Name: Gryllus bimaculatus의 실험실 문화 유지, 곤충 농업 및 무척추 동물 생리학을위한 다목적 orthopteran 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 배우세요 Gryllus bimaculatus의 표준화된 실험실 사육 방법을 통해 곤충 농업과 무척추 동물 생리학 연구를 진행하세요. 이 기법은 안정적인 번식 시스템 구축과 대체 단백질 연구에 필수적입니다.

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이 프로젝트에 대한 기금은 위스콘신-매디슨 대학 내부 보조금을 통해 가능했습니다. Bachhuber Consulting Inc.의 Kevin Bachhuber가 상업용 크리켓 양육을위한 미공개 가이드에 액세스하고 Michael Bartlett Smith에게 이러한 방법을 개선하고 문제를 해결하는 데 도움을 주신 것에 진심으로 감사드립니다.

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저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

크리켓 양육에 대한이 접근법의 단순성은 다양한 연구 분야에 도움이 될 수 있으며 다양한 실험 요구에 쉽게 적응할 수있는 성공적인 크리켓 축산을위한 일반적인 템플릿을 나타냅니다. G. bimaculatus 에 대한 다른 여러 연구와 비교할 때, 개별 신체 성인 크기는 작고 성숙은 느린14이며, 이는 상황에 의해 우리에게 부과 된 최적이 아닌 양육 온도에 기인합니다. 위에서 설명한 방법은 2 년 동안 사용되고 개선되었습니다. 견고한 문화는 상업적 귀뚜라미 농업에서 때때로 관찰되는 문제의 증거없이 유지되어 왔으며, 고전적인 임상 징후 (예 : Acheta domesticus의 덴소 바이러스로 인한 내부 주류화) 또는 과도한 식인 풍습15을 가진 병원체로부터의 광범위한 사망률을 포함합니다. 식민지 설립 후 크리켓 도입이 부족하여 질병 부담의 가능성이 크게 줄어들었을 가능성이 큽니다.
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상징적 인 곤충 인 초파리 초파리 멜라노 가스터 (Drosophila melanogaster )에 의해 대표되는 바와 같이, 곤충을 실험실 모델 유기체로 사용하면 유전학, 독성학 및 생리학1 연구에 뚜렷한 이점을 제공합니다. 곤충의 크기가 작을수록 배양에 필요한 공간과 필요한 사료 및 소모품 재료의 양이 줄어 듭니다. 많은 곤충들이 빠르게 번식하여 전문화 된 유전 라인의 생성과 여러 세대의 평가가 필요한 연구에 독특하게 적합합니다.
많은 연구가 완전한 변형과 번식을 나타내는 Drosophila와 같은 홀로 대사 곤충에 중점을 둡니다. 그러나 Gryllus bimaculatus (De Geer), 두 개의 반점이있는 필드 크리켓을 포함한 다른 모델을 사용할 수 있습니다. G. bimaculatus 는 성적 성숙에 도달하기 전에 7 ~ 11 개의 님프 인스타를 겪는 paurometabolous 곤충입니다2. 이 크리켓은 stridulation, 영토 전시 및 배우자 보호3을 포함하여 성적 선택과 관련된 광범위한 행동을 보여줍니다. 미성숙 귀뚜라미는 많은 paurometabolous 청소년과 유사하게 ecdysis 동안 손실되고 손상된 팔다리를 재생할 수 있다는 점에서 홀로 대사 성 곤충 종의 유충과다릅니다 4. 또한, G. bimaculatus 의 완전히 서열화 된 게놈은 20215에 발표되었습니다. 이러한 특성으로 인해이 귀뚜라미는 기본 연구의 대상으로 호소력을 발휘합니다.
두 개의 발견 된 들판 귀뚜라미는 인간의 음식과 동물 사료를 위해 널리 사육됩니다. 이러한 작업의 규모는 종종 실험실 연구 6,7보다 훨씬 큽니다. 규모의 차이에도 불구하고, 연구원들이 직면 한 도전은 상업용 크리켓 농부들이 직면 한 도전과 크게 겹칩니다. 이러한 고려 사항은 식용 곤충 생산을 개선하기위한 실험실 기반 연구의 맥락에서 수렴됩니다. 식용 곤충 산업이 계속 진화하고 성장함에 따라 사료 투입량과 생산의 무수한 다른 측면을 최적화하는 것이 주요 목표입니다8. 이 귀뚜라미의 양육 효율성, 생존 또는 생성 시간의 측정 된 개선을 보여주는 실험실 연구는 귀뚜라미 농업 운영의 수익성을 장기적으로 높이는 데 도움이 될 가능성이 있습니다.
표준화 된 양육 프로토콜은 양육 최적화를 조사하는 연구 간의 면밀한 비교를 가능하게합니다. 현재까지 실험실에서 G. bimaculatus를 양육하기위한 심층적 인 프로토콜은 거의 발표되지 않았습니다. 이상적인 프로토콜은 실제 귀뚜라미 농업 운영에서 직면 한 조건을 반영하는 동시에 실험 치료로 인한 성장 성과의 변화를 정확하게 측정하고 위험 완화 전략을 강조하는 데 필요한 엄격하게 통제 된 조건을 유지합니다. 이 논문에 설명 된 방법은 광범위한 실험실 및 상업 생산 규모 2,9,10,11,12에서 다양한 크리켓 종을 양육하는 데 사용되는 공개 된 프로토콜, 기술 및 장치를 기반으로 개발되었습니다. 이러한 방법은 또한 출판되지 않은 기술 게시판 및 북미의 상업용 크리켓 농민과의 개인적인 의사 소통을 포함하여 여러 비 동료 검토 출처에 의해 통보됩니다. 이 프로토콜은 곤충 농업과 관련된 시험에서 사용하기 위해 특별히 G. bimaculatus의 실험실 문화의 확립을 촉진하려는 의도로 개발되었습니다.

<table><tbody><tr><td>31-qt (29.3 L) 스냅 뚜껑 토트빈</td><td>뚜껑 with lid HOMZ</td><td>3430CLBL</td><td>사육 가축을 수용하는 데 사용</td></tr><tr><td>3-tier/12-tray Grow Light Stand</td><td>Fischer Scientific</td><td>NC1938548</td><td></td></tr><tr><td>50-gal (189.27L) 뚜껑이 있는 토트빈</td><td>Sterilite</td><td>#14796603</td><td>귀뚜라미 취급 시 보조 봉쇄로 사용</td></tr><tr><td>50 mL 폴리프로필렌 눈금 실린더</td><td>Fischer Scientific</td><td>S95171</td><td></td></tr><tr><td>7.5-qt (7.1 L) 스냅 뚜껑 토트백 뚜껑</td><td>HOMZ</td><td>3410CLBL</td><td>독점 재고를 보관하는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>Accuris 500 g x 0.01 g Balance</td> 벤치마크 사이언티픽 <td>W3300-500</td><td>의 자회사인 Accuris에서 제조</td><td>Dot Scientific에서 위스콘신 대학교 시스템 구매 서비스 "ShopUW+"를 통해 구입</td></tr>했습니다. <tr><td>Ace Premier 1 인치 플랫 칩 브러시</td><td>Ace 하드웨어&nbsp;</td><td>#1803261</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art SP Scienceware 탈이온수 세척 병</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-421-160&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>밝은 알루미늄 창 스크린&nbsp;</td><td>Phifer</td><td>UNSPSC# 11162108</td><td>메시 크기 18 x 16"</td></tr><tr><td>투명 일회용 플라스틱 부분 컵 5.5 oz 뚜껑 포함</td><td>월마트</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>탈이온수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>디아블로 4-4/8" x 13 TPI 초미세 마감 바이메탈 직소 블레이드</td><td>Home Depot</td><td>#313114935</td><td></td></tr><tr><td>달걀 필러 플랫-종이, 12 x 12"</td><td>Uline</td><td>S-5189</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 투명 뚜껑이 있는 페트리 접시 100 x 15mm</td><td>Fischer Scientific</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 투명 뚜껑이 있는 페트리 접시 60 x 15mm</td><td>Fischer Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Georgia-Pacific Envision Brown Paper Towels</td><td>Home Depot</td><td>#205675843</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Tough Guy 고성능 핫멜트 접착제 스틱</td><td>Infinity Bond</td><td>Infinity IM-Tough-Guy-12</td><td></td></tr><tr><td>Mazuri 크리켓 다이어트</td><td>Land O' Lakes International</td><td>SKU#&nbsp; 3002219-105</td><td></td></tr><tr><td>Stanley TimeIt Twin 2-outlet 접지 기계식 24시간 타이머</td><td>월마트</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vermont Organics 재생 토양 11 lb 코이어 블록</td><td>홈 디포</td><td>#300679904</td><td></td></tr></tbody></table>

gryllus bimaculatus의 실험실 문화 유지, 곤충 농업 및 무척추 동물 생리학을위한 다목적 orthopteran 모델

Maintaining Laboratory Cultures of Gryllus bimaculatus, a Versatile Orthopteran Model for Insect Agriculture and Invertebrate Physiology

Gryllus bimaculatus (De Geer)는 아프리카와 남부 유라시아 전역에 분포하는 대형 바디 크리켓으로 종종 야생 수확을 인간의 음식으로 수확합니다. G. bimaculatus 를 배양하는 것은 식이 가소성, 빠른 생식주기, 휴면 요구 사항 부족, 고밀도 사육에 대한 내성 및 병원균에 대한 견고성으로 인해 실현 가능합니다. 따라서, G. bimaculatus는 곤충 생리학, 행동, 발생학 또는 유전학 연구를위한 다목적 모델이 될 수 있습니다.
스타킹 밀도, 케이지 내 refugia, 광주기, 온도, 상대 습도 및식이 요법과 같은 문화적 매개 변수는 모두 귀뚜라미 성장, 행동 및 유전자 발현에 영향을 미치므로 표준화되어야합니다. 인간 소비를위한 곤충 양식에 관한 급성장하는 문헌에서,이 귀뚜라미는 작물 잔류 물, 식품 가공 부산물 및 기타 저비용 폐기물 흐름에서 파생 된 후보 사료 혼화제를 평가하기 위해 자주 사용됩니다.
가변 사료 기질에 반응하여 G. bimaculatus 성장 성능 및 영양 품질을 평가하는 지속적인 실험을 지원하기 위해 실험실에서 번식, 유지, 취급, 측정 및 안락사를위한 포괄적 인 표준 프로토콜 세트가 개발되어 여기에 제시되었습니다. 업계 표준 크리켓 사료는 귀뚜라미 번식 주식의 장기 유지 및 실험 제어 사료로 사용하기에 영양적으로 적절하고 기능적으로 적합한 것으로 입증되었습니다. 이 귀뚜라미를 12 광 (L) / 12 어두운 (D) 광주기에서 27 ° C의 평균 온도에서 스크린 탑핑 된 29.3 L 폴리에틸렌 케이지에서 0.005 귀뚜라미 / cm3의 밀도로 양육하고, 촉촉한 코코넛 열매는 수화 공급원 및 산란 매체 역할을하여 2 년 동안 건강한 귀뚜라미를 성공적으로 유지했습니다. 이러한 방법에 따라, 통제 된 실험에서 귀뚜라미는 수확시 평균 질량 0.724g 0.190g을 산출했으며, 89 %의 생존률과 스타킹 (22 일)과 수확 (65 일) 사이의 성적 성숙은 68.2 %였습니다.

부화에서 65 일까지 성공적인 크리켓 사육을 보여주는 데이터는 2021 년 9 월 사료 시험 중에 수집되었습니다. 귀뚜라미는 이러한 프로토콜의 1.1.1-2.6.1 단계에 따라 알에서 자랐으며, 6 개의 복제 케이지에는 위의 2.7 단계에 따라 22 일 된 무작위 (세 번째 인스타) 귀뚜라미가 24 개 있습니다. 귀뚜라미는 주변 실내 조건에서 양육되었습니다. 그러나 시설 공기 처리 장치의 오작동으로 인해 평균 실내 온도는 제안 된 27 °C가 아닌 20 % 상대 습도에서 25 ± 1 °C였습니다. 크리켓 질량은 부화 후 22 일에서 65 일 사이에 매주 두 번 측정되었습니다. 이 실험의 결과는 아래에 요약되어 있으며 표준 편차를 더하기 또는 뺀 값으로 표시됩니다.
도 1 및 도 2 에 도시된 데이터는 이 프로토콜에 설명된 표준 사료를 투여한 여섯 개의 복제 케이지를 나타낸...

이 논문은 식용 귀뚜라미, Gryllus bimaculatus의 실험실 배양을 장기간 양육하기위한 밀도, 사료 가용성, 수화 공급원 및 환경 통제와 같은 중요한 요소를 표준화하는 기본 방법을 설명합니다.

Gryllus bimaculatus의 실험실 문화 유지, 곤충 농업 및 무척추 동물 생리학을위한 다목적 orthopteran 모델

Gryllus bimaculatus (De Geer)&#160;is a large-bodied cricket distributed throughout Africa and Southern Eurasia where it is often wild-harvested as human ...

이러한 기술은 동물 사료 및 인간 사료 및 점점 더 중요한 대체 모델 유기체를 위해 양식되는 주요 미니 가축 종 인 Gryllus bimaculatus를 기르기위한 실용적이고 입증 된 방법을 묘사합니다. Gryllus bimaculatus의 문화를위한 이러한 실험실 방법은 북미 크리켓 농업 산업 전반에 걸쳐 공통적 인 기술에서 파생되었으며 귀뚜라미 농업 운영의 실험실 규모의 팩시밀리를 나타냅니다. 시작하려면 깨끗한 용기를 저울에 꽂고 마른 코코넛 열매 덩어리를 인간의 주먹 크기로 측정하십시오.그런 다음 coir를 밀봉 가능한 깨끗한 용기에 넣어 원래 부피의 최대 여섯 배까지 확장 할 수 있습니다. 깨끗한 손으로 더 큰 블록에서 제거 된 조각에서 coir 덩어리를 부드럽게 분해하십시오. 다음으로, 250 밀리리터 눈금 실린더를 사용하여, 탈이온수의 정확한 부피를 측정하여 한 부분 건조 코아에 5 부의 물의 질량 기준으로 다섯 대 일 비율을 달성하고, 측정 된 탈이온수를 천천히 첨가하여 모든 누아 입자를 고르게 수화시킵니다.그 후, 수동으로 덩어리를 침지하여 수화를 보장하고 이전에 계량 된 용기를 다시 덮습니다. 젖은 coir의 75 그램의 무게를 측정하고 깨끗한 플라스틱 숟가락을 사용하여 100 밀리미터 x 15 밀리미터 페트리 접시에 옮겨 coir가 접시 바닥에 고르게 퍼지고 덩어리가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 Petri 접시의 측면에 출생 식민지와 계란 수집 이벤트의 날짜를 나타내는 레이블이있는 실험실 테이프로 레이블을 붙입니다.45 밀리리터의 탈이온수를 점진적 실린더에 넣고 페트리 접시에 포장 된 coir의 표면에 고르게 물을 첨가하여 수분 공급을 보장합니다. 페트리 접시가 포장되면 남은 젖은 열매를 밀폐 용기에 밀봉하여 영하 20도에서 보관하십시오. 수화 된 산란 기질을 가능한 한 사료에서 멀리 떨어진 귀뚜라미의 원하는 부모 주식을 담고있는 케이지에 넣고 날짜와 시간을 문서화하십시오.그런 다음 작업 표면에 작고 오토클레이브 가능한 쓰레기 수거통을 놓습니다. 그런 다음 쓰레기 수거통 옆의 벤치에 깨끗하고 비어있는 29.3 리터의 플라스틱 케이지를 놓습니다. 부모 크리켓 주식과 산란 기질이 들어있는 또 다른 29.3 리터 케이지를 빈 케이지에서 쓰레기 용기의 반대편에 놓습니다.24시간 후, 모 귀뚜라미 케이지로부터 산란 기질을 제거하고, 오토클레이브 가능한 폐기물 용기 위에 위치시킨다. 산란 기질의 꼭대기에서 귀뚜라미가 누룩의 표면에 걷어차 렸을 수도있는 frass 또는 사료 입자가 있는지 검사하십시오. 다음으로, 깨끗한 Scoopula 또는 플라스틱 숟가락으로 폐기물 용기에 coir 오염 물질을 제거하고 플라스틱 숟가락을 폐기물 용기에 넣으십시오.그런 다음 청소 된 산란 기질을 깨끗한 29.3 리터 케이지에 넣으십시오. 그런 다음 케이지를 섭씨 27도에 놓고 상대 습도 60 %에서 12 시간 어둡고 12 시간의 가벼운 광주기로 두십시오. 번식 재고가 들어있는 케이지를 원래 위치로 되돌리고 작업 표면에서 모든 항목을 지우십시오.그런 다음 폐기물 용기를 귀뚜라미 달걀로 잠재적으로 오염 된 물품을 보관하는 시설 내 냉동고에 넣으십시오. 그런 다음 10 % 표백제 용액으로 작업 표면을 소독하고 60 초 동안 그대로 두십시오. 깨끗한 종이 타월로 작업 표면을 닦으십시오.냉동실을 연 후 종이 타월을 폐기물 용기에 버리십시오. 사용하지 않은 30.8 센티미터 x 30.8 센티미터 상업용 계란 카톤 플랫 두 개를 선택하십시오. 그리고 유틸리티 나이프 또는 강한 가위로 이것을 같은 크기의 여섯 개의 분리 된 10.1 센티미터 너비의 스트립으로 자릅니다.그런 다음 손으로 잘린 가장자리를 닦아 매달려있는 판지 입자를 제거하십시오. 다음으로, 6 개의 개별 10.1 센티미터 x 30.8 센티미터 크기의 판지 조각을 케이지 바닥에 수직으로 놓고 카톤의 긴 축이 29.3 리터 케이지의 좁은 수평 축에 걸쳐 있습니다. 일곱 번째 판지 조각을 여섯 개의 직립 조각의 꼭대기에 평평하게 놓습니다.약 25 센티미터 x 25 센티미터의 거친 갈색 종이 타월 세 조각을 선택한 후 각각 반으로 접으십시오. 그런 다음 카톤 구조의 근위 측면의 상단을 덮도록 두 개를 놓고 원위 측의 카톤 스택 위에 하나를 놓습니다. 산란 후 11 일째에 산란 기질을 케이지의 근위 오른쪽 모서리로 옮깁니다.해치가 관찰되면 카톤 상단에 놓인 종이 타월을 젖을 때까지 안개를 낀 채로 물을 적극적으로 흘리지는 않습니다. 그런 다음 70 % 에탄올로 100 밀리미터 페트리 뚜껑의 양면을 철저히 닦아내고 말리십시오. 다음으로, 50 그램의 공급물을 60 와트의 단일 서빙 블렌더에 넣고 10, 000 rpm에서 1 분 동안 분쇄하십시오.사료 한 그램을 측정 한 후 케이지의 Petri 접시 뚜껑에 흔들어 넣으십시오. 숟가락이나 스쿠풀라의 깨끗한 끝을 사용하여 가능한 한 균일하게 사료를 접시 바닥에 퍼뜨립니다. 그런 다음 이틀마다 사료를 교체하십시오.오토클레이브 가능한 폐기물 용기에 오래된 사료를 버리십시오. 피드의 곰팡이 성장을 모니터링합니다. 그리고 사료가 흰색이나 녹색으로 보이기 시작하면 Petri 접시를 버리고 즉시 먹이십시오.산란 후 14 일 동안 2.54 센티미터 페인트 브러시를 사용하여 페트리 접시의 누룩 표면과 측면에서 모든 귀뚜라미를 새장에 닦아 출생 치아 기질에 달라 붙는 귀뚜라미를 제거하십시오. 다음으로, 제거된 산란 기질을 오토클레이빙 가능한 폐기물 용기 내로 넣고, 오토클레이빙될 때까지 냉동실에 보관한다. 그런 다음 출생 기질을 수분 공급을 위해 신선한 coir 접시로 교체하십시오.탈 이온수 세척 병을 사용하여 coir의 표면이 반짝 일 때까지 물을 넣지 만 풀링되지는 않습니다. 귀뚜라미는 평균 질량이 21 밀리그램 인 인구에서 비축되었습니다. 실험이 끝날 때, 모든 결합 된 청소년 및 성인 귀뚜라미의 평균 질량은 0.724 그램이었습니다.생후 65일째에 실험이 끝났을 때 성인 남성 30명이 존재했고, 평균 질량은 0.721그램인 반면, 성인 여성 58명의 경우 평균 질량은 0.841그램이었다. 스타킹과 수확 사이의 생존률은 89 %였으며 매주 모든 케이지에있는 모든 개별 귀뚜라미의 총 수로 측정되었습니다. 65 일째에 모든 귀뚜라미의 약 68 %가 성인 인스타에 도달했습니다.물을 주거나 놓칠 때 인클로저 바닥에 물방울이 생기지 않도록하십시오. refugia 위에 종이 타월을 놓으면 습도 구배가 가능하고 안개로부터 물방울을 흡수합니다. 이 절차는 많은 생명 과학 분야의 연구원들이 Gryllus bimaculatus를 모델 유기체로 뒷받침하는 템플릿 역할을합니다.현재까지 Gryllus bimaculatus 또는 다른 paurometabolous model organism를 기르기위한 공식적인 프로토콜은 거의 발표되지 않았습니다. 곤충 농업에 사용되는 곤충에 대한 사육 방법을 성문화하고 표준화하면 연구 그룹 간의 결과 비교가 더 잘 가능합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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