Name: 지방 세포 관련 장애를 연구하기 위해 인간 iPSC를 순수한 지방 세포 집단으로 강력하게 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 배우세요 레티노산을 이용해 인간 iPSC를 중간엽 줄기세포로 분화시키고 Nile red 염색으로 순수한 지방 세포를 분리하는 방법을. 이 기술은 비만 및 대사 질환 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 카타르 국립 연구 기금 (QNRF) (보조금 번호 NPRP10-1221-160041)의 보조금으로 자금을 지원받았습니다. 마리암 아가디는 카타르 국립 연구 기금(QNRF)의 GSRA 장학금을 지원받았습니다.

이 연구는 적절한 기관 연구 윤리위원회의 승인을 받았으며 1964 년 헬싱키 선언 및 이후 개정 또는 유사한 윤리 기준에 명시된 윤리 기준에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 HMC(No. 16260/16) 및 QBRI(No. 2016-003)의 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 이 작업은 H1 및 H9와 같은 hESC에도 최적화되어 있습니다. 충분한 정보에 입각한 동의를 받은 건강한 개인으로부터 혈액 샘플을 채취했습니다. iPSC는 건강한 개인의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 생성됩니다.
1. iPSC 배양 및 유지
<ol><li>코팅 매트릭스를 knockout-DMEM에서 1:80의 비율로 재구성하여 기저막 매트릭스 코팅 플레이트를 준비하고 4°C에서 보관합니다.</li>
	<li>500mL의 줄기세포 기저 배지에 50mL의 10배 줄기세포 보충 배지와 5mL의 100x 페니실린-스트렙토마이신(P/S)을 추가하여 iPSC 배양액을 준비하고 단기간의 경우 4°C에서, 장기간 사용의 경우 -20°C에서 보관합니다.</li>
	<li>플레이트를 코팅 매트릭스-1 mL 6-웰 플레이트에 대해, 500 μL에 12-웰 플레이트에, 250 μL에 24-웰 플레이트-플레이트를 37°C에서 1-2시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>iPSC 배양 배지의 분취량을 제거하고 사용하기 전에 실온에서 예열합니다.</li>
	<li>iPSC(ESC 또는 iPSC) 바이알을 37°C 수조에서 해동하고 2-3mL의 배양 배지가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>튜브를 실온(RT-23°C)에서 4분 동안 120 x g 로 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 10μM ROCK 억제제(Y-27632)가 보충된 2mL의 신선한 배양 배지를 추가합니다. 매트릭스가 코팅된 6-웰 플레이트의 하나의 웰에 세포를 플레이트하고, 플레이트를 37°C에서 위치시킨다.</li>
	<li>24시간 후 배지를 제거하고 신선한 배양 배지로 교체합니다.</li>
	<li>세포가 80%-90% 밀도에 도달할 때까지 매일 배지를 교체하십시오.</li>
	<li>합류도에 도달하면 아래에 설명된 단계에 따라 세포를 계대합니다.<ol><li>배지를 제거하고 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 세포를 세척합니다.</li>
		<li>6-웰 플레이트의 웰에 대해 500 μL, 24-웰 플레이트의 웰에 대해 250 μL--37°C에서 1분 동안 인큐베이션하는 iPSCs 해리 시약 ( 재료 표 참조)을 첨가한다.</li>
		<li>해리 시약을 제거하고 37°C에서 1분 동안 건조된 세포를 배양한다.</li>
		<li>15 mL 원뿔형 튜브에 6-웰 플레이트의 웰에 대해 1 mL 및 24-웰 플레이트의 웰에 대해 250 μL-배양 배지를 사용하여 세포를 수집하고, 120 x g 에서 4분 동안 원심분리한다.</li>
		<li>10μM ROCK 억제제가 보충된 24웰 플레이트의 웰에 대해 6웰 플레이트의 웰에 대해 2mL의 배양 배지에 세포를 재현탁하고 40% 밀도로 새로운 매트릭스 코팅 플레이트에 플레이트합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. iPSC를 MSC로 차별화
<ol><li>저포도당 DMEM + 피루브산에 15% 소 태아 혈청(FBS)과 1% P/S를 첨가하여 MSC 분화 배지를 준비하고 4°C에서 보관합니다.</li>
	<li>80% 밀도에 도달하면 아래에 설명된 단계에 따라 배아체(EB) 형성에 iPSC를 사용합니다.<ol><li>세포를 DPBS로 세척하고 6웰 플레이트의 웰에 대해 해리 배지/EDTA-500μL, 24웰 플레이트의 웰에 대해 250μL로 배양합니다.</li>
		<li>37°C에서 1분 동안 인큐베이션하고, 해리 시약을 흡인하고, 세포를 37°C에서 추가로 1분 동안 유지합니다. MSC 분화를 시작하려면 ~10-12 x 106 개의 세포가 필요합니다.</li>
		<li>배양 배지를 사용하여 15mL 원뿔형 튜브에 세포를 수집합니다. 세포가 단일화되는 것을 방지하고 EB 형성을 허용하기 위해 수집하는 동안 매우 부드럽게하십시오. 세포를 120 x g 에서 4분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>세포를 10 μM ROCK 억제제를 함유하는 3 mL의 MSC 분화 배지에 재현탁시킨다.</li>
		<li>0.5 mL/well을 24웰 초저 부착 플레이트에 혼합하여 분배합니다. 참고: 초저 부착 플레이트를 사용하면 표면에 부착되는 것보다 EB로 세포 응집이 촉진됩니다.</li>
		<li>플레이트를 37°C의 인큐베이터에 넣습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>24시간 후, 아래에 설명된 단계에 따라 높은 레티노산(RA) 처리로 달성된 EB를 유도합니다.<ol><li>10μM RA를 MSC 분화 배지 3mL에 추가합니다. 15mL 튜브에 EB를 수집하고 15분 동안 안정화시킵니다.</li>
		<li>EBs로부터 상청액을 제거하고, 10 μM RA로 보충된 MSC 분화 배지를 첨가한다.</li>
		<li>부드럽게 재현탁하고 동일한 0.5웰 초저 부착 플레이트에 24mL/웰을 분배합니다.</li>
		<li>플레이트를 37°C의 인큐베이터에 넣습니다. 다음 48시간 동안 EB를 방해하지 마십시오.</li>
		<li>48시간 후 15mL 튜브에 EB를 수집하고 15분 동안 안정화시킵니다.</li>
		<li>EB에서 상청액을 제거하고 0.1μM RA가 보충된 MSC 분화 배지를 추가합니다.</li>
		<li>부드럽게 재현탁하고 동일한 0.5웰 초저 부착 플레이트에 24mL/웰을 분배합니다.</li>
		<li>플레이트를 37°C의 인큐베이터에 넣습니다. 다음 48시간 동안 EB를 방해하지 마십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>아래에 설명된 단계에 따라 셀에 추가된 RA를 제거합니다.<ol><li>마지막 RA 치료 48시간 후, EB를 수집하고 15분 동안 안정되도록 합니다.</li>
		<li>상청액을 제거하고 사이토카인이 없는 DMEM 저혈당 배지를 추가합니다.</li>
		<li>부드럽게 재현탁하고 0.5웰 초저 부착 플레이트에 24mL/웰을 분배합니다. 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 넣습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>아래에 설명된 단계에 따라 iPSC 파생 EB를 플레이트링합니다.<ol><li>이전 단계(2.4단계)에서 48시간 후 15mL 튜브에 EB를 수집하고 15분 동안 안정화합니다.</li>
		<li>상층액을 제거하고 2mL의 신선한 MSC 분화 배지에 재현탁합니다.</li>
		<li>기저막 매트릭스 코팅된 6-웰 플레이트의 2개의 웰로 옮깁니다.</li>
		<li>추가 5일 동안 격일로 미디어를 변경합니다.</li>
		<li>5일 후, 사용한 배지를 제거하고 2.5ng/mL의 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 함유한 새로운 MSC 분화 배지로 교체합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>도금된 EB가 80%-90% 밀도에 도달하면 아래에 설명된 단계에 따라 통과시킵니다.<ol><li>세포를 DPBS로 세척하고, 6-웰 플레이트의 웰에 트립신-EDTA-500 μL를 첨가하고, 세포를 37°C에서 3분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>MSC 분화 배지를 사용하여 15mL 원뿔형 튜브에서 세포를 수집하고 750 x g 에서 4분 동안 회전합니다.</li>
		<li>2.5ng/mL의 bFGF와 함께 MSC 분화 배지에 재현탁하고 세포를 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 1:3의 비율로 플레이트합니다.</li>
		<li>세포가 70%-80% 밀도에 도달하면 통과를 반복합니다. 2-3 계대까지 3-600만 개의 세포를 얻을 것으로 예상됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. iPSC 유래 중간엽 줄기세포의 유세포 분석
참고: 2-3 계대 과정을 거치면 MSC 분화의 효율성을 위해 세포에 접근해야 합니다. 세포가 MSC 분화 마커-CD44, CD73, CD90 및 CD105를 90% 이상의 효율로 발현하고 높은 수준의 조혈 마커-CD14, CD19, CD34 및 CD45를 발현하지 않는 경우 분화가 성공적인 것으로 간주됩니다. 이러한 마커의 효율성은 아래 단계에 따라 액세스할 수 있습니다.
<ol><li>상기 약술된 단계(단계 2.6)를 사용하여 세포를 계대배양하고, v자형 바닥 96-웰 플레이트의 하나의 웰에서 1 x 105 세포를 얻는다.</li>
	<li>플레이트를 4°C에서 4분 동안 375 x g 로 원심분리합니다.</li>
	<li>1 μL의 접합 항체(Ab)와 함께 100 μL의 차가운 DPBS에 1 x 105 세포를 재현탁하고( 재료 표 참조) 4°C에서 30-40분 동안 배양하여 빛에 노출되지 않도록 합니다.</li>
	<li>1:100 농도에서 접합된 Ab의 각각의 이소타입 대조군과 함께 100μL의 차가운 DPBS에 또 다른 1 x 105 세포를 재현탁하고 빛에 노출되지 않도록 4°C에서 30-40분 동안 배양합니다.</li>
	<li>인큐베이션에 이어서, 플레이트를 4°C에서 4분 동안 375 x g 로 원심분리한다. 싱크대 위로 접시를 흔들어 상등액을 버립니다.</li>
	<li>차가운 DPBS 100μL에 세포를 재현탁합니다.</li>
	<li>세포를 4°C에서 4분 동안 375 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오.</li>
	<li>200μL의 차가운 DPBS에 세포를 재현탁하고 어둡고 차가운 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 수집하고 형광 활성화 세포 분류(FACS)로 분석할 때까지 얼음 위에 보관합니다.</li>
	<li>FACS 분석의 경우, 측면 산란(SSC-A) 대 전방 산란(FSC-A)을 사용하여 세포를 분산시켜 잔해를 배제합니다. 또한, 전방 산란 높이(FSC-H) 대 전방 산란 영역(FSC-A)을 사용하여 게이트 세포를 분배하여 살아있는 세포 집단에서 싱글렛과 더블렛을 구별합니다. 참고: 모든 마커에 대한 이소타입 대조군의 이동과 관련하여 세포를 게이팅하고, 모든 염색된 샘플에서 최소 10,000개의 게이팅된 이벤트를 분석에 사용했습니다.</li>
</ol>4. 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화
<ol><li>10% 녹아웃 혈청 대체물(KOSR), 1% 글루타민, 1% P/S, 4.5ng/μL의 포도당을 최소 필수 배지(MEM)-알파에 첨가하여 지방세포 분화 기본 배지를 준비하고 4°C에서 보관합니다.</li>
	<li>MSC가 90% 이상의 밀도에 도달하도록 합니다. 성장 정지 기간을 겪을 수 있도록 48시간 동안 계속 배양합니다.</li>
	<li>100μg/mL의 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX), 1μM의 덱사메타손, 0.2U/mL의 인슐린, 100μM의 인도메타신 및 10μM의 로시글리타존을 기본 배지에 추가하여 완전한 지방세포 분화 배지를 준비합니다.</li>
	<li>MSC 분화 배지를 제거하고 DPBS를 사용하여 세포를 세척합니다.</li>
	<li>6-웰 플레이트의 웰에 2 mL 및 12-웰 플레이트의 웰에 1 mL-완전 지방세포 분화 배지를 추가하고, 세포를 37°C에서 배양한다. 14일 동안 격일로 완전한 분화 배지를 교체하십시오.</li>
</ol>5. 지방세포의 분화 효율 평가
<ol><li>분화 14일째에 지방세포 성숙 마커인 FABP4와 아디포넥틴을 세포에 염색하여 분화 효율을 확인하였다.</li>
	<li>배지를 제거하고 DPBS로 세포를 세척합니다.</li>
	<li>200 μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 사용하여 세포를 24웰 플레이트의 웰에 고정하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>PFA를 버리고 0.5% 트윈(TBST)이 함유된 트리스 완충 식염수로 세척하고 실온에서 15분 동안 셰이커에 놓습니다. 이 과정을 두 번 반복합니다.</li>
	<li>고정된 세포를 0.5% Triton X-100(PBST)이 함유된 인산염 완충 식염수로 투과시키고 실온에서 15-20분 동안 진탕기에 놓습니다.</li>
	<li>PBST를 버리고 블로킹 완충액(PBST 중 5%-6% 소 혈청 알부민(BSA))-500 μL를 6-웰 플레이트의 웰에 첨가하고 250 μL를 12-웰 플레이트의 웰에 첨가하고 실온에서 40-60분 동안 진탕기에서 배양합니다.</li>
	<li>FABP4에 대한 1차 항체, 아디포넥틴을 2%-3% BSA에 1:500의 농도로 희석합니다( 재료 표 참조). 다른 동물에서 자란 경우에만 이러한 항체를 함께 첨가하고 플레이트를 4°C에서 밤새 쉐이커에 놓습니다.</li>
	<li>1차 항체를 제거하고 TBST(각각 15분)로 세포를 3회 세척한 후 실온에서 진탕기에 올려놓았다.</li>
	<li>PBST에서 Alexa Fluor 2차 항체를 준비합니다(1:500). 실온에서 60분 동안 2차 항체 조합(1차 항체가 상승하는 종에 따라)에서 세포를 배양하고 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호합니다.</li>
	<li>2차 항체를 버리고 TBST로 3회 세척한 후 플레이트를 셰이커에 올려놓는다.</li>
	<li>핵을 염색하려면 PBS에 희석한 24웰 플레이트의 웰에 1μg/mL의 Hoechst 33342-200μL를 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>Hoechst 용액을 버리고 PBS-500 μL를 24-웰 플레이트의 웰에 첨가하여 세포에 첨가하였다. 도립 형광 현미경을 사용하여 시각화될 때까지 플레이트를 빛으로부터 덮으십시오.</li>
</ol>6. 나일 레드를 이용한 지방 세포 분류
<ol><li>DMSO에 1mg/mL Nile red 원액을 첨가하여 나일 레드 작업 용액을 준비하고 -20°C에서 보관합니다. 사용 직전에 나일강 스톡을 해동하고 DPBS에서 재구성하여 300nM 작업 용액 농도를 달성합니다.</li>
	<li>지방세포 분화 14일째 또는 그 후, 세포로부터 배지를 버리고 DPBS를 사용하여 세척한다.</li>
	<li>나일 레드 작업 용액-1 mL를 6-웰 플레이트의 웰에 첨가하고 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>나일 레드 용액을 제거하고, 트립신-EDTA-500 μL를 6-웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 37°C에서 4분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>15 mL 코니컬 튜브에 5% FBS를 함유하는 DMEM을 사용하여 세포를 수집한다. 750 x g 에서 4분 동안 원심분리기.</li>
	<li>상층액을 제거하고 1 x 106 세포에 대해 DPBS-1 mL에 재현탁합니다. 750 x g 에서 4분 동안 원심분리기.</li>
	<li>상층액을 제거하고 1 x 106 세포에 대해 DPBS-1 mL에 재현탁합니다. FACS 분류기를 사용하여 FL1 채널을 사용하여 나일 적색 양성 세포를 분리합니다.</li>
	<li>분류된 세포를 지방세포 분화 배지에서 재배양하거나 RNA 및 단백질 분리를 위해 분류된 세포를 수집합니다.</li>
	<li>분류된 세포에서 RNA를 추출하고 FABP4, PPARG 및 C/EBPA를 포함한 지방세포 분화 마커의 상대적 정량 분석을 수행합니다. 나일 적색 양성 세포는 분류되지 않은 세포에 비해 적어도 2배의 유전자 발현에서 상당한 상향 조절을 보여줍니다.</li>
</ol>

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<li>Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+sort+ESC-derived+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A simple method to sort ESC-derived adipocytes.</a> Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).</li>
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</ol>

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

이 프로토콜은 MSC에 높은 수율과 효율성을 제공할 수 있는 능력으로 인해 가장 중요합니다. 중간엽 줄기세포의 이러한 대량 생산은 10μM의 RA14,15를 사용한 iPSC 유래 EB의 일시적인 배양에 의해 가능했습니다. 10μM의 RA를 사용한 일시적인 처리는 MSC 수율을 11.2배에서 1542배까지14,15배 향상시켰으며, 이 프로토콜은 iPSC와 hPSC 모두에 적용할 수 있습니다. 이 용량과 치료 기간에서 RA는 iPSC의 생존 및 증식에 중요한 세포 증식, 세포자멸사, 세포-세포 및 ECM-세포 부착에 관여하는 여러 유전자의 발현을 직간접적으로 조절함으로써 EB 형성 세포의 증식 및 생존 능력을 향상시킨다14,16</...

중간엽 줄기 세포(MSC)는 지방 세포, 골 세포 및 연골 세포와 같은 중배엽 기원 세포를 생산하기 위한 효과적인 일시적 자원 역할을 하며, 이는 각각의 유전 질환을 모델링하는 데 추가로 사용될 수 있습니다. 그러나, 이전의 접근법은 성인 조직으로부터 이러한 중간엽 줄기세포를 얻는 것에 의존했다1, 이는 기증자로부터 많은 수의 중간엽 줄기세포를 얻는 데 어려움을 겪었고, 차선의 체외 배양 조건1,2에서 기능적으로 생존할 수 있도록 유지하는 데 한계가 있었다. 이러한 장애물은 시험관 내에서 MSC를 생성하기 위한 프로토콜을 갖는 것에 대한 큰 수요를 낳았습니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)는 MSC 특성 3,4,5를 나타내는 MSC의 귀중한 공급원으로 사용될 수 있습니다. iPSC 유래 중간엽 줄기세포는 여러 질병에서 치료 옵션으로 사용할 수 있습니다. 또한 iPSC 유래 중간엽 줄기세포가 지방세포를 생성하는 능력은 인간 지방생성, 비만 및 지방세포 관련 장애를 연구하는 데 유용한 시험관 내 인간 모델이 됩니다.
지방세포의 현재 분화 프로토콜은 두 그룹으로 분류할 수 있는데, 하나는 화학적 또는 단백질 기반 칵테일을 사용하여 지방세포를 분화하여 30%-60%6,7,8,9의 결과 수율을 제공하는 반면, 다른 하나는 80%-90%10의 수율을 제공하기 위해 지방세포 발달을 지배하는 주요 전사 인자의 강력한 유도를 위한 유전자 조작을 포함합니다. 11. 그러나 유전자 조작은 지방세포 분화의 자연적 과정을 요약하지 않으며, 종종 지방 생성 중에 도달하는 미묘한 패러다임을 가려서 질병 모델링 목적에는 효과적이지 않습니다12,13. 따라서 우리는 나일 레드를 사용하여 지질 함유 지방 세포를 형광으로 태그하여 화학적으로 파생된 성숙한 지방 세포를 미성숙 지방세포에서 분류하는 방법을 제시합니다.
여기에서 우리는 지방 세포 생성에 추가로 사용될 수 있는 많은 수의 빠르게 증식하는 중간엽을 생성하기 위해 iPSC 유래 배아체(EB)를 all-trans retinoic acid와 함께 일시적으로 배양하는 프로토콜을 제시합니다14. 우리는 또한 친유성 염료를 사용하여 지질 방울에 형광 태그를 지정하여 이질적인 분화 풀에서 화학적으로 파생된 성숙한 지방 세포를 분류하는 방법을 제시합니다. 나일 레드. 이를 통해 지방 세포 관련 대사 장애를 정확하게 모델링할 수 있는 향상된 기능을 가진 성숙한 지방 세포의 순수한 집단을 생성할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Adiponectin</td><td>Abcam</td><td>ab22554</td><td>지방 세포 성숙 마커</td></tr><tr><td>anti-CD105</td><td>BD Pharmingen</td><td>560839</td><td>MSC 분화 마커</td></tr><tr><td>anti-CD14</td><td>BD Pharmingen 561712</td><td></td><td>MSC 분화 마커</td></tr><tr><td>anti-CD19</td><td>BD Pharmingen</td><td>555415</td><td>MSC 분화 마커</td></tr><tr><td>anti-CD34</td><td>BD Pharmingen</td><td>555824</td><td>MSC 분화 마커</td></tr>, <tr><td>anti-CD44</td>, <td>abcam</td><td>ab93758</td>, <td>MSC 분화 마커</td></tr>, <tr><td>anti-CD45</td>, <td>BD Pharmingen</td><td> 560975</td>, <td>MSC 분화 마커</td></tr>, <tr><td>anti-CD73</td>, <td>BD Pharmingen</td><td>550256</td><td>MSC 분화 마커</td></tr>, <tr><td>anti-CD90</td>, <td>BD Pharmingen</td><td>555596</td><td>MSC 분화 마커</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FP</td><td>MSC 배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>C/EBPA</td><td>Abcam</td><td>ab40761</td><td>지방 세포 성숙 마커</td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>토릭스</td><td>1126</td><td>지방 세포 분화 배지 보충제</td></tr><tr><td>FABP4</td><td>Abcam</td><td>ab93945</td><td>지방 세포 성숙 마커</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td>MSC 배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td>MSC 배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5879</td><td>지방 세포 분화 배지 보충제</td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I7378</td><td>지방 세포 분화 배지 보충제</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마 Aldrich</td><td>91077C</td><td>지방 세포 분화 배지 보충제</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12660012</td><td>마트리겔</td></tr><tr><td>저포도당 DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11885084</td><td>MSC 배양 배지</td></tr> 준비를 위한 기초 배지 <tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>코팅 매트릭스</td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>ThermoFisher</td><td>12561056</td><td>지방세포 분화 배지</td></tr><tr><td>Nilered</td><td>Sigma Aldrich</td><td>19123</td><td>지방세포용 분류 마커</td></tr><tr><td>페니실린</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>MSC/지방세포 매체 보충제</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td>세척 완충제</td></tr><tr><td>Pierce&trade; 20X TBS 완충액</td><td>Thermo Fisher</td><td>28358</td><td>세척 완충액</td></tr><tr><td>PPARG</td><td>세포 신호 기술</td><td>2443</td><td>지방세포 성숙 마커</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>줄기세포 기술</td><td>5872</td><td>해리 시약</td></tr><tr><td>레티노산</td><td>시그마 알드리치</td><td>R2625</td><td>MSC 분화 매체 보충제</td></tr><tr><td>암석 억제제</td><td>토크리스</td><td>1254/10</td><td>hPSC 배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>로지글리타존</td><td>시그마 알드리치</td><td>R2408</td><td>지방 세포 분화 배지 보충제</td></tr><tr><td>StemFlex</td><td>ThermoFisher</td><td>A334901</td><td>hPSC 배양 배지</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Thermo Fisher</td><td>28314</td><td>투과화 시약</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>ThermoFisher</td><td>25200072</td><td>해리 시약</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7942</td><td>세척 버퍼</td></tr></tbody></table>

지방 세포 관련 장애를 연구하기 위해 인간 ipsc를 순수한 지방 세포 집단으로 강력하게 분화

Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders

유도만능줄기세포(iPSC) 기술의 최근 발전으로 지방세포를 비롯한 다양한 세포 유형의 생성이 가능해졌습니다. 그러나, 현재의 분화 방법은 효율이 낮고, 지방세포의 균질한 집단을 생성하지 않는다. 여기에서 우리는 높은 수율로 중간엽 줄기 세포(MSC)를 생산하기 위해 all-trans retinoic 기반 방법을 사용하여 이 문제를 우회합니다. 세포 증식, 생존 및 부착을 제어하는 경로를 조절함으로써 당사의 분화 전략은 다능성 중간엽의 순수한 집단으로 분화하는 배아체(EB)의 효율적인 생성을 가능하게 합니다. 이 방법에 의해 생성된 많은 수의 중간엽 줄기세포는 지방세포를 생성하기 위한 이상적인 공급원을 제공합니다. 그러나 지방 세포 분화로 인한 샘플 이질성은 여전히 과제로 남아 있습니다. 따라서 우리는 FACS를 사용하여 지질 함유 성숙 지방 세포를 정제하기 위해 Nile red 기반 방법을 사용했습니다. 이 분류 전략을 통해 샘플 이질성이 감소하고 세포 기능이 향상된 지방 세포 풀을 사용하여 지방 세포 관련 대사 장애를 모델링하는 신뢰할 수 있는 방법을 확립할 수 있었습니다.

중간엽 분화 중 세포의 도식 및 형태: iPSC를 중간엽 줄기세포로 분화하려면 EB 형성, 중간엽 분화 및 MSC 확장에 걸친 다양한 발달 단계가 포함됩니다(그림 1). 이러한 발달 단계에서 세포는 다양한 자극 화학 물질로 인해 다양한 형태를 얻습니다. 분화가 시작되면 세포는 현탁액에 도말되며 직경이 작거나 중간 크기인 동안 정의된 세포 경계와 함께 둥글게 될 것으로 예상됩니다(그림 2). 분화 초기 단계에서 현탁액으로 세포를 배양하는 것을 선택하면 자연 배아 발달 과정과 매우 유사하므로 이 단계는 성공적인 분화에 매우 중요합니다. EB 형성 및 RA 처리 단계는 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 EB를 도금하는 단계가 뒤따릅니다. 도금 시 EB의 생존 가능성은 더 많은 중간엽을 생성하는 빠른 확산 거동을 관찰함으로써 접근할 수 있습니다(그림 2). 중간엽 줄기세포가 나타...

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 순수한 지방세포 집단의 생성을 허용합니다. 레티노산은 iPSC를 지방세포 생성에 사용되는 중간엽 줄기세포(MSC)로 분화시키는 데 사용됩니다. 그런 다음 나일 레드 염색을 기반으로 한 분류 접근법을 사용하여 순수한 지방 세포를 얻습니다.

지방 세포 관련 장애를 연구하기 위해 인간 iPSC를 순수한 지방 세포 집단으로 강력하게 분화

Recent advances in induced pluripotent stem cell (iPSC) technology have allowed the generation of different cell types, including adipocytes. However, the ...

종래의 접근법은 시험관 내에서 중간엽 줄기세포를 얻기 위해 매우 침습적인 방법에 의존하였으나, 이러한 중간엽 줄기세포는 30%에서 60% 범위의 효율로 30%의 이질적인 풀을 생산하는 데 한계가 있었다. iPSC가 80% 합류에 도달하면 DPBS로 세포를 세척하고 EDTA가 포함된 해리 배지를 추가합니다. 섭씨 37도에서 1분 동안 세포를 배양합니다.1분 후, 해리 시약을 흡인하고 세포를 섭씨 37도에서 추가로 1분 동안 놓습니다. 그런 다음 인큐베이터에서 플레이트를 꺼냅니다. 웰당 1밀리리터의 StemFlex 배지를 추가하고 15밀리리터의 원뿔형 튜브에 세포를 조심스럽게 수집합니다.세포를 원심 분리하십시오. 상청액을 제거하고, 10 마이크로몰의 암석 억제제를 함유하는 3밀리리터의 MSC 분화 배지에 이들을 부드럽게 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 혼합하고 웰 당 500 마이크로리터를 24-웰 초저 부착 플레이트에 분배한다.그런 다음 섭씨 37도의 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 24 시간 후, 획득 된 배아체를 유도하기 위해 15 밀리리터 튜브에 모아 정착시킵니다. 15분 후, 상청액을 제거하고, 10 마이크로몰 레티노산으로 보충된 MSC 분화 배지를 첨가한다.배아체를 부드럽게 재현탁하고 동일한 24웰 초저 부착 플레이트에 웰당 500마이크로리터를 분배합니다. 그런 다음 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 48 시간 후, 배아체를 15 밀리리터 튜브에 모으고 15 분 동안 안정되도록합니다.그런 다음 상청액을 제거하고 0.1 마이크로몰 레티노산이 보충된 MSC 분화 배지를 추가합니다. 배아체를 재현탁 한 후, 동일한 24 웰 플레이트에 웰 당 500 마이크로 리터를 분배하고 플레이트를 인큐베이터에 넣는다. 마지막 레티노산 처리 48시간 후, 배아체를 채취하고, 상층액을 제거하고, 사이토카인이 없는 DMEM 저혈당 배지를 첨가한다.동일한 24-웰 초저부착 플레이트에 웰당 500마이크로리터의 세포 현탁액을 부드럽게 재현탁하고 분배한 다음, 플레이트를 섭씨 37도에서 배양합니다. 48시간 후, iPSC 유래 배아체를 플레이팅하고, 배아체를 15밀리리터 튜브에 수집하고, 이들이 침전되도록 한 다음, 상청액을 제거하고, 2밀리리터의 신선한 MSC 분화 배지에 재현탁시킨다. 다음으로, 현탁액을 기저막 매트릭스 코팅된 6웰 플레이트의 2웰로 옮기고 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.5일 후, 사용한 배지를 염기성 섬유아세포 성장 인자 밀리리터당 2.5나노그램을 함유한 새로운 MSC 분화 배지로 교체하고 최대 11일 및 15일 동안 MCS 분화를 계속합니다. 도금된 배아체가 80-90% 합류에 도달하면 DPBS로 세척하고 트립신-EDTA를 첨가하고 섭씨 37도에서 1분 동안 배양하여 계대합니다. 플레이트에서 트립신-EDTA를 제거하고 섭씨 37도에서 1분 동안 다시 배양합니다.다음으로, 웰 당 1 밀리리터 매체를 첨가하십시오. 3분 후, MSC 분화 배지를 사용하여 세포를 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 모으고, 세포를 원심분리한다. 그런 다음 염기성 섬유아세포 성장 인자를 함유하는 MSC 분화 배지에 세포를 재현탁하고 세포를 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 1 대 3의 비율로 플레이트합니다.중간엽 줄기세포가 90% 합류에 도달한 후 48시간 동안 계속 배양하여 성장 정지 기간을 거치도록 합니다. 그런 다음 배지를 제거하고 DBPS로 세포를 세척합니다. 세척 후, 완전한 지방 세포 분화 배지를 플레이트에 첨가하고 섭씨 37도에서 세포를 배양한다.14 일 동안 격일로 매체를 변경하십시오. iPSC 유래 중간엽 줄기세포를 지방세포로 분화합니다. 나일 레드를 사용하여 지방 세포를 분류하려면 텍스트 원고에 설명 된대로 DMSO에서 나일 레드 작업 용액을 준비하십시오.사용하기 전에 원액을 해동하고 DPBS에서 재구성하여 300나노몰 작동 용액 농도를 얻습니다. 지방세포 분화 14일째 또는 그 후, 세포로부터 배지를 버리고 DPBS를 사용하여 세척한다. 그런 다음 나일 레드 작업 용액을 추가하십시오.플레이트를 덮고 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 15분 후 나일레드 용액을 트립신-EDTA로 교체하고 섭씨 37도에서 4분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 15밀리리터 원뿔형 튜브에 5%FBS가 포함된 DMEM을 사용하여 세포를 수집하고 세포를 원심분리합니다.상청액을 제거하고 DPBS에서 밀리리터당 100만 개의 세포 밀도로 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 FACS 분류기를 사용하여 FL-1 채널을 사용하여 나일 적색 양성 세포를 분리합니다. 분류된 세포를 수집하여 지방세포 분화 배지에서 재배양하거나 RNA 추출을 진행한 후 지방세포 분화 마커의 정량 분석을 진행합니다.분화가 시작될 때, 현탁액에 도금 된 세포는 정의 된 세포 경계로 둥글고 직경이 작거나 중간 크기입니다. 배아체의 생존력은 더 많은 중간엽을 발생시키는 빠른 증식 거동에 의해 관찰됩니다. 이러한 빠른 증식 거동은 특이하고 길쭉한 형태와 함께 중간엽 줄기세포를 새로운 매트릭스 코팅 플레이트에 통과시킨 후에도 유지됩니다.우수한 분화는 중간엽 표면 마커 CD73, CD44 및 CD90의 발현 효율이 90% 이상인 신뢰할 수 있는 중간엽 줄기세포를 생성합니다. 또한, 조혈 표현형 CD14, CD34 및 CD19를 묘사하는 표면 마커의 부재에 대한 세포 평가는 1% 미만의 발현 효율을 보였으며, 말기 분화 지방세포의 마커인 FABP4의 세포질 분포에서 높은 발현은 이들의 발달 성숙도를 나타낸다. 또한, 지방세포 성숙의 또 다른 지표인 아디포넥틴의 높은 발현은 지방세포가 포도당 신호전달에 반응하여 지질 저장 및 지방생성을 겪을 만큼 충분히 기능적임을 나타냅니다.염색 시 나일 레드는 지질을 함유한 성숙한 지방세포에만 독점적으로 결합하여 형광 활성화 유세포 분석을 사용하여 성숙한 지방세포를 분류하는 데 효과적인 도구가 됩니다. 나일 적색 양성 세포는 분류되지 않은 세포에 비해 성숙 마커의 상당한 상향 조절을 보여줍니다. 배아체 형성 및 중간엽 세포 해리 동안 세포를 수집하는 동안 매우 부드러워야 하며, 이는 중간엽 줄기 세포의 해리 후 생존 효율에 큰 영향을 미치기 때문입니다.돌연변이를 가지고 있는 환자로부터 얻은 순수한 지방세포 집단은 샘플 이질성에 의해 영향을 받는 데이터 없이 특정 돌연변이에 의해 영향을 받는 조절 및 신호 전달 경로를 결정하기 위해 기능적 및 전체 전사체 시퀀싱을 받을 수 있습니다. 이 기술은 시험관 내에서 중간엽 줄기 세포의 확장 가능한 생성을 가능하게 하여 조직 관련 질병 발병 기전을 이해하기 위해 지방 세포, 연골 세포 및 골 세포로 쉽게 분화하기 위해 인간 기증자로부터 수확할 필요가 없습니다.

robust-differentiation-human-ipscs-into-pure-population-adipocytes-to

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

성숙한 지방세포는 역분화를 통해 줄기세포의 풍부한 공급원을 나타낼 수 있으며, 이는 섬유아세포와 같은 세포의 균질한 집단으로 이어집니다. 콜라겐분해효소 소화는 인간 지방에서 성숙한 지방세포를 분리하는 데 사용됩니다. 우리 프로토콜의 목표는 인간의 성숙한 지방 세포에서 다분화능, 역분화된 지방 세포를 얻는 것입니다.

천장 문화 성숙한 지방 세포의 탈분화를 통해 인간 된 지방 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 다능성 검사를 통해 피하 지방 조직에서 돼지 지방 유래 줄기 세포(pADSC)를 분리하는 방법을 설명합니다. 다분성 pADSC는 지방 세포 분화 과정을 설명하고 재생 연구를 위해 중배엽 중간엽의 여러 세포 계통 또는 외배엽 및 내배엽의 추가 계통으로의 전분화를 연구하는 데 사용됩니다.

돼지 피하 지방이 조직에서 분리 및 지방이 유래 줄기 세포의 분화

이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류 또는 면역자기 비드 분리를 통해 쥐 복강 내 백색 지방 조직(WAT) 저장소에서 지방 형성 및 섬유 염증성 기질 세포 하위 집단을 분리하는 기술적 접근 방식을 설명합니다.

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

우리는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 마우스 전도성 지방 패드에서 매우 실행 가능한 지방 전구 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다.

마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비

이 보고서는 신생아 마우스에서 1 차적인 갈색 및 백색 프레드포스세포의 동시 적인 격리를 위한 프로토콜을 기술합니다. 분리된 세포는 배양에서 재배되고 완전히 성숙한 백색과 갈색 지방세포로 분화하도록 유도될 수 있다. 이 방법은 배양시 1차 지방세포의 유전적, 분자 및 기능적 특성화를 가능하게 한다.

신생아 마우스에서 기본 백색및 갈색 프레드포스세포의 격리 및 분화

이 프로토콜은 피하 지방에서 마우스 지방전구세포의 분리, 성숙한 지방세포로의 분화 및 인슐린 저항성 유도를 설명합니다. 인슐린 작용은 웨스턴 블롯을 통한 인슐린 신호 전달 경로 구성원의 인산화/활성화에 의해 평가됩니다. 이 방법을 사용하면 원발성 지방세포에서 인슐린 저항성/민감도를 직접 측정할 수 있습니다.

1차 배양에서 분화된 마우스 지방세포: 인슐린 저항성 모델

지방세포는 갓 태어난 마우스의 견갑골 간 갈색 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 분리하여 지질 방울을 축적하고 분자 마커를 발현하며 성숙한 갈색 지방세포의 미토콘드리아 형태를 보여주는 세포로 분화합니다. 이러한 세포는 면역 형광 및 투과 전자 현미경으로 추가로 분석됩니다.

Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)

이 프로토콜은 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 달성하기 위해 쥐 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리를 설명합니다. 콜라게나제 분해를 위해 조직 해리제를 사용하면 실험 변동이 줄어들고 재현성이 높아집니다.

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

성숙한 지방세포의 크기와 취약성으로 인해 연구 및 분리에 사용할 수 있는 기술과 도구가 제한되어 있습니다. 여기에서는 성숙한 쥐 지방세포의 분리를 위한 프로토콜이 설명되어 있으며, 이는 다양한 지방세포 및 마우스 사료에 쉽게 적용할 수 있습니다.

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

여기서는 처리 시간이 &gt;90% 감소하고, 세포 생존율이 높으며, 광범위한 호환성을 특징으로 지방유래 줄기세포와 지방세포를 효율적으로 분리하는 표준 방법을 제시합니다.

돼지 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포와 지방세포의 효율적인 분리

배우세요 레티노산을 이용해 인간 iPSC를 중간엽 줄기세포로 분화시키고 Nile red 염색으로 순수한 지방 세포를 분리하는 방법을. 이 기술은 비만 및 대사 질환 연구에 활용됩니다.

지방 세포 관련 장애를 연구하기 위해 인간 iPSC를 순수한 지방 세포 집단으로 강력하게 분화

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