Name: Murine Hindlimb Gangrene 모델에서 발판 혈관 구조의 고해상도 입체 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 배우세요 FVB 마우스 후지 괴저 모델에서 DiI 관류를 이용한 고해상도 발판 혈관 입체 이미징 방법입니다. 이 기술은 말초동맥질환 및 중요한 사지 허혈의 전임상 약물 테스트와 신생혈관 형성 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 국립 보건원 (R01HL149452 및 VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS))의 Z-J L 및 OC V에 대한 보조금으로 지원되었습니다. 우리는 또한 마이애미 의과 대학의 마비를 치료하기위한 마이애미 프로젝트의 현미경 검사 및 이미징 시설에 감사 드리며 이미지 분석 및 처리 소프트웨어에 대한 액세스를 제공합니다.

프로토콜에 기재된 모든 동물 실험은 마이애미 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 승인을 받았다. FVB 마우스, 8-12 주 나이의 남성과 여성 모두 연구에 사용되었다.
1. L-NAME 용액의 제조
<ol><li>층류 후드의 멸균 조건 하에서, L-NAME 분말 1g( 물자재 표 참조) 1g을 멸균수 20mL와 용해시켜 50mg/mL의 용액을 만들어 L-NAME 원액을 준비한다. 원액을 -20°C에서 300-500 μL 분취량으로 최대 3개월 동안 보관한다.</li>
	<li>작동 L-NAME 용액을 만들기 위해, L-NAME 원액의 분취량을 해동하고 멸균 조건 하에서 PBS (1:4)로 희석하여 최종 10 mg/mL 농도를 얻었다.</li>
	<li>PBS (pH 7.4)를 제조하기 위해, 800 mL의 증류수에 8 g의 NaCl, 0.2 g의 KCl, 1.44 g의 Na2HPO4, 및 0.23 g의 NaH2PO4를 용해시켰다. HCl로 pH를 7.4로 조정하십시오. 총 부피 1,000 mL에 물을 넣고 0.22 μm 병 탑 필터를 통해 여과하십시오. 참고 : L-NAME 작업 용액의 4 μL / g의 복강 내 (IP) 주사는 L-NAME의 원하는 40 mg / kg 용량과 동일합니다. L-NAME 작업 용액은 사용 중에 얼음 위에 보관해야하며 새로 해동 된 원액 분취량을 사용하여 매일 새로운 희석액을 만들어야합니다.</li>
</ol>2. 뒷다리 괴저의 화학 및 외과 적 유도
<ol><li>브리더 스 또는 시설에서 자란 8-12 주 된 FVB 마우스를 얻으십시오 ( 자료 표 참조). 수술 2 시간 전에 L-NAME의 40 mg / kg IP 용량을 투여하십시오.</li>
	<li>PBS에 희석된 케타민 100mg/kg과 자일라진 10mg/kg( 자료표 참조)의 IP 주사로 마우스를 마취시킨다. 발가락 꼬집음 반사가 없어 적절한 진정을 확인하고 절차 중에 호흡률을 계속 모니터링하십시오.<ol>
<li>가위 및 / 또는 탈모 크림을 사용하여 양측 뒷다리와 사타구니에서 머리카락을 제거하십시오. 동물을 수술 현미경 하에 위치시키는 수핀; 사지를 제자리에 뻗어 테이프로 붙입니다. 포비돈-요오드 용액을 수술 부위에 원주적으로 적용하여 수술 현장을 멸균한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10-20x 배율로 가위 또는 메스를 사용하여 사타구니 주름을 따라 1cm 절개를 만들어 사타구니 인대보다 열등합니다. 미세한 포셉과 멸균 면화 팁 어플리케이터를 사용하여 사타구니 지방 패드를 사타구니 인대에서 옆으로 둔감하게 해부하고 대퇴골 동맥, 정맥 및 신경이 명확하게 식별되도록 기본 대퇴골 외피를 노출시킵니다 (그림 1).</li>
	<li>미세한 포셉을 사용하여 대퇴골 덮개를 관통하십시오. 조심스럽게 대퇴 동맥에서 대퇴 신경을 닦으십시오. 대퇴골 신경에 깊은 대퇴동맥(LCFA)의 측방주플렉스 분지의 이륙을 확인한다(그림 1).<ol>
<li>소작 장치 ( 재료 표 참조)를 활성화하고 좌우 운동으로 혈관을 부드럽게 접촉시켜 대퇴골 동맥과 정맥의 전기 응고를 LCFA에 바로 앞당겨 대퇴골 신경이 잘 분리되어 있고 열 손상으로부터 보호되도록하십시오. 응고 된 용기 세그먼트를 가위로 나눕니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>사타구니 지방 패드를 중앙으로 동원하여 원위 대퇴골 동맥과 정맥의 노출을 진행하십시오. 피상적 인 상복부 동맥과 saphenopopliteal 접합을보다 멀리 식별하십시오.<ol>
<li>이 두 위치 사이의 대퇴골 외피를 관통하고 대퇴골 혈관에서 대퇴골 신경을 조심스럽게 해부하십시오. 단계 2.4.1에 기술된 바와 같이 대퇴골 동맥 및 정맥의 응고 및 횡단을 진행한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>멸균 PBS로 채워진 주사기를 사용하여 수술 현장을 관개한다. 출혈의 모든 부위에 3-5 분 동안 면봉 팁 어플리케이터로 부드러운 압력을 가하여 지혈을 얻으십시오.<ol>
<li>간단한 연속 방식으로 흡수 가능한 5-0 봉합사를 사용하여 절개 폐쇄를 진행하십시오. 수술 후 통증 완화를 위해 서방성 부프레노르핀의 1mg/kg 피하 용량( 자료 표 참조)을 투여하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LDPI에 의한 결찰된 뒷다리에서의 풋패드 관류 손실을 확인 한다(물자의 표 참조). 여전히 마취 된 상태에서 LDPI 기계 아래의 경향이있는 어두운 거품 패드에 동물을 놓고 전기 테이프 루프를 사용하여 발을 제자리에 고정하십시오.<ol>
<li>양측 발의 LDPI로 진행하십시오. 스캔이 완료되면 각 풋패드 주위에 ROI를 그리고 평균 플럭스 값을 구하십시오.</li>
		<li>관류 지수를 라이게이션된 풋패드에서 비라이게이션된 풋패드로부터의 평균 플럭스 값의 비로 계산하십시오. 관류 지수가 0.1보다 작은지 확인하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>핵심 체온을 유지하기 위해 가열 패드 또는 오버 헤드 램프가있는 깨끗한 케이지로 동물을 다시 옮깁니다. 생쥐를 동물 시설로 다시 옮기기 전에 마취에서 완전한 회복을 보장하십시오.</li>
</ol>3. L-NAME의 수술 후 관리 및 뒷다리 괴저의 모니터링
<ol><li>수술 후 1-3 일에 각 동물에게 L-NAME의 추가 40 mg / kg IP 용량을 투여하십시오. 동시에, 허혈성 사지에서 발을 조심스럽게 평가하십시오.</li>
	<li>Faber 뒷다리 허혈 스코어를 사용하여 뒷다리 허혈 및 괴저의 정도를 정량화9. 스코어 1-5: 허혈성 손톱의 수; 스코어 6-10: 허혈성 숫자 1-5; 점수 11 및 12 : 부분적이고 완전한 발 위축. 수술 후 1-3 일에 Faber 점수를 기록 한 다음 매주 기록하십시오.</li>
</ol>4. DiI의 제조 및 동물 관류를위한 작업 솔루션
<ol><li>DiI 원액을 제조하기 위해, 100 mg의 DiI 결정( 물자 표 참조)을 100% 에탄올 16.7 mL에 용해시킨다. 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 어둠 속에서 밤새 흔들리는 플랫폼에 두십시오.</li>
	<li>희석제를 제조하기 위해, 글루코스 50 g을 증류수 1,000 mL에 용해시켜 5% 글루코스 용액을 수득하였다. 0.22 μm 병 상부 필터를 통해 여과한다. PBS와 5% 글루코스 용액을 1:4 비율로 혼합하여 작동 희석제 용액을 제조하였다.</li>
</ol>5. 장비 설정 및 DiI 관류
<ol><li>사용 직전에 작업 희석액 10 mL에 DiI 원액 200 μL를 첨가하여 DiI 작업 용액을 만든다(단계 4.2에서 제조). 잘 섞이기 위해 손으로 흔든다.</li>
	<li>두 개 또는 세 개의 3 방향 스토콕과 25G 나비 바늘을 직렬로 연결하십시오. PBS 4 mL, DiI 용액 10 mL, 및 10 mL의 10% 중성 완충 포르말린으로 10 mL 주사기를 제조하였다( 표 참조).</li>
	<li>포르말린으로 주사기를 근위 유입 포트에 연결하고 용액을 주입하여 라인에서 공기를 플러시하십시오. 스톱콕을 돌려 포트를 닫습니다. 동일한 절차를 순차적으로 반복하여 주사기를 DiI와 연결한 다음 PBS를 각각 중간 및 원위 유입 포트에 연결하여 스톱콕 어셈블리를 통해 모든 기포를 플러시하도록 주의하십시오. 주: 스톱콕 조립품 또는 튜브의 어느 부분에도 기포가 없는지 확인하십시오. 기포는 관류 중에 작은 동맥을 막아 혈관 내 DiI 분포가 좋지 않고 이미징 결과가 손상 될 수 있습니다.</li>
	<li>설치가 완료되면 유도 챔버에서 CO2 과다 복용으로 동물을 안락사시킵니다.</li>
	<li>흡수 패드의 수핀 위치에 관류 할 동물을 놓고 바늘로 겨드랑이와 하지를 고정하십시오.</li>
	<li>가위를 사용하여 복강을 열기 위해 횡단 절개를하십시오. 왼쪽과 오른쪽 횡격막을 노출시킨 다음 나누어 흉강에 접근하십시오.<ol>
<li>흉골의 양쪽에있는 흉벽을 아래쪽 갈비뼈에서 첫 번째 또는 두 번째 갈비뼈로 자르고 내부 흉부 (유방) 동맥을 중앙으로 피하십시오. 지혈제 ( 재료 표 참조)를 사용하여 흉골의 하단을 잡고 동물의 머리 쪽으로 반사하여 흉강을 노출시킵니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>우심실보다 색상이 가벼워 보이는 좌심실을 확인하십시오. 무딘 포셉으로 심장을 부드럽게 잡고 나비 바늘을 좌심실에 삽입하십시오.<ol>
<li>가위 또는 18G 바늘을 사용하여 오른쪽 심방을 뚫어 혈액과 관류 용액이 심장으로 돌아가 배출되도록하십시오. 한 두 손으로 바늘을 안정시키고 실수로 우심실에 구멍을 뚫지 않도록주의하고 전신 순환보다는 폐를 관류시키지 않도록주의하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS로 주사기에 포트를 열고 수동으로 2-4 mL를 1-2 mL / min의 속도로 1-2 분 동안 주사하여 혈관 시스템에서 혈액을 플러시하십시오. 오른쪽 심방에서 출혈을 관찰하여 성공적인 관류를 보장하십시오. 주사 후, PBS 주사기의 포트를 닫는다.</li>
	<li>DiI로 주사기의 포트를 열고 5 분 동안 1-2 mL / min의 속도로 5-10 mL를 주입하십시오. DiI 용액의 주입으로 약간 분홍색으로 변해야하는 귀, 코 및 손바닥을 모니터링하십시오. 주사 후, DiI 주사기의 포트를 닫고 고정제를 주입하기 전에 염료의 혼입을 허용하기 위해 2 분 동안 기다리십시오.</li>
	<li>포르말린으로 주사기에 포트를 열고 5 분 동안 1-2 mL / 분의 속도로 5-10 mL를 주입하십시오. 주사 후, 좌심실에서 바늘을 제거하고 관심있는 조직을 수확하기 위해 진행하십시오.</li>
	<li>무거운 가위를 사용하여 발목의 경골을 탈구하여 왼쪽 발과 오른쪽 발을 다리 아래에서 완전히 분리하십시오. 수확한 발을 10% 포르말린 용액 1-2mL와 함께 6웰 또는 12웰 플레이트에 넣습니다. 플레이트를 호일로 감싸고 하룻밤 사이에 4°C에서 보관한다.</li>
</ol>6. 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 위한 풋패드 조직의 제조
<ol><li>다음날, 6- 또는 12-웰 플레이트 중의 고정 용액을 웰 당 PBS 1-2 mL로 교체한다.</li>
	<li>발을 피부로 가꾸려면 먼저 발바닥과 등쪽 측면에 메스가있는 세로 절개를하십시오. 그런 다음 치아가있는 포셉과 작은 지혈제를 사용하여 발과 숫자에서 모든 피부를 조심스럽게 제거하고 기본 연조직을 손상시키지 마십시오.</li>
	<li>조직의 장착 및 이미징, 바람직하게는 관류 및 수확 후 1-2 일 이내에 진행하십시오. 대안적으로, 풋패드를 1-2 mL의 PBS와 함께 6- 또는 12-웰 플레이트로 복귀시키고; 호일로 덮고 4°C에서 보관하여 최대 1개월 동안 형광을 유지한다.</li>
	<li>조직을 장착하려면 두 개의 유리 현미경 슬라이드 사이에 발을 개별적으로 놓고 거품 생검 패드를 접은 후 (조직 두께에 따라 한두 번) 양쪽 끝에 놓습니다 ( 재료 표 참조). 두 개의 작은 바인더 클립을 사용하여 각 끝에서 유리 슬라이드를 함께 압축합니다(최종 두께 약 1mm). 참고: 조직이 두꺼워지면 더 긴 스캔 시간이 필요합니다. 스킨 풋패드는 이미징 하루 전에 유리 슬라이드 사이에서 압축되어 조직 두께를 줄일 수 있습니다.</li>
</ol>7. 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사
<ol><li>이미징 세션 준비: 이미징 시스템을 켜고 수집 소프트웨어를 시작합니다( 자료 표 참조). 낮은 배율/낮은 숫자 조리개 목표(예: x5/0.15)를 사용하여 낮은 배율 렌즈가 일반적으로 이 실험에 더 긴 작동 거리를 갖기 때문에 이미지를 캡처합니다.</li>
	<li>스테이지 활성화 대화 상자에서 예를 클릭합니다. 구성 탭에서 561nm 레이저를 활성화합니다. 메인 화면에서 Visible 버튼을 클릭하여 보이는 빔 경로를 활성화하십시오. 해당 활성 확인란을 클릭하여 검출기를 570-600nm 범위로 설정합니다.</li>
	<li>> 획득 탭에서 타일 스캔 아이콘을 선택하고 원하는 해상도(512 x 512 또는 1024 x 1024)를 설정합니다.</li>
	<li>유리 슬라이드 사이에 압축된 건식 장착형(물 또는 PBS 첨가 없음) 조직 샘플을 현미경 스테이지에 배치하고 조직에 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>스캔 경계를 설정하려면 샘플의 왼쪽 위 또는 오른쪽 모서리로 이동합니다. 획득 탭의 타일 스캔 메뉴에서 마크 위치 버튼을 클릭합니다. 반대쪽 모서리(각각 오른쪽 아래 또는 왼쪽)로 이동하고 위치 표시 단추를 다시 한 번 클릭합니다.</li>
	<li>Z 스택의 깊이를 설정하려면 화면의 왼쪽 아래 모서리에 있는 라이브 단추를 클릭하고 샘플의 가운데로 이동합니다. z축 노브를 사용하여 샘플 아래쪽으로 스크롤합니다.</li>
	<li>획득 탭의 Z-스택 메뉴에서 시작 버튼을 클릭합니다 . 샘플 상단으로 스크롤하여 끝 단추를 클릭합니다. Z 스텝 사이즈를 클릭하고 원하는 값(예: 50μm)으로 설정합니다.</li>
	<li>화면의 오른쪽 하단에서 시작 을 클릭하여 이미지 수집을 시작하십시오.</li>
</ol>8. 발판 혈관의 정량적 분석 및 3D 재구성
<ol><li>피지 (ImageJ)의 최신 버전과 선박 분석 플러그인20을 다운로드하여 설치하십시오. 피지에서 현미경 이미지 파일을 열면 이미지 하단의 슬라이더를 사용하여 개별 Z 시리즈를 Z 축에서 볼 수있는 Z 스택으로 결합합니다.</li>
	<li>합성 Z 스택 이미지를 선택한 다음 이미지 메뉴에서 Z 프로젝트> 스택 을 선택하여 이차원 투영을 만듭니다. 그런 다음 바이너리 만들기 > 프로세스>서 Z 프로젝션을 바이너리로 변환하십시오.</li>
	<li>플러그인 > 혈관 밀도에서 혈관 밀도 플러그인을 실행하십시오. 메시지가 표시되면 커서를 사용하여 풋패드와 숫자의 둘레에서 ROI를 추적합니다. 보고되는 혈관 밀도를 기록하고, 이는 ROI(혈관 면적 분율)의 백분율로서 표현된다.</li>
	<li>피지에서 3D 재구성을 만들려면 3D 프로젝트> 스택을 선택하고 이미지 메뉴에서 원하는 회전 축, 각도 및 속도를 설정합니다. 또는 플러그인 메뉴에서 볼륨 뷰어를 선택하여 이미지를 슬라이스로 시각화하거나 원하는 축에서 재구성을 조작합니다.</li>
	<li>3D 렌더링에 대한 자세한 내용은 대체 이미지 분석 및 처리 소프트웨어를 사용하십시오( 자료 표 참조). 파일을 원하는 소프트웨어 형식으로 변환하고 타일 스티칭 기능을 사용하여 개별 타일 스캔을 스티치합니다.</li>
	<li>개별 타일 스캔을 함께 바느질한 후 복합 파일을 열고 볼륨 표면 렌더링을 진행합니다. 새 서피스 추가를 클릭하여 서피스 생성 마법사를 열고 화살표를 사용하여 메뉴를 전환하고 특히 ROI 및 임계값 강도를 설정합니다. 표면 렌더링에 만족하면 애니메이션 기능을 사용하여 처리된 이미지의 비디오를 만듭니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

마우스 뒷다리 허혈은 PAD 및 CLTI에서 신생혈관화를 연구하기 위해 가장 널리 사용되는 전임상 모델이지만, 사용된 특정 마우스 균주 및 동맥 파괴의 부위, 수 및 방법에 따라 허혈 중증도 및 회복에 상당한 차이가 있다. 대퇴골 동맥 결찰 및 L-NAME의 IP 투여의 조합은 FVB 마우스11에서 뒷다리 괴저(hindlimb gangrene)를 확실하게 유도할 수 있다. 동일한 치료로 C57BL/6 마우스에서 조직 손실이 없는 뒷다리 허혈이 발생하는 반면, BALB/c 마우스에서는 발이나 다리의 자동 절단이 대퇴골 동맥 결찰만으로 유도될 수 있습니다. 이와 같이, 허혈 모욕에 대한 중간 반응을 갖는 FVB 마우스에서 L-NAME 동시 투여를 통한 대퇴골 동맥 응고의 전술한 기술은 CLTI로 이어지는 질환의 가장 심각한 징후에서 보여지는 것과 유사한 발판 괴저의 독특하고 재현 가능한 모델을 제공한다. 이 모델에서 관찰 된 조직 손실의 정도는 허혈성 손톱 몇 개에서 여러 괴저성 숫자까지 ...

죽상 동맥 경화증으로 인해 사지로의 혈류 감소를 특징으로하는 말초 동맥 질환 (PAD)은 미국에서 6.5 백만 명과 전 세계적으로 2 억 명에게 영향을 미칩니다1. PAD 환자는 사지 기능과 삶의 질이 저하 된 경험을하고, PAD의 가장 심각한 형태 인 CLTI를 가진 환자는 절단 및 사망 위험이 증가하며 5 년 사망률은 50 % 2에 가깝습니다. 임상 실습에서, 발목-상완 지수(ABI) <0.9를 갖는 환자는 PAD를 갖는 것으로 간주되고, ABI <0.4를 갖는 환자는 CLTI3을 갖는 것으로 휴식 통증 또는 조직 손실과 관련된다. 증상은 일상 활동, 허혈에 대한 근육 내성, 해부학 적 변화 및 부수적 인 발달의 차이에 따라 유사한 ABI를 가진 환자간에 다릅니다4. 디지트 및 사지 괴저(Digit and limb gangrene)는 CLTI를 초래하는 모든 혈관 폐쇄성 질환 중 가장 심각한 증상이다. 그것은 연조직을 미라화하는 건조한 괴사의 한 형태입니다. 죽상 경화성 PAD 외에도 당뇨병, Buerger 병 및 Raynaud 현상과 같은 혈관염 또는 말기 신장 질환의 설정에서 calciphylaxis 환자에서도 관찰 될 수 있습니다5,6.
PAD / CLTI의 발병 기전을 연구하고 잠재적 인 치료법의 효능을 테스트하기 위해 몇 가지 전임상 모델이 개발되었으며, 그 중 가장 흔한 것은 마우스 뒷다리 허혈로 남아 있습니다. 마우스에서 뒷다리 허혈을 유도하는 것은 전형적으로 봉합사 결찰, 전기 응고 또는 원하는 혈관을 수축시키는 다른 수단에 의해, 장골 또는 대퇴골 동맥으로부터의 혈류의 방해에 의해 달성된다7. 이 기술은 뒷다리에 대한 관류를 크게 줄이고 허벅지와 종아리 근육의 신생혈관화를 자극합니다. 그러나, 부수적 분포의 해부학적 차이로 인해 허혈성 모욕에 대한 민감도에 필수적인 뮤린 균주-의존적 차이가 부분적으로 존재한다8,9. 예를 들어, C57BL/6 마우스는 뒷다리 허혈에 상대적으로 내성이 있어 사지 기능이 감소하지만 일반적으로 발판에서 괴저에 대한 증거는 없다. 반면에, BALB/c 마우스는 허혈로부터 회복할 수 있는 능력이 본질적으로 열악하며, 전형적으로 대퇴골 동맥 결찰 단독 후 발 또는 하부 다리의 자동 절단을 일으킨다. 허혈에 대한이 심한 반응은 치료 창을 좁히고 사지 재관류 및 기능에 대한 종단 평가를 배제 할 수 있습니다. 흥미롭게도, 뮤린 염색체 7에 위치한 단일 정량적 형질 유전자좌의 유전적 차이는 조직 괴사 및 사지 재관류에 대한 C57BL/6 및 BALB/c 마우스의 이러한 차별적 감수성에 연루되어 있다10.
C57BL/6 및 BALB/c 균주와 비교하여, FVB 마우스는 대퇴골 동맥 결찰 단독에 대해 중간이지만 일관성 없는 반응을 보인다. 일부 동물은 검은 허혈성 손톱이나 미라화 된 숫자의 형태로 발판 괴저가 발생하지만 허혈의 명백한 징후가없는 동물도 있습니다11. 산화질소 합성효소(NOS) 억제제12인 Nω-Nitro-L-아르기닌 메틸 에스테르 염산염(L-NAME)의 병용 투여는 보상 혈관 확장 기작을 예방하고 뒷다리 조직의 산화 스트레스를 더욱 증가시킨다. 대퇴골 동맥 결찰 또는 응고와 함께, 이 접근법은 CLTI의 위축성 변화와 유사한 FVB 마우스에서 지속적으로 풋패드 조직 손실을 발생시키지만, 사지 자동 절단으로 거의 진행되지 않는다11. 산화 스트레스는 PAD / CLTI의 특징 중 하나이며 내피 기능 장애와 산화 질소 (NO) 13,14의 생체 이용률 감소에 의해 전파됩니다. NO는 일반적으로 동맥 및 모세관 혈류, 혈소판 부착 및 응집, 백혈구 모집 및 활성화에 유익한 효과를 발휘하는 다능성 분자이다13. NOS의 감소된 수준은 또한 산화 스트레스를 유도하고 죽상동맥경화증의 진행을 가속화하는 안지오텐신 전환 효소를 활성화시키는 것으로 나타났다15.
일단 뒷다리 허혈의 모델이 확립되면, 후속 사지 재관류 및 잠재적 인 치료법의 치료 효과를 모니터링하는 것도 필요합니다. 제안 된 뮤린 괴저 모델에서, 조직 손실의 정도는 먼저 Faber 점수를 사용하여 발의 총 모양을 평가하기 위해 정량화 될 수 있습니다 (0 : 정상, 1-5 : 점수가 영향을받는 손톱의 수를 나타내는 손톱 손실, 6-10 : 점수가 영향을받는 숫자의 수를 나타내는 숫자의 위축, 11-12 : 부분적이고 완전한 발 위축, 각각)9. 그런 다음 뒷다리 관류의 정량적 측정은 일반적으로 LDPI를 사용하여 이루어지며, LDPI는 레이저 광과 적혈구 사이의 도플러 상호 작용에 의존하여 관심 영역 (ROI)16에서 픽셀 수준의 관류를 나타냅니다. 이 기술은 양적, 비침습적, 반복적 인 측정에 이상적이지만 뒷다리 혈관 구조의 세분화 된 해부학 적 세부 사항을 제공하지는 않습니다16. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (micro-CT), 자기 공명 혈관 조영술 (MRA) 및 X 선 미세 혈관 조영술과 같은 다른 이미징 양식은 비용이 많이 들고 정교한 계측이 필요하거나 기술적으로 어려운 것으로 입증되었습니다16. 2008년에, Li et al.은 친유성 카르보시아닌 염료 DiI17로 망막 내 혈관을 표지하는 기술을 기술하였다. DiI는 내피 세포로 통합되고, 직접 확산에 의해, 혈관신생 새싹채소 및 유사 포드 과정과 같은 혈관막 구조를 염색한다17,18. 내피 세포로의 직접 전달과 염료의 형광성이 높기 때문에이 절차는 혈관의 강렬하고 오래 지속되는 라벨링을 제공합니다. 2012년에, Boden et al.은 대퇴골 동맥 결찰 후 수확된 허벅지 부가물 근육의 전체 탑재 영상화를 통해 뮤린 뒷다리 허혈 모델에 DiI 관류 기술을 적용하였다19.
현재의 방법은 뒷다리 허혈 및 유전자 또는 세포 기반 치료제에 반응하여 신생혈관화를 평가하기 위한 비교적 저렴하고 기술적으로 실현 가능한 방법을 제공한다. 추가의 적응에서, 이 프로토콜은 뒷다리 괴저의 뮤린 모델에서 발판 혈관구조를 고해상도로 그리고 3D로 이미지화하기 위한 DiI 관류의 적용을 기술한다.

<table><tbody><tr><td>바인더 클립(소)</td><td>사무용품점</td><td></td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀(서방형)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>버터플라이 바늘(Luer-Lok 포함 25G)</td><td></td><td>VWR 10148-584</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>DiI(1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td><td>Invitrogen</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>전기 소작 장치</td><td>Gemini Cautery System</td><td>5917</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 (100%)</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>피지(ImageJ) 소프트웨어</td><td>NIH</td><td></td><td>사용 버전 2.1.0. 무료 다운로드, 라이선스가 필요하지 않습니다.</td></tr><tr><td>폼 생검 패드</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-221</td><td></td></tr><tr><td>포르말린(중성 완충, 10%)</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td></td></tr><tr><td>FVB 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HCl (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13-1700</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 소프트웨어</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>버전 9.6.0을 사용했습니다.</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pivetal</td><td>NDC 46066-755-04</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-NAME (N&omega;-Nitro-L-arginine 메틸 에스테르 염산염)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>레이저 도플러 관류 이미저</td><td>MoorLDI</td><td>moorLDI2-HIR</td><td>중고 moorLDI V5 소프트웨어.</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 (25 x 75 x 1 mm)</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8263</td><td></td></tr><tr><td>바늘(27g)</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>포비돈-요오드 면봉(10%)</td><td>메드라인</td><td>MDS093901ZZ</td><td></td></tr><tr><td>수술 기구</td><td>로보즈 서지컬</td><td></td><td>파인 핀셋, 바늘 드라이버, 스프링 가위, 지혈을 권장합니다.</td></tr><tr><td>봉합사(5-0 흡수성)</td><td>DemeTECH</td><td>G275017B0P</td><td></td></tr><tr><td>주사기(10mL)</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>3방향 스톱콕</td><td>Cole-Parmer</td><td>19406-49</td><td></td></tr><tr><td>혈관 분석 플러그인</td><td></td><td></td><td>무료 다운로드, 라이선스 필요 없음. 참조 : Elfarnawany (2015).</td></tr><tr><td>자일라진</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

murine hindlimb gangrene 모델에서 발판 혈관 구조의 고해상도 입체 이미징

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

말초 동맥 질환 (PAD)은 죽상 경화성 위험 인자에 대한 만성 노출로 인한 이환의 중요한 원인입니다. 가장 심한 형태, 만성 사지를 위협하는 허혈 (CLTI)으로 고통받는 환자는 만성 통증, 통증이없는 제한된 도보 거리 및 치유되지 않는 상처를 포함하여 일상 생활에 상당한 장애에 직면합니다. 전임상 모델은 PAD를 연구하기 위해 다양한 동물에서 개발되었지만 마우스 뒷다리 허혈은 여전히 가장 널리 사용되고 있습니다. 이들 모델에서 허혈성 모욕에 대한 반응에서 상당한 변동이 있을 수 있는데, 사용된 마우스 균주 및 동맥 파괴의 부위, 수 및 수단에 의존한다. 이 프로토콜은 CLTI의 조직 손실과 유사한 프렌드 바이러스 B (FVB) 마우스에서 발판 괴괴를 안정적으로 유도하기 위해 대퇴 동맥 및 정맥 전기 응고를 산화 질소 신타제 (NOS) 억제제의 투여와 결합하는 독특한 방법을 설명합니다. 레이저 도플러 관류 영상 (LDPI)과 같은 재관류를 평가하는 전통적인 수단이 여전히 권장되지만, 친유성 염료 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 과염소산염 (DiI)의 심장 내 관류는 혈관 구조를 라벨링하는 데 사용됩니다. 후속 전체 마운트 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사는 뒷다리 허혈 모델에서 재관류를 평가하는 전통적인 수단을 보완하는 풋패드 혈관 네트워크의 고해상도, 3차원(3D) 재구성을 가능하게 합니다.

이 프로토콜은 감수성이 있는 FVB 마우스에서 대퇴골 동맥 및 정맥 응고와 L-NAME 투여, 산화질소 신타제 억제제의 조합을 사용하여 뮤린 풋패드에서 허혈 및 조직 손실을 유도하는 신뢰할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 도 1 은 뮤린 뒷다리 혈관구조의 해부학을 상세히 기술하고 대퇴골 동맥 및 정맥 응고 부위(황색 X)를 나타내며, 측방둘레 대퇴골 동맥(LCFA)에 바로 근접하고 사페노포플라이트 접합부에 근위한다. LCFA를 식별해야 하며, 이 구조에 해당하는 응고 부위는 모든 수술 과정 전반에 걸쳐 일관되게 유지됩니다. 기술된 바와 같이, 수술 절차 2시간 전과 수술 후 1-3일에, 마우스는 또한 산화 스트레스의 상승된 조직 수준을 유지하기 위해 L-NAME의 40 mg/kg IP를 투여하였다. 도 2 는 수술 일주일 후 이 모델로부터 예상될 수 있는 조직 손실의 변화를 보여주며, Faber <sup class="x...

본 프로토콜은 FVB 마우스에서 뒷다리 괴저(hindlimb gangrene)를 유도하기 위해 대퇴골 동맥 및 정맥 전기응고와 산화질소 합성효소 억제제의 투여를 결합한 말초 동맥 질환의 독특하고 임상적으로 관련된 모델을 기술한다. 심장 내 DiI 관류는 풋패드 혈관 구조의 고해상도, 입체 영상화에 사용됩니다.

Murine Hindlimb Gangrene 모델에서 발판 혈관 구조의 고해상도 입체 이미징

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

이 프로토콜은 질량 억제제 및 대퇴골 동맥 응고의 투여를 사용하여 마우스 발 패드 괴저 모델을 만드는 방법을 제시한다. 그런 다음 DiI 관류는 발 패드 혈관 구조의 고해상도 시각화를 허용합니다. 이 모델은 임상적으로 관련이 있으며 전임상 약물 검사 및 사지 허혈 연구에 사용할 수 있습니다.혈관구조의 고해상도 시각화는 신생혈관화를 평가하는 기술적으로 쉬운 수단을 제공합니다. 이 발 패드 괴저 모델은 말초 동맥 질환 및 중요한 사지 허혈의 전임상 연구에 중요한 응용 프로그램을 가지고 있습니다. DiI 관류는 동물 모델에서 신생혈관화를 연구하는데 유용한 도구이다.이 절차를 시연하는 것은 외과 레지던트의 Antoine Ribieras와 내 실험실의 연구원 인 Yulexi Ortiz가 될 것입니다. 먼저, 사용 직전에 작업 희석액 10 밀리리터에 DiI 원액 200 마이크로리터를 첨가하여 DiI 작업 용액을 만듭니다. 잘 섞이기 위해 손으로 흔든다.두 개 또는 세 개의 세 개의 방향 스톱콕과 25게이지 나비 바늘을 직렬로 연결합니다. 4 밀리리터의 PBS, 10 밀리리터의 DiI 용액 및 10 밀리리터의 10 % 중성 완충 포르말린으로 10 밀리리터 주사기를 준비하십시오. 포르말린으로 주사기를 근위 유입 포트에 연결하고 용액을 주입하여 라인에서 공기를 플러시하십시오.그런 다음 스톱콕을 돌려 포트를 닫습니다. 동일한 절차를 반복하여 주사기를 DiI와 연결한 다음 PBS를 각각 중간 및 원위 유입 포트에 연결합니다. 안락사 후, 동물을 흡수 패드의 수핀 위치에 놓고 바늘로 겨드랑이와 하지를 고정하십시오.가위를 사용하여 횡단 절개를 만들어 복강을 연 다음 좌우 횡격막을 노출시키고 나누어 흉강에 접근하십시오. 흉골의 양쪽에있는 흉벽을 아래쪽 갈비뼈에서 첫 번째 또는 두 번째 갈비뼈로 자릅니다. 지혈제를 사용하여 흉골의 하단을 잡고 동물의 머리 쪽으로 반사하여 흉강을 노출시킵니다.오른쪽보다 색상이 밝게 보이는 좌심실을 확인하십시오. 무딘 포셉으로 심장을 부드럽게 잡고 나비 바늘을 좌심실에 삽입하십시오. 가위 또는 18게이지 바늘을 사용하여 오른쪽 심방을 뚫어 혈액과 관류 용액이 심장으로 돌아가 배출되도록 합니다.PBS로 주사기의 포트를 열고 수동으로 혈관 시스템에서 혈액을 플러시하기 위해 분당 한 두 밀리리터에서 두 밀리리터의 속도로 분당 두 밀리리터를 주입합니다. 오른쪽 심방에서 출혈을 관찰하여 성공적인 관류를 보장하십시오. 주사 후, PBS 주사기의 포트를 닫는다.DiI로 주사기의 포트를 열고 5 분 동안 분당 1 ~ 2 밀리리터의 속도로 다섯 ~ 10 밀리리터를 주입하십시오. 주사 후, DiI 주사기의 포트를 닫고 고정제를 주입하기 전에 염료의 혼입을 허용하기 위해 두 분 동안 기다리십시오. 포르말린으로 주사기의 포트를 열고 5 분 동안 분당 1 ~ 2 밀리리터의 속도로 다섯 ~ 10 밀리리터를 주입하십시오.주사 후 좌심실에서 바늘을 제거하십시오. 무거운 가위를 사용하여 발목의 경골을 탈구하여 왼쪽 발과 오른쪽 발을 다리 아래에서 완전히 분리하십시오. 수확 한 발을 12 웰 플레이트에 10 % 포르말린 용액 1 ~ 2 밀리리터로 놓습니다.접시를 호일로 감싸고 하룻밤 사이에 섭씨 네 도에 보관하십시오. 다음날, 12 웰 플레이트의 고정 용액을 웰 당 1 ~ 2 밀리리터의 PBS로 교체하십시오. 발바닥과 등쪽 부분에 메스가있는 세로 절개를하십시오.그런 다음 치아가있는 포셉과 작은 지혈제를 사용하여 발과 숫자에서 모든 피부를 조심스럽게 제거하고 기본 연조직을 손상시키지 마십시오. 조직을 장착하려면 두 개의 유리 현미경 슬라이드 사이에 발을 개별적으로 놓고 거품 생검 패드를 양쪽 끝에서 접어 놓습니다. 두 개의 작은 바인더 클립을 사용하여 양쪽 끝에서 유리 슬라이드를 함께 압축합니다.또는 풋 패드를 PBS의 1 내지 2 밀리리터와 함께 12 웰 플레이트로 복귀시킨다. 호일로 덮은 후 섭씨 네 도에 보관하여 최대 한 달 동안 형광을 유지하십시오. 이미징 시스템을 켜고, 수집 소프트웨어를 시작하고, 낮은 배율 또는 낮은 숫자 조리개 목표를 사용하여 이미지를 캡처합니다.스테이지 활성화 대화 상자에서 예를 클릭합니다. 구성 탭에서 561나노미터 레이저를 활성화합니다. 메인 화면에서 보이는 버튼을 클릭하여 보이는 빔 경로를 활성화하십시오.해당 활성 확인란을 클릭하여 감지기를 570 ~ 600 나노미터 범위로 설정하십시오. 획득 탭에서 타일 스캔 아이콘을 선택하고 원하는 해상도를 설정합니다. 현미경 단계에서 유리 슬라이드 사이에 압축 된 건조한 장착 조직 샘플을 배치하고 조직에 초점을 맞 춥니 다.샘플의 한 모서리로 이동합니다. 타일 스캔 메뉴에서 마크 위치 버튼을 클릭하십시오. 반대쪽 모서리로 이동하여 스캔 경계를 설정하는 마크 위치 버튼을 다시 클릭하십시오.Z 스택의 깊이를 설정하려면 라이브 버튼을 클릭하십시오. 샘플의 중앙으로 이동하고 z축 노브를 사용하여 샘플의 맨 아래로 스크롤합니다. Z-스택 메뉴 아래의 획득 탭에서 시작 버튼을 클릭합니다.샘플 상단으로 스크롤하여 끝 버튼을 클릭하십시오. z-스텝 크기를 클릭하고 원하는 값으로 설정하십시오. 그런 다음 시작을 클릭하여 이미지 수집을 시작하십시오.이 그림은 각 이미지의 오른쪽 하단에 FABER 점수가 기록 된 수술 후 일주일 후이 모델에서 기대할 수있는 조직 손실의 변화를 보여줍니다. 재건 현미경 검사 이미지는 수술 후 결찰 된 뒷다리의 발 패드에 대한 관류가 심각하게 감소한 것에 비해 비 결찰 된 대조군 발 패드에서 정상적인 혈관 해부학을 보여줍니다. 수술 20 일 후, 발 패드로의 관류는 비 결찰 된 조절의 정도까지는 아니지만 상당히 개선되었습니다.비디오는 표면 렌더링이 애니메이션 기능을 사용하여 생성되었음을 보여줍니다. 관류 어셈블리에서 모든 기포를 내뿜습니다. 관류 중에 폐가 팽창하고 분홍색으로 변하면 바늘이 우심실에 침투하여 약간 수축해야합니다.사지 조직은 근육 괴사, 조직 재생, 혈관 밀도 및 전구 세포 및 기타 조직 복구 세포의 모집을 평가하기 위해 면역 염색에 사용될 수 있습니다. 이 뮤린 괴저 모델에서 DiI 관류의 기술은 유전자 및 세포 요법의 연구에 사용되어 왔다. 이 연구는 중요한 사지 허혈 환자의 사지에서 관류를 개선하는 것을 목표로합니다.

high-resolution-three-dimensional-imaging-footpad-vasculature-murine

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

일방적 hindlimb의 국소 빈혈의 유도에 대한 수술은 레이저 도플러 재관류 이미징에 의해 국소 빈혈의 확인과 증명합니다.

Hindlimb 국소 빈혈의 Murine 모델

마이크로 컴퓨터 단층 촬영 영상에 대한 Microfil와 허혈성 뒷발과 혈관의 관류에 삼투의 약물 전달 (Drug Delivery)

마우스에서 뒷다리 허혈의 외과적 유도는 혈관 신생을 검사하는 데 유용하지만, 현저한 허혈 유발 조직 괴사를 나타내는 특정 근친 마우스 균주에서는 손상됩니다. 점진적인 동맥 폐색의 유도를 통해 이 문제를 회피하기 위해 아메로이드 수축기를 사용하여 아급성 사지 허혈을 유도하는 방법이 설명되어 있습니다.

급성 및 아 급성 쥐 뒷다리 국소 빈혈하는 방법

인슐린 유도 혈관 근육 관류를 조절 하 고 증가 microvascular 표면적 (microvascular 모집) 용 질 exchange에 사용할 수 있는 혈액과 조직 interstitium 사이. 결합된 intravital 현미경 검사 법 및 대비 향상 된 초음파 동시에 큰 배와는 미세 혈관에서 인슐린의 활동을 평가 하 여 vivo에서.

Intravital 현미경 검사 법 및 대비 향상 된 초음파 마우스 Hindlimb의 인슐린 유도 된 혈관과 근육 관류 결합

여기, 선물이 혈관 형성에서 vivo에서 시각화 하는 프로토콜에 multiphoton 현미경 검사 법에 의해 3 차원 건설 기계에서 실시간. 유전자 변형된 건설 기계에서 신생 murine calvarial 중요 한 뼈 결함 모델에서 연구 했다. 더 많은 새로운 혈관 컨트롤에서 보다 처리 그룹에서 발견 했다.

Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화

여기에서, 중요한 뒷다리 허혈 실험 모형은 혈관 신생 치료의 효과를 평가하기 위하여 기능적, 적학 및 분자 시험의 건전지에 선행됩니다.

힌들보 리 허 혈의 뮤린 모델에서 치료 혈관 신생 평가

여기에서, 우리는 마우스 뒷다리에 있는 혈류를 측정하기 위하여 레이저 도플러 관류 화상 진찰을 위한 기술 그리고 필요한 통제를 보여주는 프로토콜을 제시합니다.

마우스 힌드림에 있는 레이저 도플러 관류 화상 진찰

이 문서는 작은 절개를 가진 마우스에 있는 심각한 허혈을 확립하기 위하여 능률적인 외과 접근을 보여줍니다. 이 방법은 실험실 업그레이드없이 대부분의 연구 그룹에 의해 적용 될 수있다.

ApoE에서 뒷다리 허혈의 변형 된 수술 모델-/- 소형 절개를 사용하여 마우스

백혈구와 혈소판의 모집은 동맥 형성 동안 측부 동맥의 효과적인 성장에 필요한 필수 구성 요소를 구성합니다. 다광자 현미경은 동맥 형성 중 백혈구 모집 및 유출을 연구하기 위해 생체 내에서 높은 시공간 분해능과 더 적은 광독성으로 세포 역학을 추적하는 효율적인 도구입니다.

쥐 뒷다리 모델에서 동맥 형성 중 백혈구 모집을 모니터링하기 위한 다광자 생체 내 이미징

여기서는 마이크로 엑스레이 계산단층 촬영을 사용하여 뮤린 뒷다리 혈관에 대한 시각화 및 정량화 방법을 설명합니다.

Murine 힌드사지 선박의 계산 단층 촬영 기반 3차원 시각화를 위한 샘플 준비

이 절차는 쥐에서 경골 피질 횡수송을 입증하여 사지 허혈 중 재혈관화 과정을 시각화하고 분석할 수 있게 합니다.

하체 허혈 치료를 위한 경골 피질 횡수송의 쥐 모델

배우세요 FVB 마우스 후지 괴저 모델에서 DiI 관류를 이용한 고해상도 발판 혈관 입체 이미징 방법입니다. 이 기술은 말초동맥질환 및 중요한 사지 허혈의 전임상 약물 테스트와 신생혈관 형성 연구에 활용됩니다.

Murine Hindlimb Gangrene 모델에서 발판 혈관 구조의 고해상도 입체 이미징

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