Confocal 현미경을 사용한 높은 시간 분해능을 가진 마우스 신경근 접합부의 칼슘 과도 상태 등록

시냅스 전 칼슘 수준의 추정은 시냅스 전달을 연구하는 핵심 작업입니다. 칼슘 신호 전달을 연구하는 것은 신경 퇴행성 질환을 치료하는 방법을 찾는 데에도 중요합니다. 제시된 로딩 기술의 주요 이점은 염색이 관심있는 세포에 대해서만 수행되었다는 것입니다.

칼슘 비타협성을 기록하는 우리의 방법은 매우 우수한 공간-시간 분해능을 제공합니다. 제시된 등록 방법은 컨포칼 현미경을 사용하여 빠른 주기적 프로세스를 등록해야 하는 신경생리학자에게 도움이 될 수 있습니다. 로딩 기술에서 가장 어려운 단계는 피펫 내부의 신경을 유지하는 것입니다.

피펫의 직경은 완벽하게 맞아야하므로 몇 가지를 만드십시오. 프로토콜의 모든 단계가 복잡하고 각 단계를 시연하면 많은 도움이 될 것입니다. 엘라스토머 코팅 페트리 접시에 미세한 스테인리스 스틸 핀으로 레바토르 아우리스 롱 근육 조직을 약간 늘어난 방식으로 고정하는 것으로 시작하고 근육이 완전히 덮일 때까지 링거 용액을 접시에 추가합니다.

다음으로, 마이크로피펫 풀러를 사용하여 세포 내 기록을 위해 미세하고 날카로운 팁이 있는 마이크로피펫을 준비합니다. 내부 필라멘트가없는 모세 혈관을 사용하십시오. 연마제로 테이퍼를 채점 한 후 마이크로 피펫 팁을 떼어 내고 팁은 직경이 약 100 마이크로 미터로 열려 있습니다.

그런 다음 내경이 80마이크로미터에서 12마이크로미터로 줄어들 때까지 팁을 파이어폴리싱합니다. 완료되면 실리콘 튜브를 한쪽에 부착하고 바늘이없는 주사기를 충전 피펫의 다른쪽에 부착합니다. 실체 현미경으로 신경 줄기가 별도의 신경 가지로 변하는 곳을 찾으십시오.

왁스를 사용하여 페트리 접시에 충전 피펫을 놓은 다음 피펫 팁이 신경 위에 올 때까지 움직입니다. 미세한 가위로 근육 섬유에 가까운 신경을 자르고 약 1 밀리미터 길이의 작은 신경 그루터기 조각을 남깁니다. 그런 다음 신경을 꼬집지 않고 일부 링거 용액으로 신경 그루터기를 충전 피펫 끝으로 흡인합니다.

완료되면 충전 피펫에서 실리콘 튜브를 제거합니다. 나중에 긴 필라멘트가있는 주사기를 사용하여 염료 로딩 용액을 그립니다. 그런 다음 로딩 용액과 함께 필라멘트 팁을 충전 피펫에 삽입하고 혼합물을 신경 그루터기에 방출 한 다음 신경 제제를 어두운 실온에서 30 분 동안 배양합니다.

배양 후, 섭씨 25 도의 유리 비커에서 50 밀리리터의 링거 용액으로 2 시간 동안 처리하기 전에 신선한 링거 용액으로 신경 제제를 헹굽니다. 컨포칼 현미경의 경우 신경 제제를 실리콘 엘라스토머 코팅 실험 챔버에 장착하고 강철 미세 바늘 세트로 약간 늘어난 상태로 고정합니다. 그런 다음 링거 용액으로 제제를 광범위하게 헹굽니다.

챔버에 흡입 전극을 설치하십시오. 준비 챔버를 현미경 스테이지에 장착한 후 입구 및 출구 피팅을 챔버에 놓습니다. 중력 흐름 구동 시스템을 켜서 준비물에서 초과 용액을 제거하십시오.

완료되면 자극 흡입 전극을 전기 자극기에 연결하고 자극 후 근육 수축이 발생하는지 확인하십시오. 그런 다음 10 마이크로 몰 d- 튜보 쿠라 린이 포함 된 링거 용액으로 관류 시스템을 채우고 관류 흡입 펌프를 켜서 관류를 시작합니다. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 또는 LSCM 소프트웨어에서 전기 생리학 및 획득 모드를 선택하여 이미징 파라미터를 설정합니다.

작업 메뉴 설정에서 현미경 동기 펄스로 자극기를 트리거하는 트리거 설정을 선택하고 프레임 필드의 트리거를 OUT 1 채널로 설정합니다. 스캔 모드를 1, 400 헤르츠의 스캔 빈도로 XYT로 돌립니다. 줌 계수는 핀홀이 완전히 열린 상태에서 6.1이어야 합니다.

순차, 트랜스패스, 양방향 X 모드가 켜져 있는지 확인한 다음 프레임을 형성하는 최소 시간을 52밀리초로 설정하고 원시 비디오에서 프레임을 20프레임으로 수집합니다. 아르곤 레이저의 여기 파장을 488 나노 미터로 설정하고 출력 전력의 8 %를 설정합니다. 매개 변수가 설정되면 라이브 모드 버튼을 눌러 염료가로드 된 신경 말단의 실시간 미리보기를 가져옵니다.

라이브 모드에서 관심 영역 또는 ROI를 검색하여 최상의 초점을 얻습니다. 그런 다음 자극기의 지연을 이전 값에 비해 2밀리초 적게 이동하고 데이터 수집 소프트웨어를 실행하여 각 시퀀스를 이전 시퀀스에서 2밀리초 이동하여 26개의 시퀀스를 수집합니다. 캡처된 비디오를 처리하려면 라이카 응용 프로그램 제품군 X 또는 LAS X 소프트웨어를 실행하고 생성된 프로젝트를 엽니다.

그런 다음 내보내기를 클릭하고 다른 이름으로 저장하여 대상 폴더에 TIF 형식으로 프레임을 저장합니다. 그런 다음 ImageJ 소프트웨어를 실행하고 파일, 가져오기 및 이미지 시퀀스를 클릭합니다. 이미지 시퀀스 열기 창에서 대상 폴더를 선택하고 첫 번째 프레임을 엽니다.

시퀀스 옵션에서 시작 이미지 필드로 이동하여 첫 번째 프레임의 프레임 번호를 1로 설정합니다. 그런 다음 증가 필드에서 확인을 클릭하기 전에 초기 신호 기록의 프레임 수와 동일한 값을 설정합니다. 스티칭된 첫 번째 프레임의 생성된 파일을 별도의 폴더에 저장하려면 파일, 저장 및 폴더 탭을 순서대로 클릭합니다.

시작 이미지 필드에 해당 프레임 번호를 설정하여 19프레임에 대해 절차를 반복합니다. 모든 이미지를 얻었으면 파일, 가져오기 및 이미지 시퀀스를 클릭하여 시작 이미지 및 증분 필드에서 하나를 선택합니다. 모든 프레임이 증가된 시간 해상도로 함께 스티칭된 최종 비디오를 볼 수 있습니다.

그런 다음 비디오 파일을 TIF 형식으로 저장합니다. 스티칭된 비디오를 분석하려면 이미지, 스택, 도구 및 스택 분류기를 클릭합니다. 그런 다음 분석, 도구 및 ROI 관리자로 이동합니다.

이전에 저장한 TIF 파일을 ImageJ 창으로 끌어다 놓은 다음 더 잘 볼 수 있도록 이미지를 확장합니다. 이미지 시각화를 개선하려면 이미지를 클릭하고 조정하여 밝기 대비를 자동으로 전환합니다. ROI를 도출하고 ROI 관리자에 가치를 추가하여 신경 말단에 가까운 배경을 설정하십시오.

그런 다음 더보기 및 다중 측정을 클릭하여 배경을 계산합니다. 평균값을 복사하여 스프레드시트 프로그램에 붙여넣습니다. 그런 다음 평균값을 계산합니다.

다음으로, process, main, subtracts를 클릭하여 스택에서 계산된 평균값을 뺍니다. 얻은 값을 입력하고 ROI 관리자에 추가하기 전에 다각형 선을 통해 신경 말단 주위에 ROI를 그립니다. 신경 말단의 과도 강도를 측정하려면 더보기와 다중 측정 탭을 클릭합니다.

그런 다음 평균 강도 값을 복사하여 스프레드시트 프로그램에 붙여넣어 신호의 평균 오프셋을 계산합니다. 신호 값을 평균 오프셋 값으로 나눕니다. 얻은 값에서 하나를 뺀 다음 100 %를 곱한 다음 칼슘 과도 그래프를 그려 진폭을 결정합니다.

신경 제제에 염료를 넣은 후, 대부분의 시냅스는 신경 그루터기 가까이에 위치하여 충분한 수준의 형광을 나타냅니다. 이미지 처리 후, 원하는 공간 및 시간 해상도를 갖는 칼슘 과도 현상이 얻어졌다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 신경 절단 후 처음 몇 분 동안 신경 그루터기를 염료 함유 용액에 넣어야한다는 것입니다.

이 방법은 다양한 염료와 약물을 운동 뉴런에로드하는 데 사용할 수 있습니다. 등록 프로토콜은 CNS 제제에서 수상 돌기 및 등뼈에서 칼슘을 평가하는 데 유용 할 수 있습니다. 우리의 기술은 좋은 공간 및 시간 해상도로 칼슘 신호를 등록 할 수 있습니다.

칼슘 과도 현상을 연구하는 것은 신경 전달 물질 방출 및 시냅스 가소성의 연구 조절에서 강력한 도구입니다.