Name: 세포 대사를 평가하기 위한 자가형광 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 배우세요 NAD(P)H와 FAD 자가형광 이미징을 통해 세포 대사를 비파괴적으로 평가하는 방법을. 이 기술은 신경세포, 암세포, 줄기세포 등 다양한 살아있는 세포에 적용 가능하며 시간 경과 연구에 활용됩니다.

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자금 출처에는 텍사스 암 예방 및 연구소 (CPRIT RP200668)와 텍사스 A & M 대학이 포함됩니다. 그림 1은 BioRender.com 로 작성되었습니다.

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

자가 형광 강도 및 평생 이미징은 세포의 신진 대사를 평가하기 위해 널리 사용되어 왔습니다.21,55. FLIM은 고분해능이므로 단일 세포를 해결하는데, 이는 세포 이질성이 종양 공격성 및 약물 내성에 기여하기 때문에 암 연구에 중요합니다.7,39,41,44,45,46,58. 마찬가지로, 세포 대사의 자가형광 영상은 면역 세포 기능이 세포 대사와 연결되어 있고, 면역 세포 집단이 종종 이질적이기 때문에 면역 세포를...

신진 대사는 에너지를 생산하는 세포 과정입니다. 세포 대사는 글리코 분해, 산화 인산화 및 글루타미노분해를 포함한 여러 경로를 포함합니다. 건강한 세포는 면역 세포에 의한 사이토카인의 생산과 같은 증식 및 기능을위한 에너지를 생성하기 위해 이러한 대사 경로를 사용합니다. 대사 장애, 암 및 신경 변성을 포함한 많은 질병은 변경된 세포 대사를 특징으로합니다1. 예를 들어, 일부 암 세포 유형은 산소의 존재 하에서도 핵산, 단백질 및 지질의 합성을 위한 분자를 생성하기 위해 상승된 당분해 속도를 갖는다2,3. 바르부르크 효과로 알려진 이 현상은 유방암, 폐암, 교모세포종4을 포함한 많은 암 유형의 특징이다. 암 진행과 관련된 세포 대사의 변화로 인해, 세포 대사는 약물 반응에 대한 대리 바이오마커가 될 수 있다5,6. 더욱이, 세포 수준에서 약물 효능을 이해하는 것은 세포 이질성이 개인에서 상이한 약물 반응을 초래할 수 있기 때문에 중요하다7,8.
세포 신진 대사의 변화를 확인하고 정량화하는 기술은 암 및 약물 반응 연구에 필수적입니다. 화학 및 단백질 분석은 세포 또는 조직의 신진 대사를 평가하는 데 사용되지만 단일 세포 해상도 및 공간 정보가 부족합니다. 대사 플레이트 리더 기반 분석은 시간에 따른 샘플의 pH 및 산소 소비와 화학 물질에 의한 후속 대사 교란을 측정 할 수 있습니다. pH는 세포외 산성화 속도(ECAR)를 계산하는데 사용될 수 있으며, 이는 세포의 글리콜 활성에 대한 통찰력을 제공한다9. 2-[불소-18] 플루오로-D-글루코스 양전자 방출 단층 촬영 (FDG PET) 및 자기 공명 분광법 (MRS)을 포함한 전신 영상 방법은 대사 측정을 통해 종양 재발 및 약물 효능을 확인하기 위해 임상적으로 사용되는 비침습적 영상 방식입니다10,11,12,13,14.
FDG-PET는 방사성 표지된 글루코스 유사체인 FDG의 조직 흡수를 이미지화한다. 주변 조직에 비해 종양에 의한 FDG-PET의 흡수 증가는 바르부르크 효과12,13에 기인한다. MRS 이미지는 13C 및 31P와 같은 신진 대사에 사용되는 분자의 일반적인 핵을 이미지화하고 운동이나 식사와 같은 자극에 반응하여 신진 대사가 어떻게 변하는지에 대한 동적 정보를 얻을 수 있습니다14. FDG-PET 및 MRS가 임상적으로 사용될 수 있지만, 이들 기술은 종양내 이질성을 해결하기 위한 공간 분해능이 부족하다. 마찬가지로, 산소 소비량 측정은 세포의 벌크 집단에 대해 이루어진다. 자가 형광 이미징은 이러한 기술의 공간 분해능 장애물을 극복하고 세포 대사를 정량화하는 비침습적 방법을 제공합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63282/63282fig01v2.jpg"> 도 1: 일반적인 대사 경로에서의 NADH 및 FAD. NADH 및 FAD는 당분해, 크렙스 사이클 및 전자 수송 사슬에 사용되는 조효소이다. 이들 분자의 자가형광 이미징은 세포 대사에 대한 정보를 제공한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63282/63282fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
환원된 니코틴아미드 아데닌(phosphate) 디뉴클레오타이드(NAD(P)H) 및 산화된 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD)는 당분해, 산화적 인산화 및 글루타미노분해를 포함하는 대사 반응의 조효소이다(도 1). NAD(P)H 및 FAD는 모두 자기형광성이며 형광 영상1,15에 내인성 대비를 제공합니다. NADPH는 NADH와 유사한 형광 특성을 갖는다. 이 때문에 NAD(P)H는 NADH와 NADPH2,16의 결합 신호를 나타내는 데 자주 사용됩니다.
형광 수명 이미징 (FLIM)은 형광 수명 또는 형광단이 여기된 상태에 있는 시간을 정량화합니다. 형광 수명은 형광단의 미세 환경에 반응하고 세포 대사에 대한 정보를 제공합니다17. NAD(P)H 및 FAD는 단백질 결합 또는 자유 형태에서 세포 내에 존재할 수 있으며, 이들 각각은 상이한 수명을 갖는다. 유리 NAD(P)H는 단백질 결합 NAD(P)H보다 짧은 수명을 갖는다; 반대로, 무료 FAD는 바운드 FAD18,19보다 수명이 길다. 수명 및 수명 성분 가중치는 Eq. (1)20을 통해 형광 수명 감쇠 데이터로부터 정량화될 수 있다:
I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)
Eq(1)은 시간의 함수로서 정규화된 형광 강도를 나타낸다. 이 방정식의 α 1과 α 2는 각각 짧은 수명과 긴 수명(α 1+ α 2=1)의 비례 성분을 나타내고, τ1과 τ2는 각각 짧은 수명과 긴 수명을 나타내며, C는 배경광7,20을 설명합니다. 여기서 τm으로 표현되는 진폭 가중 수명은 Eq. (2)를 사용하여 계산됩니다.
τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)
평균 수명은 형광단의 강도 붕괴에 대한 평균 "t"를 계산함으로써 계산될 수 있으며, 이는 2-지수 붕괴에 대해 Eq. (3)17,21에 의해 도시된다.
τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)
형광 강도 이미지는 형광 수명 붕괴를 통합함으로써 수명 이미지로부터 계산될 수 있다. 자가 형광 이미징은 세포 내 해상도에서 살아있는 세포의 신진 대사를 특성화하는 데 사용할 수있는 비파괴적이고 라벨이없는 방법입니다. 광학 산화 환원 비율은 셀의 화학적 산화 환원 상태에 대한 광학 아날로그 메트릭을 제공하며 NAD (P) H 및 FAD 강도의 비율로 계산됩니다. 광학 산화 환원 비율을 계산하는 공식은 표준화되지 않았지만22,23,24,25, NAD (P) H 및 FAD의 결합 된 강도에 대한 FAD의 강도로 정의됩니다. 이 정의는 분모의 합산 강도가 0과 1 사이의 메트릭을 정규화하고 시안화물 억제의 예상 결과가 산화 환원 비율의 감소이기 때문에 사용됩니다. 유리 NAD(P)H 및 FAD의 형광 수명은 pH, 온도, 산소에 대한 근접성 및 삼투압을 포함한 대사 용매 미세환경의 변화에 대한 통찰력을 제공합니다17.
NAD(P)H 및 FAD의 결합된 분획의 형광 수명의 변화는 대사 경로 이용률 및 기질-특이적 대사26을 나타낼 수 있다. 성분 중량은 조효소18,19의 결합 분획에 대한 자유의 변화에 대해 해석될 수 있다. 전체적으로, 이러한 정량적 자가형광 수명 측정은 세포 대사의 분석을 허용하고, 자가형광 이미징은 정상 조직으로부터 신생물을 확인하는데 사용되어왔다.27,28, 줄기 세포의 특성화29,30, 면역 세포 기능 평가31,32,33,34,35, 신경 활성 측정36, 37,38, 유방암 및 두경부암과 같은 암 유형에서의 약물 효능 이해21,39,40,41,42. 고해상도 자가형광 이미징은 단일 세포 분석 및 집단내 이질성의 정량화를 위한 이미지 세분화와 결합될 수 있다43,44,45,46,47.
NAD(P)H 및 FAD는 강도 또는 수명 이미징을 위해 구성된 단일 광자 또는 다중 광자 형광 현미경으로 이미징할 수 있습니다. 단일 광자 현미경의 경우, NAD(P)H 및 FAD는 일반적으로 이러한 파장에서 일반적인 레이저 소스로 인해 각각 375-405nm 및 488nm의 파장에서 여기됩니다48. 이광자 형광 여기에서, NAD(P)H 및 FAD는 각각 대략 700 내지 750 nm 및 700 내지 900 nm의 파장에서 여기할 것이다(15,49). 일단 형광단이 여기되면, NAD(P)H 및 FAD는 각각 ~410nm에서 ~490nm, ~510nm에서 ~640nm 사이의 파장에서 광자를 방출한다15. NAD(P)H 및 FAD 최대 방출 파장은 각각 약 450nm 및 535nm(48)이다.
그들의 상이한 여기 및 방출 파장 때문에, 두 대사 조효소의 형광은 분광적으로 단리될 수 있다. NAD(P)H 및 FAD의 스펙트럼 특성에 대한 이해는 자가형광 이미징 프로토콜의 설계 및 최적화에 필요합니다. 시안화물은 전자 수송 사슬 (ETC) 착물 IV 억제제이다. 시안화물이 세포 대사에 미치는 영향과 세포 내 NAD(P)H 및 FAD의 자가형광 강도 및 수명은 잘 특성화되어 있습니다27,40. 따라서 시안화물 섭동 실험은 NAD(P)H 및 FAD 이미징 프로토콜을 검증하는 효과적인 수단입니다. 성공적인 시안화물 실험은 NAD(P)H 및 FAD 이미징 프로토콜이 알려지지 않은 그룹이나 교란의 신진대사를 평가하는 데 사용될 수 있다는 확신을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>2-deoxy-d-glucose (2-DG)</td><td>시그마</td><td>AC111980000; AC111980010; AC111980050; </td><td></td>AC111980250</tr><tr><td>항생제, 항균제(펜-스트렙),</td> <td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>세포 샘플,</td><td>미국형 배양 컬렉션</td>, <td>해당 없음</td>, <td>MCF-7 암 라인</td></tr><tr><td>, CellProfiler</td><td>, Broad Institute</td>, <td>해당 없음,</td><td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr>, <tr><td>원뿔형 튜브</td>, <td>VWR</td><td>89039-664</td>, <td>15 mL 원뿔형 튜브</td></tr>, <tr><td>DMEM</td>, <td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>배양 매체</td></tr><tr><td>FAD 이색성 거울</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td>495 nm</td></tr><tr><td>FAD 방출 필터</td><td>Semrock</td><td>FF01-550/88-25</td><td>550/88 nm</td></tr><tr><td>FAD 여기 필터</td><td>Semrock</td><td>FF01-458/64-25</td><td>458/64 nm</td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>16000036</td><td></td></tr><tr><td>형광 수명 현미경</td><td>3i</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>다광자 레이저</td><td>간섭성</td><td>N/A</td><td>2P 간섭성 레이저, 조정 가능한 680 nm-1080 nm</td></tr><tr><td>NAD(P)H 이색성 거울</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03-25x36</td><td>409 nm</td></tr><tr><td>NAD(P)H 방출 필터</td><td>Semrock</td><td>FF02-447/60-25</td><td>447/60 nm</td></tr><tr><td>NAD(P)H 여기 필터</td><td>Semrock</td><td>FF01-357/44-25</td><td>357/44 nm</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>시안화칼</td>륨 <td>시그마-알드리치</td><td>380970</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드북 6</td><td>3i</td><td>N/A</td><td>이미지 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>SPCImage</td><td>Becker & Hickl GmbH</td><td>N/A</td><td>형광 수명 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>스테이지 탑 인큐베이터</td><td>okoLab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Biosciences</td><td>786-262</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>YG beads</td><td>Polysciences</td><td>19096-2</td><td>Yg 마이크로스피어 (20.0 &micro; m)</td></tr></tbody></table>

세포 대사를 평가하기 위한 자가형광 이미징

Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

세포 대사는 세포가 에너지를 생성하는 과정이며, 암을 포함한 많은 질병은 비정상적인 신진 대사를 특징으로합니다. 환원된 니코틴아미드 아데닌(포스페이트) 디뉴클레오타이드(NAD(P)H) 및 산화된 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD)는 대사 반응의 조효소이다. NAD(P)H 및 FAD는 자가형광을 나타내며 여기 및 방출 파장에 의해 분광적으로 분리될 수 있다. 조효소인 NAD(P)H 및 FAD는 모두 유리 또는 단백질 결합 구성으로 존재할 수 있으며, 이들 각각은 형광단이 여기된 상태로 유지되는 시간인 뚜렷한 형광 수명을 갖는다. 형광 수명 이미징 (FLIM)은 세포 대사의 라벨없는 분석을 위해 NAD (P) H 및 FAD의 형광 강도와 수명을 정량화 할 수 있습니다. 형광 강도 및 수명 현미경은 적절한 여기 및 방출 파장을 선택하여 NAD(P)H 및 FAD 이미징에 최적화할 수 있습니다. 시안화물에 의한 대사 교란은 세포 내의 대사 변화를 검출하기 위해 자기 형광 이미징 프로토콜을 검증합니다. 이 기사에서는 세포 신진 대사를 측정하기위한 NAD (P) H 및 FAD의 자기 형광 이미징 기술을 시연합니다.

상피 유방암 세포주인 MCF-7을 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 형광 이미징을 위해, 세포를 이미징 48 h 전에 35 mm 유리 바닥 이미징 디쉬 당 4 × 105 세포의 밀도로 시딩하였다. 세포를 상기 언급된 프로토콜을 사용하여 시안화물 처리 전후에 이미지화하였다. 시안화물 실험의 목표는 NAD(P)H 및 FAD 형광의 스펙트럼 분리를 확인하고 세포의 대사 변화를 검출하기 위한 이미징 시스템 및 분석 프로토콜을 검증하는 것입니다. 쌍을 이룬 NAD(P)H 및 FAD 형광 수명 이미지는 시안화물 이전의 다섯 개의 상이한 위치와 시안화물을 배지에 첨가한 후 다섯 개의 상이한 위치에서 촬영되었다. 형광 수명 파라미터(광학 산화환원 비, NAD(P)H α 1, NAD(P)H τ1, NAD(P)H τ2, NAD(P)H τm, FAD τ1, FAD τ2, FAD α 1, FAD τ1<...

이 프로토콜은 내인성 대사 조효소, 환원된 니코틴아미드 아데닌(인산염) 디뉴클레오타이드(NAD(P)H) 및 산화된 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD)의 형광 이미징 및 분석을 기술한다. NAD(P)H 및 FAD의 자가형광 이미징은 세포 대사를 평가하기 위한 라벨이 없는 비파괴적인 방법을 제공한다.

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...

ADH 및 FAD는 상이한 여기 및 방출 파장에서 자가형광을 나타내는 내인성 분자이다. 대사 반응의 보조 효소로서의 사용 때문에, 자기 형광 현미경은 세포 신진 대사를 평가할 수 있습니다. NADH 및 FAD의 자가형광 이미징은 외인성 표지를 필요로 하지 않으며 세포하 분해능을 갖는 비파괴적인 방법이다.자가 형광 현미경 검사는 살아있는 샘플 및 시간 과정 연구에 사용할 수 있습니다. 자가형광 영상은 임의의 살아있는 세포 또는 조직에 광범위하게 적용될 수 있다. 자가형광 영상은 뉴런, 암세포, 종양, 생체내, 줄기세포 및 면역세포에 사용되어 왔다.이 절차를 시연하는 것은 Texas A & M University의 Quantitative Optical Imaging Laboratory의 대학원생 인 Linghao Hu가 될 것입니다. 레이저 소스 및 검출기를 포함한 다중 광자 형광 수명 현미경의 모든 성분을 켜서 실험을 시작하십시오. 샘플 배치 전에 밝은 필드 램프를 켜고 빛이 아이피스로 들어가는지 확인하십시오.그런 다음 세포 이미징에 대한 목표를 선택합니다. 공기 목표를 사용하지 않는 경우 목표 위에 적절한 침지 매체 한 방울을 바르십시오. 유리 바닥 접시를 현미경 단계의 샘플 홀더 위에 놓습니다.그런 다음 X/Y 스테이지 컨트롤을 사용하여 시편을 목표물로 중앙에 배치하여 시편이 고정되어 있고 이미징 중에 움직이지 않는지 확인하십시오. 완료되면 아이피스를보고 목표를 위로 움직여 세포에 초점을 맞 춥니 다. 현미경이 인클로저 내에 있으면 라이트 박스 도어를 닫으십시오.그런 다음 이미지 획득 소프트웨어를 열고 다중 광자 이미징 탭을 클릭하여 원고에 설명 된대로 다중 광자 이미징 매개 변수를 설정하십시오. 검출기의 이득을 형광 수명 이미징 또는 FILM을 위한 최적 값으로 조정한다. 그런 다음 시편의 각 픽셀에서 레이저 지출의 체류 시간을 원하는 값으로 변경하십시오.니코틴아미드 아데닌 포스페이트 디뉴클레오타이드 또는 NADPH의 경우 다중 광자 레이저를 750나노미터로 설정합니다. 그런 다음 레이저의 셔터를 열 때 셀이 손상되지 않도록 레이저의 전원 제어가 0으로 설정되어 있는지 확인합니다. 방출 필터를 400 ~ 500 나노미터로 설정합니다.매개 변수가 설정되면 초점 또는 라이브 뷰 방식으로 이미징을 시작하여 이미지 설정을 최적화합니다. 레이저 파워를 세 밀리와트에서 여덟 밀리와트로 천천히 증가시키면서 셀에 초점을 맞춥니다. 조정이 완료되면 사용 된 최대 전력을 기록하십시오.Petri 접시의 다른 세그먼트에서 이미징을 위해 기록 된 최대 전원 설정을 사용하십시오. 60초의 이미지 적분 시간을 갖는 NADPH-FILM 이미지를 수집하고, 이미지가 형광 수명 붕괴 곡선 내에서 세포질 픽셀에 대해 100 광자의 피크와 같은 충분한 수의 광자를 가지고 있는지 확인한다. 광자의 수가 너무 적으면 레이저 전력 또는 이미지 획득 기간을 늘리십시오.플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드 또는 FAD 이미징의 경우, 다중 광자 레이저를 890나노미터로 설정하고 레이저가 새로운 파장에서 모드 잠금을 기다릴 때까지 기다립니다. 레이저의 전원 제어가 처음에 0으로 설정되어 있는지 확인하십시오. 방출 필터를 500 ~ 600나노미터로 설정합니다.이미지 설정을 최적화하려면 레이저 전력을 5~10밀리와트로 늘리고 사용된 최대 전력을 기록하여 초점 또는 라이브 뷰 방식으로 이미징을 시작합니다. 후속 시야각의 FAD 이미징에 동일한 전원 설정을 사용합니다. 60초의 이미지 통합 시간을 갖는 FAD-FILM 이미지를 수집하고 이미지가 형광 수명 감쇠 곡선 내에 충분한 광자를 가지고 있는지 확인하십시오.광자 수가 너무 적으면 레이저 파워나 이미지 획득 지속 시간을 늘리고 각 이미지가 두 FOV에서 떨어져 있는 상태에서 추가로 네 개에서 다섯 개의 시야각 또는 FOV에 대해 이미징을 반복합니다. 80 밀리몰 시안화 나트륨 용액을 만들려면 130.24 밀리그램의 시안화 나트륨을 PBS 25 밀리리터에 녹입니다. 배양 접시로부터, 100 마이크로리터의 배양 배지를 흡인물로 100 마이크로리터의 시안화 나트륨 용액으로 대체하여 접시 중의 시안화물의 4밀리몰 농도를 얻었다.세포를 다섯 분 동안 인큐베이터에 넣어 세포가 시안화물 용액과 반응하도록 한다. 시안화물 노출 후, 앞서 기술한 바와 같이 세포의 NADPH 및 FAD 이미지를 획득한다. 이 연구는 요소로부터 측정된 계기 반응 함수 또는 IRF를 사용하여 형광 수명 파라미터를 계산하였다.파라미터는 세그멘테이션에 사용된 각 세포의 세포질의 픽셀에 걸쳐 평균화되었다. 배경 소음을 제거하기 위해 개별 세포를 확인하고 마스킹했습니다. 그런 다음, 핵을 확인하고 세포 마스크 상에 투사하였다.또한, 세포를 여과하여 전형적인 세포의 크기에 맞지 않는 마스킹된 영역을 제거하였다. NADPH와 FAD의 다중 광자 형광 수명 이미징은 시안화물 처리 전후의 세포 형태학 및 대사의 시각화를 가능하게했습니다. NADPH 수명은 시안화물 처리로 감소하는 반면, FAD 수명은 시안화물 처리 후 증가하는 것으로 관찰되었다.대표적인 박스 플롯은 시아나이드 처리 후 MCF7 세포의 광학 산화환원 비율이 감소했음을 나타내었다. 시안화물 노출은 MCF7 세포의 진폭 가중 NADPH 수명을 감소시켰다. 짧고 긴 수명은 NADPH의 경우 감소했지만 NADPH의 경우 알파 수명이 증가했습니다.FAD의 경우, MCF7 세포의 진폭 가중 수명은 시안화물 노출 후 증가했다. FAD의 경우 짧은 수명과 긴 수명이 모두 증가했지만 FAD 알파의 경우 감소했습니다. 샘플에 충분한 레이저 파워를 갖는 것이 중요하지만, 너무 많은 전력은 세포에 손상을 줄 수 있음을 기억하십시오.자가형광 이미징은 세포에 손상을 주지 않기 때문에, 후속 생화학적 분석은 동일한 샘플에 사용될 수 있다.

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생명공학

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세포 대사를 평가하기 위한 자가형광 이미징

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