Name: 초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 배우세요 초파리 배아에서 형광 프로브를 이용한 소기관 운동 모니터링 방법을. 미세주입과 공초점 현미경을 활용하여 세포 골격 의존성 지질 소기관의 역학을 분석하고 발달 생물학적 메커니즘을 규명합니다.

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원고에 대한 의견을 주신 Pakinee Phromsiri, Brian Jencik, Jinghong (James) Tang 및 Roger White에게 감사드립니다. PIV 분석을 수행하는 방법에 대한 전문 지식을 공유해 주신 Patrick Oakes, Stefano Di Talia, Victoria Deneke에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 보조금 F31 HD100127 (M. D. K.) 및 R01 GM102155 (M. A. W)에 의해 지원되었습니다.

<ol><li>Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+organization+and+function+in+the+Drosophila+blastoderm+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5502(2017).</li>
<li>Mavor, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab8+directs+furrow+ingression+and+membrane+addition+during+epithelial+formation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Rab8 directs furrow ingression and membrane addition during epithelial formation in Drosophila melanogaster.</a> Development. 143 (5), 892-903 (2016).</li>
<li>Riggs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+remodeling+during+early+Drosophila+furrow+formation+requires+recycling+endosomal+components+Nuclear-fallout+and+Rab11%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton remodeling during early Drosophila furrow formation requires recycling endosomal components Nuclear-fallout and Rab11.</a> Journal of Cell Biology. 163 (1), 143-154 (2003).</li>
<li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos%3A+forces+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92 (4), 547-557 (1998).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((As+the+fat+flies%3A+The+dynamic+lipid+droplets+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">As the fat flies: The dynamic lipid droplets of Drosophila embryos.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (9), 1156-1185 (2015).</li>
<li>Deneke, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organized+nuclear+positioning+synchronizes+the+cell+cycle+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-organized nuclear positioning synchronizes the cell cycle in Drosophila embryos.</a> Cell. 177 (4), 925-941 (2019).</li>
<li>Welte, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+perilipin+homolog+LSD2%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid-droplet transport by the perilipin homolog LSD2.</a> Current Biology. 15 (14), 1266-1275 (2005).</li>
<li>Bailey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+role+for+lipid+droplets+in+a+stem+cell+niche+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antioxidant role for lipid droplets in a stem cell niche of Drosophila.</a> Cell. 163 (2), 340-353 (2015).</li>
<li>Johnson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2Av+buffering+via+dynamic+sequestration+to+lipid+droplets+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">H2Av buffering via dynamic sequestration to lipid droplets in Drosophila embryos.</a> Elife. 7, 36021(2018).</li>
<li>Lowe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+expression+patterns%2C+subcellular+localisations+and+interaction+partners+of+Drosophila+proteins+using+a+pigP+protein+trap+library%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of the expression patterns, subcellular localisations and interaction partners of Drosophila proteins using a pigP protein trap library.</a> Development. 141 (20), 3994-4005 (2014).</li>
<li>Rambold, A. S., Cohen, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+trafficking+in+starved+cells%3A+regulation+by+lipid+droplet+lipolysis%2C+autophagy%2C+and+mitochondrial+fusion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Fatty acid trafficking in starved cells: regulation by lipid droplet lipolysis, autophagy, and mitochondrial fusion dynamics.</a> Developmental Cell. 32 (6), 678-692 (2015).</li>
<li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).</li>
<li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+centrifugation+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In-vivo centrifugation of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).</li>
<li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+embryo+collection%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Drosophila embryo collection.</a> CSH Protocols. 2007, (2007).</li>
<li>Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWieschaus%2C+E+%22Drosophila%3A+A+Practical+Approach%22">Drosophila: A Practical Approach</a>. Roberts, D. B. , Oxford University Press. 179-214 (1998).</li>
<li>Brody, T. B. The Interactive Fly: Stages of Development and Mitotic Domains. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm">https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm</a> (1999).</li>
<li>Liberzon, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiberzon%2C+A+%22OpenPIV%2Fopenpiv-python%3A+OpenPIV+-+Python+%28v0.22.2%29+with+a+new+extended+search+PIV+grid+option%22">OpenPIV/openpiv-python: OpenPIV - Python (v0.22.2) with a new extended search PIV grid option</a>. , (2020).</li>
<li>Markow, T. A., Beall, S., Matzkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+size%2C+embryonic+development+time+and+ovoviviparity+in+Drosophila+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Egg size, embryonic development time and ovoviviparity in Drosophila species.</a> Journal of Evolutionary Biology. 22 (2), 430-434 (2009).</li>
<li>Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein-mediated+cargo+transport+in+vivo.+A+switch+controls+travel+distance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynein-mediated cargo transport in vivo. A switch controls travel distance.</a> Journal of Cell Biology. 148 (5), 945-956 (2000).</li>
<li>Debarre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+lipid+bodies+in+cells+and+tissues+using+third-harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy.</a> Nature Methods. 3 (1), 47-53 (2006).</li>
<li>Dou, W., Zhang, D., Jung, Y., Cheng, J. X., Umulis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+lipid-droplet+intracellular+motion+in+early+Drosophila+embryos+using+femtosecond-stimulated+Raman+loss+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of lipid-droplet intracellular motion in early Drosophila embryos using femtosecond-stimulated Raman loss microscopy.</a> Biophysical Journal. 102 (7), 1666-1675 (2012).</li>
<li>Barry, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injecting+Gryllus+bimaculatus+Eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Injecting Gryllus bimaculatus Eggs.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), (2019).</li>
<li>Le Trionnaire, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+protocol+for+targeted+mutagenesis+with+CRISPR-Cas9+system+in+the+pea+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An integrated protocol for targeted mutagenesis with CRISPR-Cas9 system in the pea aphid.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 110, 34-44 (2019).</li>
</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

초파리 배아는 세포 및 유기체 생물학의 근본적인 질문을 연구 할 수있는 강력하고 편리한 모델입니다. 상대적으로 단순하고 강력한 유전학 및 크기가 작기 때문에 세포 과정과 발달을 이미징하는 데 탁월한 시스템입니다. 여기서, 표준 미세주입 프로토콜은 배아에서 FP 사용을 가능하게 하도록 적응된다. 이 접근법은 유전적으로 인코딩 된 형광단을 필요로하지 않고 특정 세포 구조의 형광 이미징을 허용하여 이미징에 많은 유전 적 배경을 열어줍니다. 여러 염료와 전략적으로 선택된 형광 태그가 지정된 단백질을 결합하면 가시광선의 전체 스펙트럼에 걸친 다중 채널 라이브 이미징을 열 수 있습니다.
프로토콜의 중요한 단계: 이 프로토콜은 BODIPY 493/503을 사용하여 LD에 라벨을 붙입니다. 이 접근법은 다른 세포 구조를 표시하도록 쉽게 적응될 수 있다. 후속 이미지 분석을 위해, 가장 중요한 인자 중 하나는 신호 대 잡음비, 즉 배경 신호와 비교된 염료의 밝기이다. 리소좀은 도 2, 도 3, 도 4, 도 5에 도시된 바와 같이, 미토콘드리아(Mitoview 633, 200 μM), ER(ER 트래커 그린, 10 μM), 및 미세소관(DMSO 중의 SiR 튜불린, 200 nM)뿐만 아니라 성공적으로 이미지화되었다(LysoTracker Red, 1 mM), 뿐만 아니라 ER(ER 트래커 그린, 10 μM), 및 미세소관(DMSO 중의 SiR 튜불린, 200 nM)도 5에 도시된 바와 같다. 또한, 노른자 소포는 자가 형광성이며 UV 여기 시 청색광을 발산한다(여기 파장으로 405nm를 사용하는 이미지(그림 6)). 다른 염료의 경우, 염료 농도가 배양된 세포를 염색하는 데 필요한 것의 100-1,000x가 되는 것을 목표로 한다. 이것은 세포 배양 배지로 희석될 원액의 농도와 유사하다. 이 프로토콜은 100 fL의 주사를 요구하고 초파리 배아는 부피18에서 대략 9 nL이기 때문에, 이들 염료 농도는 세포 배양 배지에 존재하는 것의 1/100 미만의 내부 배아 농도로 평균화될 것이다. 일시적으로, 국소 농도는 주사 부위에서 더 높을 것이며, 이는 잘 확산되지 않는 FP (즉, 미토콘드리아 염료 및 SiR-튜불린)와 가장 관련이 있습니다. 이러한 FP의 경우 권장 고농도에서 시작하십시오. 예기치 않은 사망이 관찰되면 생존과 신호 강도 사이의 수용 가능한 타협에 도달 할 때까지 연속적으로 두 배로 희석하십시오.
여러 염료를 공동 주입 할 때 두 염료 모두 동일한 용매에 있거나 용매와 염료 모두 혼합물과 호환되어야합니다 (~ 10 %를 초과하는 알코올 농도는 권장되지 않음).
바늘의 품질은 팁이 가능한 한 미세해야하기 때문에이 절차의 성공에 필수적입니다. 그렇지 않으면, 주사 상처로부터의 손상은 배아의 후속 발달을 손상시킬 수 있습니다. 상업용 바늘 풀러가 다르기 때문에 제조업체의 제안을 따르고 원하는 모양이 달성 될 때까지 여러 당김 매개 변수를 시도하는 것이 중요합니다. 금이 가거나 들쭉날쭉하거나 큰 보어 바늘 팁으로 작업하면 성공적인 주입이 더 어렵거나 불가능해질 수 있으므로 품질 관리 단계 1.1.3을 수행하는 것이 중요합니다.
배아는 주사 중에 추가 부피의 액체가 첨가 될 수 있도록 부분적으로 건조되어야합니다. 배아가 건조되지 않으면 바늘이 쉽게 들어 가지 않으며 바늘이 침투하거나 용액이 주입 될 때 세포질이 분출됩니다. 배아가 과도하게 건조되면 수축 된 것처럼 보이고 제대로 발달하지 않습니다. 정확한 건조 시간은 공기 습도와 같은 지역 조건에 따라 다르며 날마다 바뀔 수 있습니다. 각 세션에 대해 경험적으로 결정되어야합니다.
미세 주사 후 배아가 생존 할 수있는 능력은 바늘의 품질, 적절한 건조 및 주사 부피를 1pL (이상적으로는 100 fL) 미만으로 제한하는 데 결정적으로 달려 있습니다. 이러한 파라미터가 최적화되는 한, 기술된 염료가 권장 농도로 주입될 때 유의한 독성은 명백하지 않다. 배아가 건조 및 주사 단계에서 생존하는 경우, 그들은 전형적으로 세균 밴드 확장으로 성공적으로 잘 발달하며, 예외는 높은 수준에서 세포화 결함을 일으킨 미세 소관 및 ER 프로브입니다 (각각의 스톡 농도의 100 fL 주입). 테스트 결과 DMSO, 물 및 두 혼합물이 권장 부피로 주입되었을 때 명백한 발달 결함이 발견되지 않았으며 배아 생존율은 ~ 75 % 이상의 생식 밴드 확장을 통해 발견되었습니다. 1 pL 이상의 주입 부피는 결함을 일으켰고 ~ 4 pL 부피로 주입 된 배아는 1 시간 미만 동안 개발되었습니다. 따라서 주입량을 낮게 유지해야 하며, 이는 염료 농도가 높아야 함을 의미합니다.
일반적으로 배아의 측면 가장자리를 따라 주사하는 것이 가장 적은 손상을 초래하므로 권장됩니다. 그러나, 주입 부위는 채용된 FP들의 확산 특성에 따라 조정될 필요가 있을 수 있다. BODIPY 493/503 및 LysoTracker는 Lipid Spot 610 (LD를 표시하는 또 다른 염료)보다 전체 배아에 걸쳐 더 빠르게 확산되는 반면, SiR-Tubulin 및 Mitoview 633은 배아 전체에 완전히 확산되지 않습니다 (주사 후 7 시간 늦게 이미징). 따라서, 관심 부위 내 또는 그 근처에서 주사가 필요할 수 있다. 전방 또는 후부 부위에 주사 할 때 특히 미세한 바늘을 사용하는 것이 좋습니다.
이미지 수집은 공초점 현미경에 의존하여 광학적으로 단면화하고 작은 소기관과 모든 세포 골격 성분을 해결합니다. 많은 이미지들(예를 들어, STORM 또는 PALM)의 분석을 필요로 하는 기술들은 배아 내용물이 움직이고 형광단이 광스위칭에 최적화되어 있지 않기 때문에 작동하지 않을 것이다. Epifluorescence 현미경 검사는 대부분의 소기관과 더 작은 세포 구조를 만들기 위해 측면 및 축 방향 분해능이 부족합니다. 이러한 이유로 공초점 현미경을 사용하거나 라이트 시트 기술을 사용하는 것이 좋습니다.
이미지 분석의 재현성은 일관된 이미징 데이터에 크게 의존합니다. 가장 큰 성공 기회를 위해서는 사출 기술의 최적화와 이미지 획득이 필요합니다. 관심있는 염료(들), 주사 부위, 배아의 나이, 주사량, 및 획득 설정이 모두 일관되는 기술을 확립하고 실천하는 것은 이미지 분석을 위한 가장 강력한 데이터를 생성할 것이다.
방법의 수정 및 문제 해결 이 프로토콜은 입자 이미지 속도법을 사용하여 절단 단계 배아에서 LDs의 벌크 유동을 분석하는 방법을 시연한다. 동일한 접근법이 다른 소기관, 다른 발달 단계 및 기타 분석 방법에 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 도 2 는 BODIPY 493/503 및 LysoTracker Red를 공동 주입하여 시각화된 배아 발생의 동기화 단계에서 흐르는 LDs 및 산성 소기관의 분석을 보여준다. 수정 후 최대 7 시간까지 배아에서 LD 운동의 성공적인 이미징이 달성되었습니다. 이 배아는 주사 상처를 유지하지만 몇 시간 동안 발달 할 수 있습니다.
이 프로토콜을 사용하여 수집된 데이터는 입자 이미지 속도측정에 사용되었지만 다른 많은 분석 기술을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, ImageJ, Imaris 또는 수동 추적에서 발견되는 것과 같은 입자 추적 프로그램을 사용하여 이동 구조물의 속도와 방향을 얻을 수 있습니다. 대부분의 이러한 추적 소프트웨어는 평면 세포 배양 시스템의 데이터로 작동하도록 제작되었으며 Drosophila 배아와 같은 3D 구조에 항상 잘 적응하지는 않습니다. 또한, 최고 품질의 입자 추적 데이터를 생성하려면 여러 Z 평면을 이미지화해야 합니다. 이것은 이미지 스택 획득 시간이 ~ 2 초 미만인 경우 실현 가능해야합니다. 이 벤치 마크는 회전 디스크 공초점, 격자 라이트 시트 및 최근 레이저 스캐닝 공초점 시스템에서 도달 할 수 있어야합니다. 그러나, LDs, 미토콘드리아, 및 리소좀과 같은 풍부한 소기관에 대한 입자 추적의 실현 가능성은 현재의 추적 방법에 비해 시야에서 양성 신호의 양이 너무 높기 때문에 낮다. 핵 또는 노른자 소포와 같은 덜 풍부한 구조의 추적이 가능할 수 있습니다. 유동 분석을위한 PIV는 두 소기관이 자유롭게 움직이기 때문에 절단 단계에서 LD 및 산성 소기관에 잘 작동합니다. 핵, ER 및 미토콘드리아와 같은 소기관은 다른 세포 구조에 묶여 있으므로 자유롭게 움직이지 않으며 자유 운동을 가정하는 소프트웨어 분석에 적합하지 않습니다. 조사관은 관심있는 소기관에 가장 적합한 기술을 선택해야합니다.
세포융합 및 세포 배반배엽 단계 동안, LDs(뿐만 아니라 일부 다른 소기관)는 방사상 배향된 미세소관(5)을 따라 움직인다. 따라서 단일 미세소관이 장거리에 초점이 맞춰져 있는 단면도( 그림 5와 같이)를 찾을 수 있으므로 2D에서 입자 추적이 가능합니다. 이러한 광평면은 배아 내 깊숙이 있기 때문에 전체 신호 강도가 감소하고 신호 대 잡음비가 감소합니다.
추적 분석의 경우, 가능한 한 빨리 이미징하면 운동성 기계의 움직임과 그에 따른 중요한 세부 사항을 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 지질-액적 운동은 두 개의 운동성 상태, 즉 느린 짧은 움직임(~200nm/s; 평균 이동 거리 ~100nm)과 빠른 긴 운동(~450nm/s; 평균 이동 거리 ~1,000nm)19의 혼합물이다. 따라서 이미지가 매초마다 또는 덜 자주 촬영되면 느린 짧은 상태를 감지 할 수 없게됩니다. 그러나 빈번한 이미징은 형광단 표백 및 광독성을 유도합니다. 따라서 이미징 조건은 해결해야 할 정확한 질문에 따라 조정되어야 합니다.
방법의 제한 사항 원하는 염료에 따라, 상기 방법은 염료 용해도와 주사 용액의 독성 사이의 상용성에 의해 제한될 수 있다. 이소프로판올과 에탄올과 같은 알코올은 점도가 낮기 때문에 바늘 내에서 다루기가 어렵고 세포 성분을 손상시키고 배아를 죽이는 것처럼 보입니다.
이 방법은 또한 주사를 위해 배아를 준비하는 데 30 분 이상 걸리기 때문에 배아 발생의 초기 단계를 시각화하는 데 적합하지 않습니다. 실온에서 배아의 초기 세포주기는 각각 ~ 10 분 길이입니다. 따라서 5.2.3 단계에서 새로 수정 된 난자를 선택하더라도 배아가 이미징 할 준비가되면 처음 몇 개의 세포주기가 이미 완료 될 것입니다.
UV/청색 범위의 빛을 사용한 조명은 장파장보다 훨씬 더 광독성이 높습니다. 이러한 조건 하에서(예를 들어, 자가형광성 노른자 소포를 따르기 위해; 그림 6), 이미징 시간을 제한하거나(시계열 단축으로 이어짐) 레이저 전력을 더 낮게 사용해야 합니다(신호 대 잡음비 감소).
세포화 후, 특정 위치에 주입 된 염료는 많은 세포막을 통과해야하기 때문에 잘 확산되지 않는 경향이 있습니다. 이것은 후기 발달 단계에서 관찰 영역을 제한합니다.
기존 / 대체 방법과 관련된 방법의 중요성 초기 배아에서 LDs 및 다른 지질 함유 소기관의 움직임은 유전적으로 인코딩된 형광단, 라벨-프리 기술, 및 FPs의 도입에 의해 시각화될 수 있다. 후자는 비텔린 멤브레인(12 )의 투과화 또는 여기에서 논의된 미세주입 접근법에 의해 달성될 수 있다.
유전적으로 코딩된 형광단은 다목적 마커이며, 그의 수준은 전형적으로 배아에서 배아로 고도로 재현가능하다. 그러나 FP보다 양자 수율이 낮고 표백제가 더 쉽습니다. 일반적으로 하나 또는 두 개의 태그가 지정된 버전(예: GFP 또는 mCherry)에서만 사용할 수 있으므로 어떤 구조를 동시에 이미징할 수 있는지 선택할 수 있습니다. 반면에 FP는 종종 다양한 형태로 존재합니다. 예를 들어, UV/청색 스펙트럼의 오토닷(Autodot)에서 원적색 스펙트럼의 지질톡스 및 LipidSpot 610에 이르는 방출 스펙트럼과 함께 다양한 지질-액적 특이적 염료를 사용할 수 있다. FPs는 또한 관심있는 임의의 균주에 직접 적용될 수 있으며, 따라서 예를 들어 원하는 소기관 마커를 관심있는 돌연변이 균주 내로 도입하기 위한 균주 구축을 필요로 하지 않는다. 이 장점은 여러 구조체를 동시에 레이블 지정해야 할 때 특히 두드러집니다. 여러 세대에 걸친 시간이 많이 걸리는 십자가 대신에, 이것은 관련 염료를 혼합하고 동시에 도입함으로써 하루 만에 달성 될 수 있습니다. 마지막으로, 세포 과정이 약리학 적 억제로 프로브되는 경우, 약물과 염료가 함께 도입 될 수 있습니다.
라벨이 없는 방법은 특정 세포 구조를 검출하기 위한 매우 강력한 접근법이다. 예를 들어, LDs는 세 번째 고조파 생성 현미경(20 ) 또는 펨토초 자극된 라만 손실 현미경(21)에 의해 초기 배아에서 특이적으로 검출될 수 있다. FP와 마찬가지로 이러한 접근법은 모든 유전 적 배경에 적용될 수 있으며 표백을 일으키지 않기 때문에 잠재적으로 더 빠른 이미지 수집을 가능하게합니다. 그러나, 이들은 전형적으로 특정 소기관으로 제한되며, 따라서 그 자체로 멀티플렉스 이미징을 지원하지 않는다; 그들은 또한 전문 현미경이 필요합니다.
배아에 소분자를 도입하기위한 두 가지 일반적인 전략이 있습니다. 하나는 여기에 사용 된 미세 주입 접근법입니다. 다른 하나는 비텔린 막을 투과시키는 화학적(terpene) 처리이다. 후자의 접근법12 는 미세 주사보다 덜 관여하지만, 배아에서 배아까지 더 가변적입니다. 또한, 투과 후, 비텔린 막에 의해 제공되는 보호가 손상되고 배아가 외부 배지에 적절하게 접근 할 수있어 생존을 유지하는 것이 더 어려워집니다. 미세 주입은 투과보다 배아 발달을 탈선시킬 가능성이 훨씬 적습니다. 그러나 많은 배아를 동시에 모니터링해야하는 경우 (예 : 약물 스크리닝 목적으로) 투과가 권장됩니다. 세포 구조의 움직임을 추적하고 이미지 분석에 적합한 재현 가능한 이미지 시리즈를 얻기 위해 미세 주입이 선택 방법입니다.
특정 연구 분야에서이 방법의 중요성과 잠재적 인 적용 초파리 배아는 많은 세포 생물학적 및 발달 과정 1,5,6을 연구하기위한 중요한 모델 시스템입니다. 형광 단백질로 소기관을 태깅하는 것은 초기 배아가 어떻게 발달하는지, 다양한 소기관이 어떻게 교통되는지, 그리고 그러한 밀매가 발달 및 유 전적으로 어떻게 조절되는지에 대한 이해에 큰 기여를했습니다. 그러나 표백제에 대한 성향과 여러 소기관이 다른 색상으로 표시된 균주를 생성하는 어려움은이 접근법의 적용을 제한합니다. 미세 주입에 의해 도입 된 FP의 사용은 이러한 많은 문제를 해결하고 형광 태그가 지정된 단백질과 결합 될 수도 있습니다. 이 기술은 모든 유전 적 배경에서 여러 소기관, 세포 구조 및 세포 골격 구성 요소의 이미징을 허용합니다. 결과적으로 라이브 이미징을 통해 여러 유전자형을 비교할 수 있으므로 돌연변이가 여러 소기관의 밀매에 미치는 영향을 결정할 수 있습니다.
이 프로토콜은 초파리 멜라노가스터의 배아에 대한 FP 주입 접근법을 보여 주지만, 원칙적으로이 접근법은 초파리 (Drosophila), 귀뚜라미22 및 진딧물23의 다른 종을 포함하여 미세 주사 기술이 확립 된 모든 곤충 알에 적용됩니다.

중요한 염료와 분자 프로브는 특정 세포 구조와 소기관을 이미지화하는 강력한 도구입니다. 초파리 배아에서 많은 다른 소기관은 세포 골격 주도 국소화 1,2,3,4를 나타내지 만, 달걀 껍질이 많은 사람들에게 침투 할 수 없기 때문에 이러한 작은 분자의 적용은 어렵습니다. 이 프로토콜은 소기관의 대규모 밀매를 검출하기 위해 미세주입을 통해 살아있는 배아에서 형광 프로브(FPs)를 사용하는 방법을 기술한다. 이 절차는 주사 용액의 준비, 난자 수집 및 배아 준비, 미세 주사, 이미징 및 이미지 분석을 다룹니다.
소기관의 극적인 공간 재배열은 많은 동물 난모세포, 난자 및 배아에서 흔히 볼 수 있는데, 부분적으로는 이러한 세포의 크기가 크기 때문입니다. 초파리 배아에서, 예를 들어, 지질 방울 (LDs) 및 노른자 소포는 세포화 직전에 배아 중심을 향해 이동한다5. 이 움직임은 미세 소관에 의존하며 두 소기관의 고갈 된 배아의 주변부 주위에 ~ 40 μm 영역을 남깁니다. 초기 절단 단계 동안, 많은 소기관은 배아 표면(6)에서 액틴-미오신-기반 수축에 의해 구동되는 세포질 흐름에 의해 수송된다. 많은 종의 배아가 유사한 재배열을 나타내지 만, 초파리 배아는 표준 실험실 '실온'에서 외부에서 발달하고, 상대적으로 투명하고, 대부분의 현미경 설정에 적합 할만큼 충분히 작으며, 강력한 유전 도구를 사용하여 조작 할 수 있기 때문에 이미징을 통해 이러한 과정을 따르는 데 특히 적합합니다.
일부 소기관의 경우, 이러한 구조를 특이적으로 표지하는 형광 태그가 붙은 단백질이 이용가능하다. 예를 들어, LSD-2 (dPLIN2라고도 함)는 배아에서 LDs7을 특이적으로 표적으로 하는 단백질이다. 플라이 라인은 녹색 형광 단백질 (GFP)과 LSD-28 사이의 융합을 코딩하는 유도성 전이유전자 또는 황색 형광 단백질 (YFP)이 내인성 LSD-2 유전자 9,10의 코딩 영역에 삽입되는 유전자 트랩을 운반하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 접근법은 이러한 융합 단백질이 낮은 양자 수율을 가지며 쉽게 표백하는 경향이 있다는 것을 포함하여 한계가 있다. 또한 여러 개의 서로 다른 구조를 동시에 표지하는 것은 어려울 수 있습니다 : 많은 소기관의 경우 현재 한 가지 유형의 형광 태그 (종종 GFP 또는 mCherry) 만 사용할 수 있으므로 동시에 두 개의 소기관을 이미징하려면 새로운 전이유전자 또는 삽입이 필요할 수 있습니다. 또한 호환 가능한 태그를 사용할 수 있더라도 단일 변형에 태그를 도입하려면 시간이 많이 걸리는 크로스가 필요할 수 있습니다. 또한 많은 강력한 유전 자원을 덜 편리하게 사용할 수 있습니다 (예 : 두 개의 소기관 마커, Gal4 드라이버 및 유도성 RNAi 구축물이 모두 동일한 어머니에 존재해야하는 경우).
원칙적으로, 이러한 제한은 필수 염료 (예를 들어, 리소좀을 표시하는 LysoTracker), 분자 프로브 (예를 들어, 미세소관을 표지하는 SiR-튜불린), 및 형광 표지된 생물학적 분자 (예를 들어, 지방산 대사를 프로브하는 C12 BODIPY11)를 포함하는 FPs의 사용으로 극복될 수 있다. 배양 된 세포에서의 사용으로부터, 그들은 일반적으로 세포 생물학을 조사하기위한 강력한 도구로 잘 검증됩니다. FP는 다재다능하고 우수한 사진 특성을 가지며 형광 단백질과 호환됩니다. 여러 염료를 동시에 혼합하고 적용 할 수 있으며, 종종 스펙트럼의 보라색 / 파란색 및 원적색 영역으로 분리되고 작은 Stokes 이동이 가능하여 채널 출혈을 방지합니다. 작은 스토크스 시프트를 통해 여러 이미징 채널을 동시에 캡처할 수 있으므로 여러 소기관을 한 번에 추적할 수 있습니다. 마지막으로, 그들은 다른 초파리 종의 배아 또는 형광으로 태그 된 단백질을 사용할 수없는 다른 곤충의 소기관을 표지하는 데 똑같이 적용될 수 있습니다.
그러나 이러한 FP의 대부분은 초파리 배아의 정교한 달걀 껍질을 통과 할 수 없습니다. 그것은 다섯 개의 층으로 구성된다: 기계적 손상을 방지하는 세 개의 외부 융모층(chorion)과 화학적 배리어(12)를 생성하는 비텔린 멤브레인을 둘러싸는 왁스 층. 단순화를 위해, 왁시 층과 비텔린 막의 조합은 아래의 "비텔린 막"으로 지칭될 것이다. 달걀 껍질을 우회하기 위해이 프로토콜은 초파리 배아에 FP를 도입하기 위해 확립 된 배아 미세 주입 접근법 을 채택합니다 . 이 프로토콜은 절단 단계 배아에서 LDs의 세포질 흐름을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 주사 바늘과 계란 수집 케이지의 준비, 계란 수집 과정 및 chorion의 기계적 제거가 포함됩니다. 배아를 미세 주입하고 이미지화하는 방법과 입자 이미지 속도 측정 (PIV,6에서 적응)을 사용하여 LD의 벌크 흐름을 분석하는 방법에 대해 설명합니다. 배아 생존을 보장하고 이미징을위한 최상의 시스템을 만들기 위해 문제 해결에 대한 조언을 제공합니다. 또한 프로토콜이 LDs 및 미세소관을 동시에 이미지화하거나 리소좀, 미토콘드리아, 노른자 소포 및 소포체 (ER)를 포함한 다른 소기관의 연구에 적용되도록 변형 될 수있는 방법이 논의됩니다.

<table><tbody><tr><td>AUTODO</td><td>abcepta</td><td>SM1000a</td><td>염색 지질 방울 보라색/파란색</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>ThermoFisher</td><td>D3922</td><td>염색 지질 방울 녹색</td></tr><tr><td>건조제 비드 &ndash; 건조제-무수 표시 드리어라이트</td><td>W.A. Hammond Drierite Company</td><td>21001</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경 SteREO DiscoveryV20 트랜스 조명 베이스</td><td>Zeiss</td><td>4350030000000000</td><td></td></tr><tr><td>양면 테이프-영구 양면 테이프</td><td>스카치(3M)</td><td>-</td><td>많은 공급업체에서 판매</td></tr><tr><td>ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)</td><td>ThermoFisher</td><td>E34251</td><td>ER 염색/ 핵 엔벨로프</td></tr><tr><td>Femptotip II</td><td>Eppendorf</td><td>H129354N</td><td>사용 준비 완료</td></tr><tr><td>유리 모세관 -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td>Must be pull</td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>-</td><td>-</td><td>당신의 대물 렌즈에 적합한 굴절률을 구입하십시오</td></tr>. <tr><td>유리 슬라이드 -Double Frosted Microscope Slides 사전 청소</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>할로 카본 오일 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773-100ML</td><td></td></tr><tr><td>할로 카본 오일 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898-50ML</td><td></td></tr><tr><td>헵탄 친환경 대안 무수, 99 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>246654-1L</td><td>헵탄은 미국 OSHA</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>Sp5</td>에 의해 독성으로 간주됩니다. 다양한 <td>유형의 컨 포칼 현미경이 작동합니다.</td></tr><tr><td>LipidSpot 610</td><td>Biotium</td><td>#70069</td><td>지질 방울을 원적색으로 염색</td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>염색 리소좀을 빨간색으로 염색</td></tr><tr><td>MitoView 633</td><td>Biotium</td><td>#70055</td><td>염색 미토콘드리아</td></tr><tr><td>니들 로딩 피펫 팁 - 20uL 마이크로로더 팁</td><td>Eppendorf</td><td># 5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>P-1000, 차세대 마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>사용된 설정은 heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1입니다. 그들은 가열의 강도와 길이, 당기는 힘의 타이밍 및 힘이 선형으로 적용되는지 여부를 나타냅니다. 이러한 조건을 사용하여 하나의 모세관은 끝에 미세한 구멍이 있는 두 개의 사용 가능한 바늘을 생성합니다.</td></tr><tr><td>SiR-Tubulin</td><td>Cytosketon Inc</td><td>CY-SC014</td><td>Spirochrome에 의해 만든; Cytoskeleton Inc.는 북미 유통업체입니다. 미세소관을 원적색으로 염색</td></tr><tr><td>TransferMan</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; 5178 NK</td><td></td></tr><tr><td>ViaFluor 405</td><td>Biotium</td><td>#70064</td><td>미세소관 염색 보라색/파란색</td></tr></tbody></table>

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

초기 초파리 배아는 전통적인 및 배아 특이적 소기관의 광대 한 배열을 포함하는 큰 세포입니다. 배아 발생의 처음 세 시간 동안,이 소기관은 액틴 기반 세포질 스트리밍 및 미세 소관을 따라 모터 구동 밀매에 의해 구동되는 극적인 움직임을 겪습니다. 다수의 작은 소기관 특이적 형광 프로브(FP)의 개발은 모든 유전자형에서 광범위한 상이한 지질 함유 구조를 시각화할 수 있게 해주며, 유전적으로 인코딩된 형광단을 필요로 하지 않고도 라이브 이미징을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 살아있는 이미징에 의해 특정 소기관의 밀매를 모니터링하기 위해 Drosophila 배아에 중요한 염료와 분자 프로브를 주입하는 방법을 보여줍니다. 이 접근법은 지질 방울 (LD)을 라벨링하고 입자 이미지 속도 측정 (PIV)에 의한 벌크 이동을 따름으로써 입증됩니다. 이 프로토콜은 리소좀, 미토콘드리아, 노른자 소포 및 ER을 포함한 다른 소기관의 연구에 적합한 전략을 제공하고 미세 소관을 따라 개별 LD의 움직임을 추적합니다. 상업적으로 이용 가능한 염료를 사용하면 스펙트럼의 보라색 / 청색 및 원적색 영역으로 분리의 이점을 얻을 수 있습니다. 미세주사를 통해 소기관 및/또는 세포골격 요소의 멀티플렉스 공동 표지에 의해, 초파리 의 모든 유전 자원은 형광 태그가 붙은 단백질을 도입할 필요 없이 밀매 연구에 사용할 수 있다. 낮은 양자 수율과 표백제를 쉽게 갖는 유전적으로 인코딩 된 형광단과는 달리, 사용 가능한 염료 중 많은 부분이 높은 광자 수율로 여러 채널을 신속하고 동시에 캡처 할 수 있습니다.

주사 후, 염료는 바늘 팁이 삽입된 부위에서만 국소화될 것이다. 염료는 확산 특성에 따라 주사 부위에서 멀리 확산됩니다. 그림 1은 BODIPY 493/503의 주입을 보여주며, 주사 직후(패널 A)와 24분 후(패널 B)를 보여줍니다. 24 분 후, 염료는 배아의 긴 축의 중간 지점까지 대략 만들었습니다.
소기관 운동성 분석은 염료 주입 및 타임랩스 이미징을 통해 달성될 수 있다. 도 2에서, 배아를 BODIPY 493/503 (도 2A) 및 LysoTracker Red (도 2B)과 공동 주사하고, 각각 488 및 596 nm에서의 레이저 여기를 사용하여 이미지화하였다. 이 배아를 이어서 타임랩스 영상화하였다(30분 동안 30초마다 한 프레임씩 분석). 그런 다음 시계열은 PIV 분석을 통해 실행되었으며, 출력은 그림 2A, B의 유선형을 통해 표시됩니다. 유선형은 개별 입자의 궤적을 나타내는 것은 아니지만 세포질 흐름은 세포질의 해당 영역에있는 모든 입자를 분석함으로써 추론됩니다. PIV 분석은 두 개의 독립적 인 세포 구조 (LD 및 산성 소기관)의 표지를 통해 유사한 흐름을 발견하며, 두 라벨 모두 세포질이 배아의 내부로 유입되는 배아의 중앙 영역에 수렴합니다6.
현재 이용 가능한 FP는 많은 다른 소기관 및 세포 구조의 라벨링을 허용한다. 그림 3 은 ER 추적기 Green을 통한 ER의 라벨링을 보여줍니다. ER 추적기는 핵 외피의 좋은 해상도를 제공하여 주요 세포 주기 단계를 시각화할 수 있습니다. ER 트래커 그린은 488nm 여기를 사용하여 이미지화됩니다.
미토콘드리아의 라벨링은 시험된 대부분의 염료가 그들이 들어가는 첫 번째 미토콘드리온에 갇혀있는 것처럼 보이기 때문에 까다롭습니다. 한편, 염료 독성의 징후가 검출되지 않았고, 세포화 및 외배엽 핵 사이클 15를 통해 표지된 미토콘드리아를 따를 수 있게 되었다. 도 4 는 Mitoview 633 (여기 파장 633 nm)으로 주사 후 몇 시간 후에 외배엽 세포를 도시한다.
BODIPY, Lysotracker 및 LipidSpot은 견고하며 512 x 512, 라인 평균 3, 프레임 속도 1/s ~ 0.1/s에서 ~ 500 + 이미지를 획득하는 데 사용할 수 있습니다. ER 트래커 Green, SiR-tubulin 및 언급 된 미토콘드리아 염료는 덜 견고하며 동일한 조건에서 ~ 50-200 개의 이미지를 생성합니다.
blastoderm 단계에서 시작하여 LD는 반대 극성 모터 kinesin-1 및 세포질 dynein5에 의해 구동되는 미세 소관을 따라 양방향으로 움직입니다. 이 움직임은 BODIPY 493/503 및 SiR-Tubulin을 모두 주입하여 LD와 미세 소관을 공동 라벨링하여 시각화할 수 있습니다(그림 5). LD가 자주 이동 방향을 역전시키기 때문에(키네신-1과 세포질 다이닌 사이를 전환할 때), 획득 중에 프레임 속도가 높을수록 LD 운동성에 대한 중요한 세부 사항을 더 잘 포착할 수 있습니다.
자가 형광 노른자 소포의 라이브 이미징은 어떤 형태의 염료 주입 없이도 가능합니다 (그림 6). 그러나, 자가형광은 희미하고, 여기 레이저는 광독성이다. 따라서, 자가형광 노른자의 라이브 이미징은 염료 주입에 비해 불량한 신호 대 잡음비를 갖는다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig01.jpg"> 그림 1: 배아를 통한 BODIPY 493/503의 확산. 염료는 전방 말단 (오른쪽 상단)을 향한 측면 가장자리를 따라 주사되었고,이 주사 부위에서 배아로 확산되어 LDs를 표지합니다. (A) 염료는 주사 부위에 인접한 배아의 일부를 통해 확산되었습니다. (B) 대략 24분/2회의 핵 사이클 후에, 염료는 배아의 중간점을 지나서 확산되었다. 스케일 바: 100 μm. 1024 x 1024 프레임(라인 평균 4)은 30초마다 획득되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig02.jpg"> 그림 2: LD 및 산성 소기관에 대한 입자 이미지 속도측정(PIV) 배아에 BODIPY 493/503 및 LysoTracker Red를 모두 주사하였다. (A) 보디피 채널. (B) 리소트래커 레드 채널. (A', B') A와 B에 표시된 것을 포함하여 10개의 순차적 프레임에서 생성된 두 채널의 PIV 분석에 의해 생성된 간소화된 다이어그램. A'는 LD의 흐름에 해당하고, B'는 산성 소기관의 흐름에 해당한다. A'와 B' 모두 배아 내용물이 시야에서 배아의 중앙으로 흘러 나오는 왼쪽 중심 합류를 보여줍니다. 또한 BODIPY는 다른 염료가 다른 확산 특성을 가지고 있기 때문에 LysoTracker보다 더 많이 확산되었습니다. 스케일 바: 100 μm. 1024 x 1024 프레임(라인 평균 4)은 30초마다 획득되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig03.jpg"> 그림 3: ER 추적기는 동기화 핵 분열을 라벨로 표시합니다. 세포융합 배반엽 배아를 ER 추적기로 미세 주입하고 그 표면의 일부를 시간이 지남에 따라 영상화하였다. (A) 핵 분할 중 스핀들 조립. (B) 동일한 분할 동안 핵 봉투의 압수. (c) 후속 인터페이즈. (D) 다음 분할의 시작은 중심 모양 (화살촉으로 표시된 원형 ER 프리 영역의 발생)으로 표시됩니다. 점진적인 염료 표백에 유의하십시오. 여기 파장: 488 nm. 스케일 바: 5 μm. A: 초기 프레임, B: 3분 경과 , C: 10분 경과 및 D: 13분 경과 1024 x 1024 프레임(라인 평균 4)은 30초마다 획득되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig04.jpg"> 그림 4: 미토콘드리아의 Mitoview 633 표지. 배아를 세포질 배반배엽 단계 동안 Mitoview 633과 함께 주사하고, 세포화 후 4시간 후에 영상화하였다. 이미지는 배아 밴드 확장에서 배아의 신경 외배엽 세포를 보여줍니다. 스케일 바: 5 μm. 1024 x 1024 프레임(라인 평균 4)은 30초마다 획득되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig05.jpg"> 그림 5: LDs 및 미세소관의 공동 표지. 세포화 배아에 BODIPY 493/503 (황색 A, B, C) 및 SiR 투불린 (마젠타 A', B', C')의 혼합물을 주입하였다. A'', B'', C'' 는 병합된 채널을 표시합니다. 패널 A, A' 및 A'''는 초기 프레임을 표시하고, 패널 B, B' 및 B'''는 5초 후에 프레임을 표시하고, 패널 C, C' 및 C ''는 10초 후에 프레임을 표시합니다. 스케일 바: 5 μm. 512 x 512 프레임(라인 평균 3)은 2.5초마다 획득되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63291/63291fig06.jpg"> 그림 6: 동기화 절단 단계 동안 노른자 소포 자기 형광 이미징 . (A) 획득 시작시. (B) 8분 후 (C) 16분 후 여기 파장: 405 nm. 낮은 여기 강도는 배아를 살아 있게 하기 위해 사용되었다. 스케일 바: 100 μm. 1024 x 1024 프레임(라인 평균 4)은 30초마다 획득되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/63291fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 데이터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63291/PIV_analysis_script_Kilwein_Welte_JoVE_2021.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

초기 초파리 배아에서는 많은 소기관이 운동성입니다. 원칙적으로, 그들은 특정 형광 프로브를 통해 실시간으로 이미징 될 수 있지만, 달걀 껍질은 배아에 직접 적용하는 것을 방지합니다. 이 프로토콜은 미세주입을 통해 이러한 프로브 를 도입한 다음 입자 이미지 속도측정법을 통해 벌크 소기관 움직임을 분석하는 방법을 설명합니다.

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

초기 초파리 배아에서는 많은 소기관이 대규모 운동을 겪습니다. 우리의 프로토콜은 세포 배양을 위해 개발 된 형광 염료를 사용하여이 움직임을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 형광 단백질에 비해, 상업적으로 이용가능한 형광 프로브는 더 밝고 스펙트럼의 더 넓은 범위에 걸쳐 있다.그들은 멀티플렉스 공동 표지를 허용하고 모든 유전 적 배경에서 사용할 수 있습니다. 배아를 건조시키는 데 얼마나 오래 걸리는지 알기 위해서는 연습과 시행 착오가 필요하므로 주사 중에 파열되거나 말라서 발달을 멈 춥니 다. 시작하려면 바늘 풀러의 모세관 홀더에 모세관을 놓고 날개 너트를 사용하여 고정하여 주사 바늘 준비를 시작하십시오.모세관의 중심을 발열체와 맞춥니다. 제조업체의 지침에 따라 바늘 풀러에서 적절한 설정을 선택하십시오. 해부 현미경을 사용하여 품질 관리 테스트를 수행하십시오.바늘을 공중에 매달린 바늘 끝으로 퍼티에 수평으로 누르십시오. 바늘을 뚜껑으로 덮고 사용할 때까지 보관하십시오. 마이크로 피펫에 부착 된 바늘 로딩 팁을 사용하여 기포를 포획하지 않고 주사 용액 한 마이크로 리터를 팁에 그립니다.장갑을 사용하여 바늘을 한 손으로 잡고 팁이 멀어지도록 잡고 로딩 팁을 삽입하십시오. 바늘 팁 근처에 액체를 분배하고 피펫을 제거한 다음 액체가 팁으로 흐를 때까지 바늘을 수직으로 잡으십시오. 염료의 표백을 방지하기 위해 바늘 끝을 손상시키지 않고 알루미늄 호일로 용기를 덮으십시오.전사 피펫 또는 마이크로 피펫터를 사용하여 직사각형 커버 슬립의 중앙에 작은 헵탄 접착제 방울을 놓고 증발시킵니다. 쵸리온을 기계적으로 제거하기 위해, 적절하게 숙성된 배아 플레이트를 할로카본 오일 27의 얇은 층으로 덮어 달걀 껍질을 투명하게 돌립니다. 트랜스 조명으로 해부 현미경으로 플레이트를보고 배아 단계를 확인하고 절단 단계에서 배아를 선택하십시오.미세한 핀셋을 사용하여 등쪽 부속기를 움켜 잡고 양면 테이프로 덮인 준비된 유리 슬라이드로 옮겨 원하는 단계의 배아를 집어 들으십시오. 배아를 테이프에 올려 놓고 기름의 전달을 최소화하십시오. 배아를 테이프 표면을 가로 질러 부드럽게 굴려 핀셋 끝의 측면을 직접 찌르지 않고 밀어 넣으십시오.chorion이 테이프에 달라 붙고 균열이 생길 때까지 배아를 계속 굴립니다. chorion 균열 후에, 테이프에 붙어있는 chorion에서 그것을 분리하기 위하여 배아를 계속 구르십시오. 배아를 테이프보다 접착력이 떨어지는 chorion에 다시 굴립니다.전달을 위해 핀셋에 부착 될 때까지 핀셋으로 배아를 부드럽게 문지릅니다. 그런 다음 배아를 덮개 슬립으로 옮기고 접착제와 접촉시켜 배아를 제자리에 고정시키고 핀셋에서 분리하십시오. 커버 슬립에서 배아의 방향을 조정하십시오.배아와 함께 커버 슬립을 건조 챔버에 넣고 밀봉하여 배아를 다섯 ~ 12 분 동안 건조하게하십시오. 챔버로부터 커버 슬립을 떼어내고, 할로카본 오일(700)을 한 방울 떨어뜨리고, 배아를 덮어 더 이상의 건조를 방지한다. 해부 범위에서 검사하고 배아가 제대로 건조되면 미세 주사를 진행하십시오.4X 목표를 광 경로에 놓고 현미경의 초점 노브를 사용하여 배아를 초점으로 조정하십시오. 스테이지 컨트롤을 사용하여 배아를 시야의 중앙으로 수평으로 이동합니다. 배아를 시야의 가장자리에 두고 바늘을 낮추기 위해 멀리 치우십시오.동일한 초점 평면을 유지하면서 바늘 끝을 낮추고 배아와 함께 시야에서 볼 수 있도록하십시오. 주사액 중 일부를 할로카본 오일(700)에 분배하여 바늘이 작동하는지 확인하십시오. 성공하면 바늘 끝 근처의 오일에 용액 거품이 나타납니다.스테이지 컨트롤을 사용하여 팁이 배아에 부드럽게 구멍을 뚫고 들어갈 때까지 배아를 바늘 끝쪽으로 움직입니다. 동시에, 바늘 끝의 부위에 일시적인 명확한 반점이 나타날 때까지 주사 용액의 흐름을 시작하여 배아로의 성공적인 용액 전달을 나타냅니다. 슬라이드 홀더를 사용하여 공초점 현미경에 커버 슬립을 고정하십시오.커버 슬립이 깨지기 쉽기 때문에 주의하십시오. 40X 목적으로 공초점 현미경 상의 후피형광 기능을 사용하여 배아를 검사하고 진행하기 전에 배아의 플루오로 4가 보이는지 확인하십시오. 라이브 이미징의 경우 동기화 단계에서 이미지 크기를 512x512픽셀, 라인 평균을 3개, 프레임 속도를 초당 0.1프레임으로 설정합니다.BODIPY 493 503 염료를 주입한 후, 바늘 팁이 삽입된 부위에 국소화한 다음, 주사 부위에 인접하여 확산시켰다. 24 분 후, 염료는 배아의 중간 지점을 지나서 확산되었습니다. 배아에 BODIPY 493 503 및 LysoTracker Red를 주입하여 소기관 운동성을 모니터링하였다.입자 이미지 velocimetry 분석은 배아 내용이 배아의 중앙 영역에 수렴되어 세포질이 배아의 내부로 유입되는 것으로 나타났습니다. ER-Tracker Green을 사용하는 ER의 라벨링은 핵 외피의 생생한 해상도를 제공하여 주요 세포 주기 단계를 시각화할 수 있습니다. 배아를 배반배엽 단계에서 MitoView 633으로 주사하고 4시간 후에 영상화하였다.이미지는 배아 밴드 확장에서 배아의 신경 외배엽 세포를 보여줍니다. 세포화 배아에 BODIPY 493 503 및 SiR Tubulin의 혼합물이 주입되었는데, 이는 지질 방울이 미세소관을 따라 양방향으로 이동한다는 것을 보여준다. 배아는 액체가 주입 될 수 있도록 부분적으로 건조되어야합니다.너무 적은 건조는 주입 할 때 배아가 누출되도록하고, 너무 많은 건조는 배아를 죽일 것입니다. 움직이는 소기관의 비디오는 다양한 이미지 분석 기술을 통해 특성화 될 수 있습니다. 입자 추적은 개별 소기관의 행동을 드러내고, 입자 이미징 속도는 벌크 흐름을 나타냅니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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출처: Wagner, K. et al., eGFP 태그가 지정된 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포의 막 단백질 이동을 연구합니다.J. vis. 특급 (2022). 이 동영상은 eGFP 표지된 TRPL 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 이동을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이미징을 위한 형질전환 파리의 준비, 광수용체 세포의 형광 이미지 캡처, 횡문막에서 상대적 eGFP 형광을 측정하여 TRPL 트래픽의 정량화에 대해 자세히 설명합니다.

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