In Vivo Inhibition, Immunofluorescence 및 Flow Cytometry를 이용한 정자 세포 내 Kinesin-7 CENP-E의 기능 평가

감수 분열은 진핵 생물에서 진화 적으로 보존 된 사건으로, 배우자 형성과 유성 생식에 필수적입니다. 우리의 프로토콜은 감수 분열 및 정자 형성 연구를 위한 효과적인 방법을 제공합니다. 우리는 정자 세포 분석을 위한 일련의 프로토콜을 설명했습니다.

이 기술은 정자 세포의 감수 분열 방추체, 상동 염색체 및 세포 내 소기관의 관찰에 적용할 수 있습니다. 이 방법은 감수 분열 분석, 유전자 편집 동물 모델의 생성 및 조직 또는 기관에서의 유전자 형질 감염에 사용할 수 있습니다. 실험자는 복부 수술 중 무균 환경을 유지하고 이 프로토콜의 온도, 시간 및 주요 실험 조건에 주의를 기울여야 합니다.

절차를 시연하는 것은 내 연구실의 대학원생 인 Meng-Fei Xu 양이 될 것입니다. 마취된 마우스 팔다리를 묶고 왁스 트레이에 고정하여 GSK923295 매개 중심체 단백질 E 또는 CENP-E 억제 마우스 모델의 구성을 시작합니다. 수술 부위를 소독 한 후 멸균 메스를 사용하여 마우스의 복강에 5 밀리미터의 구멍을 뚫고 멸균 수술 용 클램프를 피부에 놓습니다.

그런 다음 멸균 해부 집게로 부고환 지방 패드를 당겨 멸균 핀셋을 사용하여 고환을 찾습니다. 입체경 아래에서 멸균 겸자로 고환을 고정한 후 10 마이크로 리터의 리오드를 사용하여 10 마이크로 리터의 GSK923295 10 마이크로 몰의 최종 농도로 정세관에 천천히 주입합니다. 완료되면 고환을 복강 안으로 다시 밀어 넣고 텍스트 원고에 설명 된대로 수술 부위를 봉합합니다.

수집된 마우스 고환의 기울기 탈수를 위해, 원고에 설명된 대로 다양한 배지에서 샘플을 순차적으로 배양합니다. 연속 배양 후 조직을 임베딩 상자 바닥에 놓고 녹인 파라핀을 상자에 넣습니다. 파라핀의 완전한 응고를 위해 샘플을 섭씨 4도에서 6시간 동안 냉각합니다.

나중에, 샘플과 나이프 표면 사이의 각도를 5-10도에서 유지하면서 울트라 마이크로톰의 홀더에 샘플을 고정합니다. 슬라이스 두께를 5마이크로미터로 조정하여 울트라 마이크로톰을 사용하여 5마이크로미터 두께의 절편을 준비한다. 준비가 끝나면 샘플 슬라이드를 섭씨 40도의 수조에 펴고 슬라이드 건조기에서 섭씨 37도에서 12시간 동안 섹션을 건조시킵니다.

12시간 후, 앞서 설명한 대로 슬라이드의 순차적 인큐베이션을 수행한다. 다음으로, 슬라이드를 증류수로 5분 동안 헹구고, 실온에서 6분 동안 Mayer's Hematoxylin Solution으로 염색하였다. 그런 다음 염색 된 슬라이드를 흐르는 물에 5 분 동안 헹구고 증류수로 2 분 동안 배양합니다.

슬라이드를 1% 에탄올 염산염에 3초 동안 배양한 다음 2분 동안 물을 헹구고 흐르게 합니다. 1%에오신으로 샘플을 15초 동안 염색한 후 연속 배양합니다. 완료되면 15마이크로리터의 중성 껌과 24 x 50mm 커버슬립을 사용하여 슬라이드를 밀봉합니다.

면역형광의 경우 슬라이드를 항원 회수 용액에 넣고 압력솥에서 4분 동안 고압으로 끓여 항원 회수를 합니다. 그런 다음 슬라이드를 실온으로 자연 냉각한 후 증류수로 5분, PBS로 5분 동안 두 번 헹굽니다. 세포를 투과시키기 위해, 슬라이드를 PBS 중의 0.25% 트리톤 X-100 500 마이크로리터에서 10분 동안 배양한 다음, 슬라이드를 PBS로 5분 동안 3회 헹구었다.

항원 차단을 위해 섭씨 4도에서 16시간 동안 PBST에서 300마이크로리터의 3% 소 혈청 알부민 또는 BSA와 함께 샘플을 배양하고 3% BSA의 1차 항체와 함께 배양합니다. 배양 후 슬라이드를 가습 상자에 넣어 조직이 건조되지 않도록 합니다. 슬라이드를 실온에서 30분 동안 자연 재가열합니다.

1차 항체를 버리고, 슬라이드를 PBST로 5분 동안 3회 헹구었다. 2차 항체를 3% BSA 및 PBST로 희석합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 1-2 시간 동안 희석 된 2 차 항체로 샘플을 배양합니다.

샘플을 PBST에서 5분 동안 5회 헹구고, 실온에서 5분 동안 50 마이크로리터 DAPI로 핵을 염색한다. 페이드 방지 장착 매체로 커버 슬립을 장착하고 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다. 유세포 분석을 위해 6cm 페트리 접시에 마우스 고환을 수집하고 수술 용 가위를 사용하여 고환을 1 입방 밀리미터 조각으로 자릅니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 10분 동안 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에서 1밀리리터의 1% 콜라게나제로 고환을 소화합니다. 정자 형성 세포를 침전시키기 위해, 5 분 동안 1, 000 G에서 샘플을 원심 분리하고 37 섭씨 온도에서 20 분 동안 샘플에 0.25 % 트립신 EDTA 용액 1 밀리리터를 추가하기 전에 상청액을 버린다. 나중에, 샘플을 1, 000 G에서 5 분 동안 원심 분리한다.

상층액을 버리고 침전된 세포를 섭씨 4도에서 8시간 이상 70% 저온 에탄올 1밀리리터로 배양합니다. 1, 000 G에서 5 분 동안 원심 분리 한 후, 세포 침전물을 수집하고, 500 마이크로 리터의 프로피듐 요오드화물 또는 PI 염색 용액으로 30 분 동안 섭씨 37 °C에서 정자 형성 세포를 염색한다. 배양 후 300메쉬 스크린을 사용하여 샘플을 여과하여 세포 파편을 제거하고 플로우 튜브에 세포를 수집하여 섭씨 4도에서 세포를 보관합니다.

유세포 분석기를 사용하여 488 나노미터의 여기 파장에서 형광 신호와 광 산란을 검출합니다. ModFit MF LT 32 소프트웨어를 사용하여 시료 및 광 산란의 DNA 함량을 분석합니다. GSK923295의 고환 주사 후, 정자 형성 파동은 CENP-E 억제로 인해 정세관에서 변경되었습니다.

그러나 정세뇨관의 정자 형성 파동은 규칙적이었고 대조군에서 조직화되었습니다. 여러 상동 염색체가 CENP-E 억제 후 적도판에서 정렬되지 않은 것이 관찰되었습니다. 또한, CENP-E 억제는 정세뇨관에서 중기 I 정자 세포의 증가를 유도했습니다.

면역형광 분석은 CENP-E 억제 후 정세뇨관당 항-시냅톤말 복합 단백질 3개 또는 SYCP3 양성 세포의 수가 감소함을 입증했습니다. 반면에, 중기 세포당 SYP3 도트 및 세포당 SYP3 스트레치는 GSK92395 그룹에서 영향을 받지 않았다. 중기 I 정자 세포에서 방추 극의 거리는 CENP-E 억제로 인해 증가했습니다.

대표적인 분석은 CENP-E 억제가 대조군과 비교했을 때 GSK 923295 그룹에서 반수체 세포의 감소를 초래했음을 보여줍니다. 이배체 세포와 이수성 세포의 비율은 CENP-E 억제 후에 유의하게 영향을 받지 않았다. 반대로, 사배체 세포의 비율은 대조군보다 GSK923295군에서 증가하였다.

정자 형성 세포의 투과 전자 현미경 분석은 GSK923295 그룹에서 정자 형성 세포의 파괴된 조직을 나타냈다. 실험자는 복부 수술 및 고환 주사 시 주사 위치, 약물 투여량, 주사 방법 및 봉합 방법에 주의를 기울여야 합니다. 이 기술은 표적 단백질 및 유전자 편집 도구에 초점을 맞춘 생체 내 전기천공과 함께 miotic 분열 및 정자 형성 분야에서 사용할 수 있습니다.