES, 0.1 M NaCl로 조정합니다. pH를 5.0</td></tr><tr><td>HT 세척 버퍼</td><td>n/a</td> n<td>/a</td><td>20mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM NaCl, 6M 요소, 25mM 이미다졸로 조정합니다. pH를 7.4로 조정</td></tr><tr><td>염산(HCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A144C-212</td> 이미다졸 <td>pH 완충에 사용</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAA1022122</td>는 <td>히스티딘 측기를 모방합니다. 그의 태그가 지정된 표적 단백질</td></tr><tr><td>포함 바디 버퍼</td><td>n/a</td> n<td>/a</td><td>20mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 100mM NaCl, 5mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5M 요소에서 비특이적으로 결합 단백질을 분리하는 데 사용됩니다. pH를 8.0</td></tr><tr><td>Isopropyl-&szlig;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>로 조정<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERR0392</td><td>pET3a에서 표적 유전자 발현을 유도하는 시약입니다. 0.5 mL 1 M 분취액을 만들고, 필터는 멸균 및 -20 °C에서 보관합니다. C</td></tr><tr><td>LB Amp CamR 미디어</td><td>해당 없음</td><td></td><td>1L 병 또는 1L 플라스크에 붓습니다. 1L의 경우 LB 육수 25g을 추가합니다. 오토클레이빙으로 살균하십시오. 일단 50 &deg 이하로 냉각되면; C, 100 &micro에 암피실린을 추가하십시오. g/mL 및 클로람페니콜을 34 &마이크로로; g/mL</td></tr><tr><td>LB Amp CamR 플레이트</td><td>n/a</td> 해당 <td>없음</td><td>멸균 페트리 접시에 붓습니다. 페트리 접시 뚜껑이 완전히 덮일 때까지 붓습니다. 1L의 매체는 40-60개의 플레이트를 생성합니다. 1L: LB 육수 25g, 한천 16g. 오토클레이빙으로 살균하십시오. 일단 50 &deg 이하로 냉각되면; C, 100 &micro에 암피실린을 추가하십시오. g/mL 및 클로람페니콜을 34 &마이크로로; g/mL</td></tr><tr><td>LB 육수</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>트립톤, 효모 추출물 및 염화나트륨과 사전 혼합</td></tr><tr><td>용해 버퍼</td><td>n/a</td> n<td>/a</td><td>50mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 100mM NaCl, 0.133g/mL 라이소자임, 0.49% v/v Triton X-100. pH를 8.0으로 조정</td></tr>하십시오.<tr><td>라이소자임</td><td>MP Biomedicals</td><td>195303</td><td>단백질 추출에 사용됩니다. 박테리아 세포벽을 용해하는 효소</td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>Promega</td><td>A1330</td> 성공할 경우, pET3a 벡터 Ni-NTA 수지와 함께 사용할 형질전환체 NdeI NEB R0111S Restriction enzyme에서 <td>pET3a-pro-MMP-3cd 구조체</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>를</td></tr> 추출합니다 <tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI88221</td><td>재조합 his 태그가 지정된 단백질을 결합하는 데 사용됩니다. 이러한 강력한 상호 작용은 MMP 응집을 방지하기 위해 더 높은 농도의 이미다졸</td></tr><tr><td>비이온 계면활성제</td><td>인 Thermo Fisher Scientific</td><td>PI28316</td> Storage detergent로 대체될 수 있습니다<td>. 촉매 활성을 방해하지 않고 MMP 표면의 소수성 잔류물과 물 분자 간의 상호 작용을 최소화합니다.</td></tr><tr><td>PCR mix</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>PET-3a-pro-MMP-3cd 벡터 pET 플라스미드에 N-말단 his-tag를 삽입하기 위한 PCR 시약</td></tr><tr><td></td><td>Addgene n</td><td>/a</td><td>pET3a 벡터는 암피실린 저항성, 표적 유전자의 유도성 발현 및 T7 프라이머로 염기서열분석을 제공합니다</td></tr><tr><td>Petri dish VWR</td><td></td><td>25384-342</td> LB 한천 배지 R2DP 세포 Novagen<td>에 형질전환체를 도금하는 데 사용됩니다</td></tr>.<tr><td></td><td></td><td>714033</td><td>진핵 단백질의 발현이 향상된 BL21 유도체. 대장균에서 희귀한 것으로 밝혀진 코돈의 tRNA 함유</td></tr><tr><td>SOC 성장 배지</td><td>NEB</td><td>B9020S</td><td>형질전환 중 빠른 성장을 위한 비선택적 성장 배지</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>완충액에 사용되며 단백질 안정성에 도움</td></tr><tr><td>데옥시콜산나트륨</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI89905</td><td>단백질 추출에 사용되는 세제. 용해 세포</td></tr>벽 <tr><td>가용화 완충액</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. pH를 8.0</td></tr><tr><td>Tris base</td>로 조정 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>생리학적 pH 범위에서 사용되는 공통 완충액. 세포</td></tr><tr><td>용해에 사용되는</td>온도에 민감한<td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M1122980101</td></tr><tr><td>세제 요소 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ75826A7</td><td>단백질 2차 구조 파괴를 위한 최초의 카오트로픽제</td></tr>인 <tr><td>염화아연(ZnCl2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAA162810E</td><td>MMP 구조를 안정화합니다. 아연 이온은 MMP-3의 촉매 부위에서 발견</td></tr></tbody></table>됩니다.

박테리아 발현 및 친화성 크로마토그래피를 이용한 인간 매트릭스 메탈로프로테이나제-3의 정제

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

매트릭스 메탈로프로테이나제(MMPs)는 세포외 매트릭스(ECM) 분해 및 리모델링에서 중심적인 역할을 하는 메친신 프로테아제 패밀리에 속하며, 여러 성장 인자 및 사이토카인과의 상호작용에 속한다. 특정 MMPs의 과발현은 암, 신경 퇴행성 질환 및 심혈관 질환과 같은 여러 질병에 책임이 있다. MMPs는 MMP 과발현과 상관관계가 있는 질환을 치료할 수 있는 치료제를 개발하기 위한 표적으로서 최근 주목의 중심이 되고 있다.
용액 중의 MMP 메카니즘을 연구하기 위해, 활성, 가용성 MMPs의 생산을 위해 보다 용이하고 강력한 재조합 단백질 발현 및 정제 방법이 필요하다. 그러나, 대부분의 MMPs의 촉매 도메인은 번역 후 기계의 부족으로 인해 가용성 형태로 에스케리치아 콜라 이 (E. coli)에서 발현될 수 없는 반면, 포유동물 발현 시스템은 일반적으로 비용이 많이 들고 수율이 낮다. MMP 봉입체는 광범위한 정제 및 재폴딩의 지루하고 힘든 과정을 거쳐야하며, 천연 입체 형태에서 MMP의 수율을 현저하게 감소시켜야합니다. 이 논문은 로제타2(DE3)pLysS(이하 R2DP로 지칭됨) 세포를 사용하여 매트릭스 메탈로프로테이나제-3 촉매 도메인(MMP-3cd)을 생산하는 프로토콜을 제시하며, 이는 친화성 정제에 사용하기 위한 N 말단 His-태그에 이어 프로도메인(Hisx6-pro-MMP-3cd)을 함유한다. R2DP 세포는 박테리아 발현 시스템에서 일반적으로 희귀한 코돈을 함유하는 클로람페니콜 내성 플라스미드를 통해 진핵 단백질의 발현을 향상시킨다. 재조합 단백질 발현을 위해 선택된 전통적인 세포주 BL21(DE3)과 비교하여, 이 새로운 균주를 이용한 정제는 정제된 Hisx6-pro-MMP-3cd의 수율을 향상시켰다. 활성화 및 탈염시, 프로 도메인은 N 말단 His-태그와 함께 절단되어, 무수한 시험관내 적용에서 즉시 사용하기 위한 활성 MMP-3cd를 제공한다. 이 방법은 고가의 장비나 복잡한 융합 단백질을 필요로 하지 않으며, 박테리아에서 재조합 인간 MMPs의 신속한 생산을 기술한다.

SDS-PAGE에서 샘플을 실행할 때, 단백질이 불용성 봉입체의 형태로 발현되기 때문에, 용해 및 초음파 처리된 분획은 단백질이 아직 요소에서 재용해되지 않았기 때문에 Hisx6-pro-MMP-3cd 추출물을 거의 또는 전혀 함유하지 않아야 한다. 도 3 은 BL21(DE3) 세포 및 R2DP 세포로부터의 Hisx6-pro-MMP-3cd의 His-태그 정제 용출 분획을 비교한다. 용출 분획은 투석 전에 BL21(DE3) 및 R2DP 세포 둘 다에 대해 개별적으로 풀링되었다. 각 단계로부터의 분획은 단백질이 탈염된 후에 실행되었다(도 4). 모든 Hisx6-pro-MMP-3cd 샘플은 대략 30 kDa에서 밴드를 표시하고, 활성 MMP-3cd는 His-태그 및 프로 도메인의 제거시 대략 20 kDa에서 밴드를 표시한다(도 4 및 보충 도 S1...

그의 태그 정제, 투석 및 활성화는 박테리아에서 가용성, 활성 매트릭스 메탈로프로테이나제-3 촉매 도메인 단백질 발현의 수율을 증가시키기 위해 사용된다. 단백질 분획은 SDS-PAGE 겔을 통해 분석된다.

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

이러한 상세한 프로토콜은 다른 MMP 치료 표적에 적용될 수 있는 E.Coli에서 재조합 MMP-3 촉매 도메인에 대한 박테리아 발현의 매우 효율적이고 비용 효율적인 방법을 기술한다. E.coli에는 복잡한 단백질 폴딩 및 번역 후 처리 시스템이 부족합니다. 이 방법은 E.coli에서 진핵 단백질 발현을 향상시키기 위해 R2DP 세포 균주를 사용한다.특정 MMP의 과잉 생산은 암, 심장 혈관 및 신경 퇴행성 질환과 같은 여러 질병을 유발합니다. 활성 가용성 MMPs는 MMP 억제 치료제의 개발을 위해 필요하다. LB 암피실린 클로람페니콜 내성 플레이트로부터의 pET His-tag 프로MMP-3 촉매 도메인 형질전환체의 단일 단리된 콜로니를 섭씨 37도에서 LB 암피실린 클로람페니콜 내성 매질의 5밀리리터에 접종한다.각 배양물에서 분취량을 저장하고 40 % 글리세롤 주식을 준비하십시오. 밤새 배양한 LB 암피실린 클로람페니콜 내성 배지 500 밀리리터를 함유하는 1리터 플라스크에 600 나노미터에서 0.05 내지 0.1의 광학 밀도로 접종한다. 여러 시점에서 600 나노 미터의 광학 밀도를 측정하십시오 (일반적으로 0.4와 0.6 사이가 될 때까지 3 ~ 4 시간 동안).하나의 몰 IPTG 스톡으로 배양물을 하나의 밀리몰의 최종 농도로 유도하였다. 추가로 37도 진탕기에서 추가로 서너 시간 동안 인큐베이션한다. 세포를 섭씨 13, 000 G 및 4도에서 250 밀리리터 원뿔형 병에서 10분 동안 원심분리하고, 배양물이 완전히 펠릿화될 때까지 반복한다.펠릿 그램 당 세 밀리리터의 용해 버퍼를 추가하고 볼텍스 또는 피펫팅으로 펠렛을 재현탁하십시오. 배양 1 리터 당 10 부피 % 중량의 1.25 밀리리터의 데옥시콜레이트 나트륨을 첨가하십시오. 배양 1 리터 당 10 마이크로 리터의 DNase I을 첨가하십시오.실온에서 150 RPM으로 30분 동안 진탕한다. 섭씨 13, 000 G 및 네 도에서 10분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.펠렛을 봉입체 버퍼의 리터 당 100 밀리리터의 배양물에 재현탁하여 위아래로 피펫팅합니다. 과열을 방지하기 위해 초음파 처리 중에 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 각 샘플을 15초의 여섯 사이클, 5개의 출력과 50%펄스 동안 초음파 처리하십시오.샘플을 섭씨 13, 000 G 및 네 도에서 10분 동안 원심분리한다. 펠릿을 확인하십시오. 펠렛이 컴팩트하면 상층액을 버리십시오.한 리터 배양물과 다섯 밀리리터의 가용화 완충액으로부터 각 펠렛을 재현탁시킨다. 단백질이 가용화될 수 있도록 얼음 위에서 적어도 30분 동안 인큐베이션한다. 세포를 섭씨 4도에서 13, 000배 G에서 10분 동안 원심분리한다.원심분리 후 펠렛이 형성되면 상층액을 별도의 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 붓습니다. 펠렛을 위아래로 피펫팅하여 배양 한 리터당 다른 다섯 밀리리터의 가용화 완충액에 재현탁시킨다. 섭씨 13, 000 G 및 네 도에서 10분 동안 원심분리한다.다음으로, 상청액을 당깁니다. 펠릿을 버리거나 추가 초음파 처리를 위해 영하 80도에 보관하십시오. HT 세척 완충액에 대해 블랭크하고, 첫 번째 세척 분획의 A280을 기록한다.A280이 기준선에 가까워질 때까지 다른 분수와 함께 반복합니다. 즉시 HT 용출 완충액 다섯 밀리리터를 추가하여 His-tagged 단백질을 용출시킵니다. HT 용출로 표지된 마이크로퍼지 튜브에서 0.5 내지 하나의 밀리리터 분획에서 유동을 수집한다.용출 분획의 A280을 측정한다. A280이 밀리리터 당 0.3 밀리그램보다 큰 경우, HT 평형 완충액으로 분획을 희석하십시오. 용출된 MMP 분획을 투석 튜브 중 한 리터의 투석 완충액에 잠기고 튜브 및 그의 내용물을 네 °C에서 적어도 여덟 시간 동안 자기 교반 하에 교반한다.투석 완충액 두 리터 한 리터로 옮기고 튜브와 그 내용물을 섭씨 네 도에서 적어도 여덟 시간 동안 자석 교반으로 저어줍니다. 다음으로, 투석 버퍼 세 리터 한 리터로 옮기고 튜브와 그 내용물을 섭씨 네 도에서 여덟 시간 이상 자석 교반 위에 저어줍니다. 샘플을 적절한 용기로 옮기고 다이얼링된 MMP로 라벨을 붙인다.튜브에 침전물이 있는지 검사하십시오. 밀리리터 MMP 당 한 밀리그램의 밀리리터 분취량 당 20 밀리몰 APMA의 50 마이크로리터를 추가하여 한 밀리몰의 최종 APMA 농도에 도달합니다. 침전물이 형성되면, 섭씨 네 도에서 10분 동안 최대 속도로 원심분리한다.상청액을 활성화된 MMP로 표지된 1.5 밀리리터 마이크로퍼지 튜브에 보관한다. 침전물을 APMA 폐기물로 표시된 용기에 버리십시오. SDS-PAGE는 R2DP 세포에서 BL21 DE3 세포로부터의 His-tag 프로MMP-3 촉매 도메인의 His-tag 정제 용출 분획을 비교하기 위해 실행되었다.His-태깅된 MMP 촉매 도메인 및 BL21 DE3 세포의 처음 여덟 개의 용출 분획은 R2DP 세포에서 His-태깅된 MMP 촉매 도메인 내의 것보다 더 적은 단백질을 나타냈다. MMP3 CD 및 R2DP 세포의 유도, 재접힘, 농축, 활성화 및 탈염된 분획이 도시되어 있다. 활성화시, 활성화된 MMP-3 CD 밴드의 분자량은 약 20 킬로달톤이며, 이는 약 30 킬로달톤으로 남아있는 His-태깅된 효소원과 대조적이다.세포 용해물을 원심분리할 때, 펠릿은 콤팩트하지 않을 수 있다. 그런 일이 발생하면 초음파 처리를하고 원심 분리기를 더 오래 수행하십시오. 단백질을 재농축 할 때 침전이 발생할 수 있습니다.가용화 완충액에 녹이고 과정을 반복하십시오. 본원에 기재된 절차는 MMP 효소 활성의 분자 메카니즘을 이해하는데 결국 사용될 수 있는 활성 인간 MMP의 가용성 발현을 위한 상세한 방법을 제공한다. FPLC와 같은 대체 단백질 정제 방법은 MMP 단백질 정제를 수행할 수 있다.

bacterial-expression-purification-human-matrix-metalloproteinase-3

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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