Rotary Cell Culture System을 사용하여 시뮬레이션된 미세중력에서 림프구 배양

이 기술을 통해 면역 세포에 대한 시뮬레이션된 미세중력의 영향을 연구하여 우주 환경의 측면이 분자 수준에서 인간 생리학에 어떤 영향을 미치는지 더 잘 이해할 수 있습니다. 이 기술은 경제적으로 실현 가능하며 세포 배양을 우주로 보내거나 세포 배양을 지구의 시뮬레이션된 미세 중력에 적용하는 다른 방법에 비해 설정 및 유지 관리가 상대적으로 쉽습니다. 넘침과 유출을 피하기 위해 용기를 채우면서 천천히 이동하는 것이 좋습니다.

초기 기포 제거 후 주사기를 사용하여 용기가 완전히 채워졌는지 확인하십시오. 이렇게 하면 치료 전반에 걸쳐 큰 기포가 형성될 가능성이 최소화됩니다. 플라스틱 포장에서 배양 용기를 꺼내는 것으로 시작하십시오.

사용 중인 세포 유형 또는 라인, 대조군 또는 치료 여부 및 기타 관련 정보에 따라 테두리의 각 용기에 라벨을 붙입니다. 용기를 안정시키고 충전 포트 캡 페그 또는 O-링을 건드리지 않고 충전 포트를 조심스럽게 엽니다. 용기가 채워지는 동안 못이나 O-링이 위를 향하도록 하여 에탄올 패드에 캡을 놓습니다.

주사기 포트에서 캡을 제거하지 마십시오. 멸균 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 배양에 적합한 완전한 배지 10mL를 용기에 넣고 캡을 충전 포트에 조심스럽게 놓습니다. 주사기 포트 캡과 주입 포트가 단단히 닫혀 있는지 확인하십시오.

그런 다음 채워진 용기를 인큐베이터에 넣고 후속 단계를 수행하여 세포 배양을 위한 용기를 프라이밍합니다. 인큐베이터에서 배지 프라이밍 용기를 회수합니다. 플라스크 대조군을 위해, T25 현탁 배양 플라스크에 위에서 제조된 스톡으로부터의 세포 배양물 10 mL를 로딩한다.

주사기를 로드하는 데 사용할 별도의 15mL 원뿔형 튜브에 스톡 세포 배양액 10mL를 추가합니다. 주사기 포트 캡의 나사를 풀어 용기에서 제거하고 스톡 스톱콕이 열린 위치에 있는지 확인합니다. 용기를 안정시키고 충전 포트 캡 페그 또는 O-링을 건드리지 않고 충전 포트를 조심스럽게 엽니다.

용기가 채워지는 동안 페그 또는 O-링이 위를 향하도록 캡을 에탄올 패드에 놓습니다. 스톱콕이 열린 위치에 있는지 확인하십시오. 혈청학적 피펫을 사용하여 용기의 배지를 폐기물 용기에 부어 용기를 비울 수 있습니다.

또는 진공 시스템에 부착된 피펫을 지나 멸균 유리를 사용하여 배지를 흡입합니다. 피펫 또는 진공 시스템을 사용하는 동안 산소 공급 멤브레인을 만지면 손상되고 용기를 사용할 수 없게 될 수 있으므로 만지지 마십시오. 준비된 스톡 세포 배양액이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브를 단단히 닫고 내용물을 완전히 혼합하기 위해 몇 번 부드럽게 뒤집습니다.

신선한 멸균 혈청학적 피펫을 사용하여 50mL 튜브에서 10mL의 세포 배양 스톡을 채취합니다. 용기를 들어 올려 채우기 포트가 위쪽을 향하도록 기울입니다. 그런 다음 세포 배양 스톡을 충전 포트를 통해 용기에 조심스럽게 분배합니다.

엎지르지 않도록 용기를 다시 아래로 기울이면서 용기를 채우기 포트 끝까지 채우십시오. 피펫으로 산소화 멤브레인은 매우 약하므로 만지지 않도록 주의하십시오. 용기에 짐을 싣고 O-링을 건드리지 않고 조심스럽게 충전 포트 캡을 다시 씌웁니다.

패키지에서 처음 3mL 주사기를 꺼내고 몇 번 펌핑하여 풉니다. 그런 다음 주사기를 주사기 포트 중 하나에 부착하여 주사기가 완전히 눌려졌는지 확인합니다. 10mL의 분취량 세포 배양액이 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브를 단단히 닫고 부드럽게 몇 번 뒤집어 내용물을 완전히 혼합합니다.

마찬가지로 패키지에서 두 번째 3mL 주사기를 꺼내 몇 번 펌핑합니다. 그런 다음 이 주사기를 15mL 원뿔형 튜브에서 세포 배양액에 조심스럽게 반담궈 배양액을 끌어냅니다. 주사기를 튜브에 완전히 다시 분배하고 3mL의 배양액을 끌어내어 기포를 최소화합니다.

채워진 주사기를 나머지 주사기 포트에 부착하고 에탄올 패드로 주사기와 주입구 주변을 조심스럽게 소독합니다. 산소 공급 멤브레인에 에탄올을 묻히지 마십시오. 나머지 용기에 대해 이 과정을 반복합니다.

마지막 용기를 위해 50mL 코니컬 튜브에 세포 배양이 약간 부족한 경우 주사기를 로드하는 데 사용된 15mL 코니컬 튜브에서 남은 양을 회수합니다. 주사기에서 혈관으로 세포와 기포의 이동을 제한하기 위해 주사기 포트 스톱콕이 닫혀 있는지 확인하십시오. 용기를 거꾸로 뒤집고 몇 번 옆으로 두드려 초기 거품을 모으십시오.

용기를 다시 위로 향하게 빠르게 뒤집은 다음 반대쪽을 향한 약간의 각도로 기포가 모두 용기의 위쪽으로 뜨도록 합니다. 빈 주사기로 항구 아래의 거품을 조작하고 항구로 들어가기 시작하는 것을 지켜보십시오. 두 주사기 포트 스톱콕을 모두 엽니다.

용기를 부드럽게 두드려 거품이 빈 주사기로 떠오르도록 합니다. 빈 주사기로 더 큰 기포를 천천히 빨아들이면서 전체 주사기를 조심스럽게 눌러 용기의 압력을 유지하여 산소 공급 막이 파열되지 않도록 합니다. 이 과정을 몇 번 반복하여 모든 거품이 제거되었는지 확인합니다.

기포가 효과적으로 제거되면 주사기 포트 마개를 닫습니다. 후속 기포 제거를 위해 치료 중에 주사기를 계속 착용하여 두 주사기의 부피가 거의 동일한지 확인하십시오. 회전하는 베이스와 리본 케이블의 표면을 70% 에탄올로 조심스럽게 닦습니다.

리본 케이블이 전원 공급 장치에 연결되어 있는지 확인합니다. 회전베이스를 인큐베이터에 놓고 리본 케이블을 받침대에 부착합니다. 전원 공급 장치를 인큐베이터 외부에 배치하십시오.

용기 나사산을 회전하는 페그에 정렬하고 베이스의 회전 페그를 시계 반대 방향으로 부드럽게 돌려 SMG 처리 용기를 부착합니다. 용기가 단단히 부착되었는지 확인하십시오. 물 트레이에 오토클레이브 RO 물을 채워 인큐베이터를 약 100% 습도로 유지합니다.

세포가 배지를 통해 떨어지지 않도록 세포의 침강 속도와 일치하도록 인큐베이터의 회전 속도를 조정합니다. 치료를 시작한 첫날, 텍스트 원고에 설명 된대로 몇 시간마다 기포 형성을 확인하십시오. 원하는 치료 기간이 끝날 때까지 적어도 하루에 한 번 거품을 제거하십시오.

계획된 치료 기간이 경과하면 회전을 멈추고 장치를 분해하십시오. 장치의 회전하는 페그를 시계 방향으로 돌리면서 용기를 고정된 상태로 부드럽게 잡고 처리 용기를 제거합니다. 제어 플라스크, 제어 및 처리된 용기를 멸균된 생물학적 안전 캐비닛으로 가져옵니다.

컨트롤 플라스크를 제외한 각 용기를 잡고 뒤집어 아래를 향하도록 합니다. 그런 다음 부드럽게 두드려 모든 세포를 현탁액으로 만듭니다. 그런 다음 충전 포트가 바닥을 향하도록 용기를 옆으로 돌리고 다시 쳐서 효율적인 흡인을 위해 셀을 충전 포트 쪽으로 안내합니다.

각 용기를 개별적으로 취급하십시오. 두 포트에서 주사기의 나사를 풀고 생물학적 위험 폐기물에 분배합니다. 주사기 포트의 마개를 엽니다.

충전 포트 캡을 조심스럽게 제거하고 멸균된 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 내용물을 끌어올리고 용기를 비울 때 기울입니다. 모든 대조군과 처리군의 내용물을 개별적으로 라벨이 붙은 15mL 원뿔형 튜브에 분주합니다. 각 튜브를 닫고 부드럽게 몇 번 뒤집어 제대로 혼합되었는지 확인합니다.

생성된 세포 배양물의 농도 및 생존율을 결정하기 위해 바람직한 방법을 사용하여 후속 실험 분석을 준비한다. NK-92 세포주를 시작 생존율 및 착석 밀도를 결과적인 최종 생존율 및 최종 농도와 비교하였다. 72시간 SMG 치료 후 두 가지 부정적인 결과와 긍정적인 결과를 비교했습니다.

비교를 위해, 사용된 NK-92 세포주의 최적 농도 범위는 밀리리터당 0.3 내지 120만 세포였으며, 배가 시간은 약 2 내지 3일이었다. SMG 처리군에서의 증식은 대조군 및 처리군에 걸쳐 거의 동일하였다. 이러한 매개변수는 다운스트림 실험 성공에 필수적이었고 두 대조군의 결과 세포는 다운스트림 실험 분석에서 유사하게 수행되었습니다.

처리 과정 전반에 걸쳐, 특히 시뮬레이션된 미세 중력에 노출되는 세포 배양에서 기포 형성을 모니터링하고 설명하는 것이 중요합니다. 큰 기포 형성은 용기 내의 유체 역학에 혼란을 야기할 수 있으며, 이는 본질적으로 시뮬레이션된 미세 중력 조건을 무효화합니다.