Name: 염증 중 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 미생리학적 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 배우세요 생체 모방 미세유체 분석법을 활용한 백혈구-내피 세포 상호작용 연구 방법입니다. 이 기술은 염증 질환의 병태생리학적 메커니즘을 실시간으로 관찰하고 잠재적 치료제를 신속하게 선별할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

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이 작업은 국립 보건원 (National Institutes of Health), 보조금 번호 : GM114359 및 GM134701 (M.F.K. 및 L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), 국방 위협 감소 기관, 보조금 번호 : HDTRA11910012 (M.F.K. 및 L.E.K.)의 지원을 받았습니다.

Heparinized 인간의 혈액은 템플 대학 (필라델피아, PA, 미국)의 기관 검토위원회 (Institutional Review Board of Temple University, PA, USA)의 승인에 따라 정보에 입각 한 동의에 따라 건강한 성인 기증자 (남성과 여성, 21 세에서 60 세 사이)로부터의 호중구 분리를 위해 얻어집니다.
1. 인간 피브로넥틴으로 장치를 프라이밍하고 코팅합니다.
참고: bMFA에는 두 개의 입구 포트와 두 개의 출구 포트가 혈관 구획에 연결되어 있습니다. 또한 조직 구획에 연결된 하나의 포트가 있습니다(그림 2).
<ol><li>튜브(0.06"의 O.D. 및 0.02"의 I.D.)(재료 표s)를 미세점 포셉이 있는 하나의 입구 포트를 제외한 모든 포트에 삽입합니다. 턱 클램프로 두 개의 출구 포트와 조직 구획 포트를 클램프로 고정하십시오. 각 튜브의 길이가 ~ 1 인치인지 확인하십시오.</li>
	<li>피브로넥틴 원액(1mg/mL)에서 PBS로 인간 피브로넥틴을 100μg/mL로 희석한다. 준비된 피브로넥틴 용액으로 1 mL 주사기를 로딩한다. 주사기를 24G 무딘 바늘과 ~ 4 인치 길이의 튜브에 연결하십시오. 참고: 가교를 방지하려면 인간 피브로넥틴을 과도하게 혼합/피펫하지 마십시오. 콜라겐과 같은 다른 세포외 매트릭스(ECM)가 상이한 세포 유형에 대해 사용될 수 있다.</li>
	<li>튜브를 열린 입구 포트에 삽입하고 인간 피브로넥틴이 다른 입구 포트에서 나올 때까지 플런저를 밀어 넣은 다음 클램프하십시오. 모든 채널, 조직 구획 및 튜빙이 인간 피브로넥틴 용액으로 채워질 때까지 나머지 포트에 대해 이 과정을 반복한다. 바늘을 제거하되 4인치 길이의 튜브를 삽입하고 고정하지 않은 상태로 유지하십시오. 참고: 튜브가 고정되기 전에 피브로넥틴이 채워져 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>탈기를 위해 공압 프라이머를 통해 클램핑되지 않은 튜브를 압축 질소 탱크에 연결하고 압력을 ~ 5 psi로 조정하고 ~ 15 분 동안 실행하십시오.</li>
	<li>15 분 후에 현미경으로 점검하여 장치에 기포가 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 채널 또는 조직 구획에 기포가 갇혀 있는 경우, 장치를 공압 프라이머에 다시 연결하여 다시 탈기, 즉 단계 1.4를 반복한다. 참고: 반전된 현미경은 이 프로토콜에서 현미경 검사와 관련된 모든 단계에서 사용됩니다.</li>
	<li>공압 프라이머에서 장치를 분리합니다. 장치를 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 단계 1.3과 유사하게 모든 채널 및 조직 구획을 미리 가온된 HLMVEC 배양 배지(표 자료)로 플러시한다. 이제 bMFA가 셀 시드를 수행할 준비가 되었습니다. 주: 포트에서 튜브를 제거/삽입하기 전에 먼저 입구 포트 튜브 바닥 주위에 피펫으로 물 한 방울을 놓아 공기가 장치로 유입되지 않도록 하십시오.</li>
</ol>2. HLMVEC로 bMFA 시드
<ol><li>T-25 플라스크에서 공급 업체의 프로토콜에 따라 HLMVEC를 60 % - 80 % 컨플루언시로 배양하십시오.</li>
	<li>세포 배양 플라스크로부터의 HLMVEC 배양 배지를 흡인한다. PBS로 두 번 씻으십시오.</li>
	<li>T-25 플라스크에 미리 가온된 트립신-EDTA 용액 2 mL를 첨가한다(37°C). 대부분의 세포가 플라스크로부터 분리될 때까지 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에서 3-5분 동안 인큐베이션한다. 참고: 배양 시간은 세포 유형 및 트립신-EDTA 농도에 따라 다를 수 있습니다.</li>
	<li>2 mL의 트립신 중화 용액(TNS, 37°C)을 플라스크에 첨가하여 트립신-EDTA를 중화시킨다.</li>
	<li>플라스크를 부드럽게 두드려 세포를 해리시킵니다. 이어서, 세포 현탁액 용액을 15 mL 원뿔형 튜브로 옮긴다.</li>
	<li>150 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 내피 세포를 펠릿화한다. 상청액을 제거하고 세포를 3 mL의 세포 배양 배지에 재현탁시켰다. 혈구계로 세포 수를 계산하십시오.</li>
	<li>세포를 펠릿화하기 위해 다시 150 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고 세포를 20 x 106/mL의 원하는 시딩 밀도로 재현탁시킨다. 참고: 세포 유형 및 합류도에 따라, 약 2 x 10 6 내피 세포를 2개의 T-25 플라스크로부터 수집할 수 있으며, 20 x 10 6/mL의 시딩 밀도로, 100 μL의 세포 현탁액(2 x 106 내피 세포)은 5개의 장치를 시드하기에 충분하다.</li>
	<li>1 mL 주사기를 프로그램형 주사기 펌프에 장착하고 튜브를 무딘 바늘에 부착하십시오.</li>
	<li>~ 20 μL의 세포 현탁액을 튜브에 넣어 세포 현탁액이 주사기 배럴이 아닌 튜브 내에만 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>클램프를 장치의 출구 포트에서 떼어냅니다. 튜브를 장치의 한 입구에 연결합니다. 채널에 기포가 유입되지 않았는지 확인합니다.</li>
	<li>4-8 μL/min의 유량으로 펌프를 시작하십시오. 현미경으로 장치를 관찰하십시오.</li>
	<li>채널이 셀로 채워지면 펌프를 멈추고 콘센트를 고정하고 입구 튜브를 자릅니다. 참고: 장치에 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>장치를 5%CO2 및 37°C에서 4시간 동안 인큐베이터에 넣었다.</li>
	<li>4시간 배양 후, 신선한 세포 배양 배지로 채워진 또 다른 주사기를 준비한다. 주사기를 시린지 펌프에 장착하고 주사기를 입구 포트에 연결한 다음 출구 포트에서 클램프를 제거합니다.</li>
	<li>장치를 통해 신선한 배지를 4-8 μL / min에서 약 5 분 동안 실행하여 부유 / 부착되지 않은 세포를 씻어냅니다.</li>
</ol>3. 48 시간 동안 유동하에 세포 배양
<ol><li>신선한 세포 배양 배지로 채워진 주사기를 준비하십시오. 주사기를 주사기 펌프에 장착하고 주사기를 하나의 입구 포트에 연결하고 콘센트를 열어 두십시오. 장치를 인큐베이터(5%CO2, 37°C)에 넣었다.</li>
	<li>표 1에 언급된 다음 지시사항을 사용하여 유동 하에 내피 세포를 배양하기 위한 시린지 펌프를 프로그래밍한다.</li>
	<li>bMFA를 유동 하에서 배양 48 h 후에 현미경으로 확인한다. HLMVEC는 완전한 루멘을 형성하는 혈관 채널을 커버해야 한다(도 6). 주: 다른 유동 정권은 상이한 세포 유형에 대해 요구될 수 있다.</li>
</ol>4. 사이토카인 및/또는 치료적 치료
참고: 예로서, 이 섹션에서는 bMFA를 사용하여 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) 및 신규한 항염증 억제제 (단백질 키나제 C 델타-TAT 펩티드 억제제, PKCδ-i)18,27,32,33,34,35,36으로 세포를 치료하는 것의 영향을 연구하는 것에 대해 설명한다.
<ol><li>위의 프로토콜을 사용하여 세 개의 서로 다른 bMFA 장치를 준비합니다(섹션 1-3).</li>
	<li>세포 배양 배지 (TNF-α) (10 ng/mL), TNF-α (10 ng/mL) + PKCδ-i (5 μM)로 각각 세 개의 1 mL 주사기를 로딩한다. 주: 사이토카인은 세포 배양 배지에서 재구성된다.</li>
	<li>세 개의 주사기를 세 개의 bMFA 장치에 연결합니다. HLMVEC를 완충액 TNF-α 또는 TNF-α + 억제제로 0.1 μL/분에서 4시간 동안 처리하십시오. 참고: 특정 연구 요건에 따라, 다른 사이토카인 또는 사이토카인 칵테일(예를 들어, TNF-α + 인터루킨 1 베타(IL1-β) + 인터페론-감마(IFN-γ))가 내피 세포를 치료하는데 사용될 수 있다.</li>
</ol>5. 인간 호중구 분리
<ol><li>모든 시약을 실온(RT)에서 사용하십시오. 시약은 백혈구 분리 배지, Ca2+/Mg2+를 갖는 1x HEPES 완충액 (표 2), 정상 식염수 중 6% 덱스트란 (0.9% NaCl), 3.6% NaCl 용액 및 탈이온수 (DI) 물을 포함한다.</li>
	<li>백혈구 분리 배지 20 mL를 피펫 50 mL 원뿔형 튜브에 넣고 25 mL의 혈액을 백혈구 분리 배지 위에 조심스럽게 겹쳐엎는다. RT에서 427 x g 에서 40분 동안 원심분리한다. 참고: 혈액과 백혈구 분리 배지가 혼합되지 않도록 이 단계를 천천히 그리고 조심스럽게 수행하십시오.</li>
	<li>적혈구 (RBC) 층 위의 ~ 5 mL까지 흡인하십시오. RBC 상단의 흰색 버피 층은 주로 호중구입니다.</li>
	<li>HEPES 버퍼를 추가하여 현재 볼륨을 두 배로 늘립니다(기존 볼륨: HEPES 버퍼 = 1:1).</li>
	<li>최종 볼륨의 20 %가 될 6 % 덱스트란의 양을 추가하십시오. (현재 부피/4 = 6% 덱스트란의 첨가량).</li>
	<li>튜브를 부드럽게 몇 번 뒤집어 잘 섞고 RBC 침전물 (~ 25 분)을 시키십시오.</li>
	<li>조심스럽게 상층(호중구 풍부층)을 피펫하고 새로운 50 mL 튜브로 옮기고, 침전된 RBC로 오염되지 않도록 주의한다.</li>
	<li>RT에서 315 x g 에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고 펠렛을 8 mL의 HEPES 완충액에 재현탁시켰다.</li>
	<li>잔류 RBC를 용해시키려면 DI 물 24 mL를 넣고 50초 동안 부드럽게 섞는다. 즉시, 8 mL의 3.6% NaCl 용액을 첨가하고, RT에서 315 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 혼합한다.</li>
	<li>상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 15 mL의 HEPES 완충액으로 세척하고, 315 x g .에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛을 HEPES 완충액에 재현탁시킨다.</li>
</ol>6. bMFA를 이용한 호중구 부착 및 이동 실험
<ol><li>분리된 인간 호중구(15백만개)를 999 μL의 HEPES 완충액에 재현탁시킨다.</li>
	<li>호중구 현탁액에 1 μL CFDA-SE (카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르) 염료 원액 (10 mM)을 첨가하여 작업 농도 10 μM의 CFDA-SE를 수득하고 RT에서 10분 동안 인큐베이션한다. 315 x g에서 5분 동안 원심분리하여 HEPES 완충액으로 세포를 두 번 세척한다.</li>
	<li>혈구분석기를 사용하여 호중구를 계수하고 세포 배양 배지, TNF-α (10 ng/mL) 및 TNF-α (10 ng/mL) +PKCδ-i (5 μM)로 2백만 호중구/mL에서 재현탁; 실험 시작 전에 RT에서 15분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>연구를 위한 화학유인제인 1 μM N-formyl-met-leu-phe (fMLP)로 채워진 주사기를 세포 배양 배지에서 준비한다. bMFA를 사용하여 하나의 입구 포트와 하나의 출구 포트를 엽니다. 참고: 이러한 실험 조건은 높은 수준의 순환 사이토카인/케모카인을 갖는 전신 염증 반응을 포함하는 패혈증의 상태를 모방하는 데 사용됩니다. 또한, 그람 음성 박테리아 유래 펩티드인 fMLP는 폐(즉, 조직 구획) 내의 박테리아의 존재를 모델링하는데 사용된다.</li>
	<li>조직 구획 포트 튜빙을 제거하고 fMLP 튜빙을 삽입하십시오. ∼20 μL의 fMLP를 세포 배양 배지 단독으로 처리한 것을 제외한 모든 bMFA를 조직 구획에 주입한다. 그런 다음 튜브를 자르고 클램프하십시오.</li>
	<li>주사기를 ~200 μL의 호중구 현탁액으로 채우고 주사기를 시린지 펌프에 장착한다.</li>
	<li>장치를 거꾸로 된 현미경 단계 (재료 표)에 놓습니다.</li>
	<li>유속이 1 μL/min인 상태에서 펌프를 시작하고 튜브에서 호중구 현탁액의 작은 방울이 나올 때까지 기다리십시오. 튜브를 입구 포트에 삽입합니다. 설정에 대해서는 그림 7 을 참조하십시오.</li>
</ol>7. 이미지 획득
<ol><li>현미경 이미지 분석 소프트웨어(Table of Materials)에서 큰 이미지 스캔 기능을 사용하여 실험을 시작한 후 10분 후에 bMFA(그림 8)에서 접착 지도를 얻습니다. 대부분의 호중구는 처음 10분 동안 bMFA에 들어간다. 참고: 광표백을 줄이기 위해 이미지를 촬영하지 않을 때는 형광 빛을 끄십시오.</li>
	<li>다음 시간 동안, 마이그레이션 분석을 위해 조직 구획의 타임랩스 이미지(5분마다 1개의 이미지)를 취하여 마이그레이션 맵을 얻는다.</li>
</ol>8. 디지털 이미지 분석
<ol><li>접착 지도의 경우, 각 용기에 부착된 호중구의 수를 계산하십시오. 각 분기에 대해 직경의 두 배에 해당하는 직경을 가진 원형 관심 영역(ROI)을 만들고 부착된 호중구의 수를 계산합니다.</li>
	<li>수동 카운트 또는 자동화된 오브젝트 카운트 함수를 사용하여 각 용기 및 분기 영역에서 부착되는 호중구의 수를 정량화합니다.</li>
	<li>CFD 시뮬레이션(17 )을 사용하여 생성된 네트워크의 전단 속도 맵을 사용하여 각 선박에서 전단 속도를 결정한다. 그런 다음 도 9A에 도시된 바와 같이 bMFA에서 전단 속도 맵을 생성하기 위해 그 용기 내의 전단 속도에 대해 주어진 용기 내의 부착된 호중구의 수를 플롯한다.</li>
	<li>호중구는 내피를 통해 조직 구획으로 들어간 경우 이동된 것으로 계산됩니다. 10 분, 15 분, 30 분 및 60 분에서 이동 된 호중구의 수를 계산하십시오. 도 9B에 도시된 바와 같이 이동된 호중구의 수 대 시간을 플롯한다.</li>
</ol>

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<li>Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+shear+adhesion+map+using+SynVivo+synthetic+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025(2014).</li>
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저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

bMFA는 생체내 미세혈관 네트워크의 지형 및 유동 조건을 재생하고, 생리학적으로 현실적인 조건 하에서 시험관내에서 백혈구-내피 세포 상호작용 및 내피 기능을 연구하는데 사용될 수 있다. 마우스 또는 인간의 미세 혈관 구조에서 미세 혈관 네트워크의 기하학은 자기 유사하고 프랙탈이며, 레이놀즈 번호<< 1로 혈관 기하학이 흐름 패턴에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냅니다. 따라서, bFMA는 인간을 포함한 다른 종에 대한 백혈구-내피 상호작용을 연구하는데 사용될 수 있지만, 마우스 크레마스터 근육의 미세혈관구조는 bMFA를 제조하기 위해 맵핑되었다.
bMFA는 롤링, 확고한 접착, 조직 구획으로의 호중구의 확산 및 이동을 포함하는 단일 분석에서 호중구 이동 캐스케이드의 개별 단계에 대한 실시간 평가를 허용합니다. 일차 인간 세포 및 임상적으로 관련된 샘플은 bMFA에서 번역성을 증가시키고 잠재적인 치료제를 신속하게 스크리닝하기 위해 사용될 수 ...

염증은 감염 및 손상에 대한 숙주 반응이고, 내피는 염증 반응 1,2,3에서 중요한 역할을 한다. 염증성 조절 장애는 패혈증, 심혈관 질환, 천식, 염증성 장 질환, 암 및 COVID-19와 같은 다수의 질병 병리의 근본 원인이다. 백혈구-내피 세포 상호작용은 이러한 염증성 질환에서 중심적인 역할을 한다. 염증 동안, 손상된 조직으로부터 병원균 또는 DAMPS (손상 관련 분자 패턴)로부터의 PAMPS (병원체 관련 분자 패턴)의 방출은 면역 세포를 활성화시켜 내피의 활성화로 이어지는 사이토카인 / 케모카인 및 기타 전염증성 매개체를 방출하여 혈관 내피 장벽 기능의 변화와 투과성 증가를 초래합니다 3,4 . 염증 동안 내피 세포의 활성화가 증가하면 백혈구와 내피 세포 상호 작용이 향상되어 혈관 내피를 가로 질러 활성화 된 백혈구가 주요 기관 1,5,6,7로 과도하게 이동하게됩니다.
백혈구의 모집은 생리활성 지질, 사이토카인, 케모카인 및 보체 성분 8,9로 구성된 화학적으로 다양한 화학유인제에 의해 개시된다. 백혈구 모집은 1) 백혈구 소엽 및 포획/부착, 2) 롤링, 3) 확고한 정지, 4) 확산 및 크롤링, 5) 혈관외유출/이동(그림 1)의 다섯 가지 개별 단계를 포함하는 다단계 과정입니다. 이 과정의 각 단계는이 역동적 인 현상을 조율하기 위해 백혈구와 내피 세포 사이의 누화를 필요로합니다 1,9. 궁극적으로, 체포 된 백혈구는 동시 화학 유인 물질 의존성 신호, 접착 사건 및 혈역학적 전단력 1,9,10,11,12에 의해 제어되는 다단계 과정을 통해 내피를 가로 질러 염증 조직으로 혈관을 확장합니다.
내피 세포 기능을 조절하는 전단 스트레스의 중심 역할과 백혈구-내피 세포 상호작용의 중요성을 감안할 때(13), 보다 조절된 환경에서 백혈구 이동 캐스케이드의 다양한 측면을 연구하기 위해 지난 수십 년 동안 몇몇 시험관내 모델이 개발되었다(14). 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하기 위한 전통적인 유체 장치는 두 가지광범위한 범주로 분류될 수 있다: a) 백혈구 롤링, 부착 및 부착 분자 발현을 연구하기 위한 장치, 예컨대 병렬 플레이트 유동 챔버 및 b) 트랜스웰 챔버와 같은 정적 조건 하에서 백혈구 이동을 연구하기 위한 장치. 평행 플레이트 유동 챔버와 같은 시스템은 전단력(15) 하에서의 접착 캐스케이드에서 접착 분자 및 이들의 리간드의 역할을 연구하는데 사용되어 왔다. 그러나, 상당한 결점은 이들 단순한, 이상화된 디바이스들(예를 들어, 직선 채널)이 생체내 미세혈관구조(예를 들어, 연속적인 혈관 분기, 혈관 형태학) 및 결과적인 유동 조건(예를 들어, 분기점에서의 수렴 또는 발산 흐름)의 스케일 및 기하학적 구조를 재현할 수 없다는 것이다. 결과적으로 이러한 장치는 접착 만 모델링 할 수 있지만 트랜스 마이그레이션은 모델링 할 수 없습니다. 트랜스웰 챔버는 생체내 기하학적 특징과 유동 조건을 고려하지 않고 정적 조건하에서만 트랜스마이그레이션을 연구할 수 있다. 따라서, 이들 전통적인 모델은 살아있는 조직의 미세환경을 모방하거나 단일 분석(6)에서 부착 및 이동 캐스케이드를 해결하지 않는다.
이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 새로운 3D 생체모방 미세유체 분석법(bMFA)(그림 2)을 개발하고 광범위하게 검증했으며, 이는 칩16,17,18에서 생체내 미세혈관 네트워크를 현실적으로 재현한다. 이 장치의 미세 제작을위한 프로토콜은 이전에17 년에 발표되었으며 여기에 간략하게 설명되어 있습니다. 마우스 크레마스터 근육의 미세혈관구조를 변형된 지리 정보 시스템(GIS) 접근법(19)을 사용하여 디지털화하였다. 이어서, 합성 미세혈관 네트워크는 디지털화된 미세혈관 네트워크(14,17,20,21,22)에 기초한 소프트 리소그래피 공정을 사용하여 폴리디메틸실록산(PDMS) 상에서 생성되었다. 간단히 말해서, 디지털화 된 네트워크 이미지가 Mylar 필름에 인쇄 된 다음 실리콘 웨이퍼 위에 SU-8 포지티브 포토레지스트를 패턴화하여 제작을위한 마스터를 만드는 마스크로 사용되었습니다. 미세제작된 기둥(직경 10 μm, 높이 3 μm)을 사용하여 높이 3 μm, 폭 100 μm의 기공을 만들고, 백혈구 이동을 위한 최적 크기 23,24,25를 혈관 채널과 조직 구획을 연결하였다. PDMS는 제조업체의 지시에 따라 제조되고 개발 된 마스터 위에 쏟아졌습니다. 또한, PDMS를 탈기시키고 오븐(65°C)에서 밤새 경화시켜 PDMS에 상보성 마이크로채널을 생성하였다. 그 후, 경화 된 PDMS를 SU-8 마스터에서 벗겨 낸 다음 입구 / 출구 용 펀칭 포트를 펀칭했습니다. 이어서, PMDS를 유리 슬라이드에 플라즈마 접합시켰다. 미세유체 장치의 표면은 천연 유리 및 PDMS를 포함한다. 세포 부착, 확산 및 증식을 촉진하기 위해, 세포외 매트릭스 (ECM) 코팅이 요구된다. bMFA는 3 μm 높이 및 100 μm 폭 기공을 통해 연결된 미세혈관 네트워크 및 조직 구획을 포함한다(도 2). 이 미세 유체 시스템은 단일 시스템 14,16,17,21,26에서 백혈구의 순환, 마진, 롤링, 부착 및 백혈구의 순환, 마진, 롤링, 부착 및 이동을 포함하여 상호 연결된 혈관 및 분기와 함께 완전한 미세 혈관 네트워크의 생리 학적으로 관련된 3D 환경에서 전체 백혈구 부착 / 이동 캐스케이드를 재현합니다14,16,17,21,26.
bMFA 입구의 유속이 고정되어있는 경우에도 네트워크의 흐름 조건은 다른 위치에서 다양하며 간단한 수학 공식으로 계산할 수 없다는 점에 유의해야합니다. 전산 유체 역학 (CFD) 기반 모델은 네트워크의 다른 위치에서 다른 흐름 매개 변수 (예 : 전단 응력, 전단 속도, 속도)를 계산하기 위해 개발되었습니다. 이 CFD 모델은 bMFA에서 염료 관류 패턴 및 유동 파라미터를 시뮬레이션하는데 사용되었다. 실험 결과와의 교차 검증은 네트워크를 통한 흐름 저항이 계산 모델에 의해 잘 예측된다는 것을 시사했습니다(그림 3)17. 이 CFD 모델은 bMFA의 모든 용기에서 속도 및 전단 속도 프로파일을 추정하는 데 사용되었으며(그림 4), 백혈구 롤링, 부착 및 이동에 대한 전단 흐름 및 기하학적 구조의 영향을 분석할 수 있습니다(16). 백혈구는 생체내에서 분기 근처 및 낮은 전단 영역에서 우선적으로 부착되며, 백혈구 부착의 이러한 공간적 패턴은 호중구를 사용하는 bMFA에서 성공적으로 입증되었다(도 5)16. 이 논문은 인간 폐 미세혈관 내피 세포 (HLMVEC) 및 인간 호중구를 사용하는 염증 조건 하에서 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하기 위해 bMFA를 제조하기 위한 프로토콜을 기술한다. bMFA와 같은 미세 생리학적 시스템은 호중구, 단핵구, 림프구 및 종양 세포 18,27,28,29,30과 같은 상이한 유형의 세포와의 내피 세포 상호작용을 연구하는데 사용될 수 있다. bMFA는 상이한 기관 (예를 들어, 폐 대 뇌) 및 상이한 종 (예를 들어, 인간 대 뮤린 내피 세포) 뿐만 아니라 내 피 세포주 21,27,31,32로부터의 일차 내피 세포와 함께 시딩될 수 있다. bMFA는 다중 세포 반응, 세포-세포 상호작용, 장벽 기능, 약물 전달 및 약물 독성을 연구하는데 사용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>1 mL 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>생체 모방 미세유체 분석(bMFA)</td><td>SynVivo</td><td>SMN1-C001</td><td>독점</td></tr><tr><td>Bunt 바늘</td><td>Jensen Global</td><td>JG24-0.5</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>CFDA, SE</td><td>ThermoFisher</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, 250,000, Powder</td><td>Spectrum Chemical Mfg. Corp</td><td>DE-130</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Health Care</td><td>17-5442-02</td><td>백혈구 분리 매체</td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ1692630</td><td></td></tr><tr><td>Human fibronectin</td><td>Fisher Scientific</td><td>33-016-015</td><td>사용 다른 세포에 대한 공급업체 권장 ECM </td></tr><tr><td>라인 미세혈관 내피 세포 성장 매체-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>cc-3202</td><td>인간 폐 미세혈관 내피 세포 배양 배지(HLMVEC).</td></tr><tr><td>인간 폐 미세 혈관 내피 세포</td><td>Lonza</td><td>cc-2527</td><td>사용 vedor remommended 트립신-EDTA 및 TNS</td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>니콘 이클립스 Ti2</td><td>니콘 악기 Inc.</td><td></td><td>현미경</td></tr><tr><td>NIS 요소, 5.20.01</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21040CV</td><td></td></tr><tr><td>PhD 울트라 주사기 펌프</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-3007</td><td>주사기 펌프</td></tr><tr><td>수산화칼</td>륨 <td>Fisher Scientific</td><td>02-003-763</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TNF-알파</td><td>R& D Systems</td><td>210-TA</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 클램프</td><td>SynVivo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>Synvivo 공압 프라이머</td><td>Synvivo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA, 트립신 중화 용액(TNS)</td><td>Lonza</td><td>cc-5034</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 튜빙</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-206-8921</td><td>튜빙</td></tr></tbody></table>

염증 중 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 미생리학적 시스템

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

백혈구-내피 세포 상호작용은 패혈증과 같은 염증성 질환에서 중요한 역할을 한다. 염증 동안, 활성화된 백혈구가 혈관 내피를 가로질러 주요 기관으로 과도하게 이동하면 장기 부전이 발생할 수 있습니다. 생리학적으로 관련된 생체모방 미세유체 분석법(bMFA)은 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하기 위해 전체 백혈구 롤링/부착/이동 캐스케이드를 재현할 수 있는 몇 가지 실험 및 계산 기술을 사용하여 개발 및 검증되었습니다. 설치류 의 생체내 이미지로부터 얻은 미세혈관 네트워크는 지리 정보 시스템(GIS) 접근법을 사용하여 디지털화되고 현미경 슬라이드 상에서 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 미세제작되었다. 전단 속도와 혈관 토폴로지가 백혈구-내피 세포 상호작용에 미치는 영향을 연구하기 위해, 전산 유체 역학(CFD) 모델이 개발되어 네트워크 전반에 걸친 전단 속도 및 속도의 상응하는 지도를 생성하였다. bMFA는 롤링 속도, 상이한 전단 속도에 반응하는 부착된 백혈구의 수, 이동된 백혈구의 수, 내피 세포 투과성, 부착 분자 발현 및 기타 중요한 변수를 포함하는 백혈구-내피 세포 상호작용의 정량화를 가능하게 한다. 더욱이, 인간 내피 세포 및 백혈구와 같은 인간 관련 샘플을 사용함으로써, bMFA는 그들의 임상 번역성을 증가시키기 위해 잠재적인 치료제의 신속한 스크리닝을 위한 도구를 제공한다.

bMFA에서 전단 유동 하에서 48시간 배양한 후, 내피 세포는 bMFA에서 혈관 채널의 표면을 덮고 유동 방향으로 정렬하였다(도 6). 공초점 현미경 검사는 혈관 채널의 모든 표면이 내피 세포에 의해 덮여 bMFA18에서 완전한 3D 루멘을 형성한다는 것을 나타냈다.
이 프로토콜을 사용하여, 호중구 부착 지도가 획득될 수 있고, bMFA에서 내피 세포에 대한 호중구의 유의한 부착이 있음을 보여준다(도 8). 이 접착 지도에서 호중구의 공간적 분포를 CFD 모델로부터 생성된 전단 속도 맵과 상관시키는 것은 호중구 부착이 전단 의존적이며, 호중구가 낮은 전단 속도 및 분기 영역에서 우선적으로 부착된다는 것을 보여준다(도 9A). TNF-α-활성화된 내피 세포에 대한 호중구의 부착이...

이 프로토콜에서는 생리학적으로 관련된 미세혈관 환경을 재현하고 전체 백혈구 부착/이동 캐스케이드를 재현할 수 있는 생체모방 미세유체 분석법이 염증성 질환에서 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 데 사용됩니다.

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

백혈구-내피 세포 상호작용은 패혈증과 같은 염증성 질환에서 중요한 역할을 한다. 염증 조절 장애는 종종 혈관 내피 장벽 기능의 변화와 과도한 백혈구 밀매를 일으켜 장기 손상을 초래할 수 있습니다. 우리가 bMFA라고 부르는 생체 모방 미세 유체 분석은 생체 내 미세 혈관 네트워크의 지형 및 흐름 조건을 재현하고 호중구의 롤링, 확고한 접착, 확산 및 조직 구획으로의 이동에 대한 실시간 평가를 가능하게합니다.생체모방 미세유체 분석의 강점은 일차 인간 세포 및 임상적으로 관련된 환자 샘플을 사용하여 임상 번역을 증가시키고 잠재적인 치료제를 신속하게 스크리닝하는 능력이다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 대학원 연구 조교 인 Qingliang Yang 씨가 될 것입니다. 하나의 입구 포트를 제외한 미세한 포셉을 사용하여 포트 내에 약 한 인치 길이의 튜브를 삽입하기 시작하십시오.턱 클램프를 사용하여 두 개의 출구 포트와 조직 구획을 함께 클램프하십시오. 피브로넥틴 원액을 PBS로 밀리리터당 100마이크로그램으로 희석한다. 희석된 피브로넥틴 용액으로 24게이지 무딘 바늘에 연결된 한 밀리리터 주사기를 로드하고 주사기를 4인치 길이의 튜브에 연결합니다.튜브를 열린 입구 포트에 삽입한 다음, 인간 피브로넥틴이 다른 입구 포트에서 방출될 때까지 플런저를 밀어 클램프합니다. 모든 채널, 조직 구획 및 튜빙이 인간 피브로넥틴 용액으로 채워질 때까지 나머지 포트에 대한 과정을 반복한다. 바늘을 제거하되 네 인치 길이의 튜브를 삽입하고 고정하지 않은 상태로 유지하십시오.탈기를 수행하려면 클램핑되지 않은 튜브를 15분 동안 평방 인치당 5파운드의 압력으로 압축 질소 탱크에 연결된 공압 프라이머에 연결합니다. 현미경으로 채널 또는 조직 구획 내에 기포가 갇혀 있지 않은지 확인하고 기포가 있으면 장치를 다시 연결하십시오. 공압 프라이머로부터 장치를 제거하고 한 시간 동안 섭씨 37도에서 인큐베이션한다.미리 가온된 인간 폐 미세혈관 내피 세포 배양 배지를 사용하여 모든 채널 및 조직 구획을 플러시합니다. 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 내피 세포를 수확한 후, 프로그램가능한 시린지 펌프를 G.In 하여 150회에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 1밀리리터 주사기를 장착하고, 튜빙을 무딘 바늘에 부착한다. 약 20 마이크로리터의 세포 현탁액을 주사기 배럴에 넣지 않고 튜빙에 끌어당깁니다.장치의 출구 포트에서 클램프를 분리합니다. 채널에 기포가 생기지 않고 튜브를 입구 포트에 연결하십시오. 분당 네 ~ 여덟 마이크로 리터의 유량으로 펌프를 멈추고 현미경으로 관찰하십시오.채널이 셀로 채워질 때 펌프를 중지하십시오. 출구를 고정하고 입구 튜브를 자릅니다. 장치를 5 % 이산화탄소와 섭씨 37도에서 네 시간 동안 인큐베이터에 두십시오.네 시간의 배양 후, 다른 주사기를 준비하고 신선한 세포 배양 배지로 채운다. 주사기를 주사기 펌프에 장착하고 입구 포트에 연결하십시오. 콘센트 포트에서 클램프를 분리합니다.신선한 배지를 분당 네 개 내지 여덟 마이크로리터로 약 다섯 분 동안 장치를 통과시켜 부유하거나 부착되지 않은 세포를 제거한다. 신선한 세포 배양 배지로 채워서 주사기를 준비하십시오. 주사기를 주사기 펌프에 장착하고 출구 포트를 열어 두면서 하나의 입구 포트에 연결하십시오.장치를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소의 인큐베이터에 두십시오. 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 유동하에 내피 세포를 배양하기 위한 주사기 펌프를 프로그래밍한다. 현미경을 사용하여, 유동 하에서 48시간 배양한 후 bMFA를 확인하였다.공초점 현미경 검사는 혈관 채널의 모든 표면이 내피 세포에 의해 덮여 bMFA에서 완전한 3D 루멘을 형성한다는 것을 나타냈다. 세 개의 상이한 bMFA 장치를 제조한 후, PKC 델타 억제제와 각각 결합된 세포 배양 배지 또는 TNF-알파 또는 TNF-알파로 세 밀리리터 주사기를 로딩하고, 여기서 TNF-알파 및 염증성 사이토카인은 내피 세포 및 호중구를 자극하는데 사용된다. PKC 델타 억제제는 신규한 항염증 억제제이다.로드된 세 개의 주사기를 세 개의 bMFA 장치에 연결합니다. 완충제 TNF-알파 또는 TNF-알파를 억제제와 함께 사용하여, 분당 0.1 마이크로리터로 네 시간 동안 인간 폐 미세혈관 내피 세포를 치료한다. 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 인간 호중구를 단리한 후, 호중구를 999 마이크로리터의 HEPES 완충액에 재현탁시키고, 10-밀리몰 CFDA SE 염료 원액 1 마이크로리터를 현탁액에 첨가하여, CFDA SE의 10-마이크로몰 작업 용액을 수득하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.세포를 HEPES 완충액으로 두 번 세척하고 315배 G에서 5분 동안 용액을 원심분리하여 세포를 계수한 후, 세포 배양 배지에서 밀리리터당 2백만 호중구로 재현탁시키거나 PKC 델타 억제제와 함께 첨가된 TNF-알파 또는 TNF-알파에서 재현탁시키고 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. 주사기를 세포 배양 배지에서 제조된 화학유인제, fMLP의 마이크로몰로 채운다. bMFA의 입구 하나와 출구 포트 하나를 엽니다.조직 구획에서 포트 튜빙을 분리하고 fMLP 튜빙을 삽입하십시오. 약 20 마이크로리터의 fMLP를 모든 bMFA에 대해 조직 구획에 주입하고, 세포 배양 배지로 처리한 것을 남겨 둡니다. 튜브를 자르고 고정하십시오.주사기를 약 200 마이크로리터의 호중구 현탁액으로 채우고 주사기를 주사기 펌프에 장착하십시오. 장치를 거꾸로 된 현미경 스테이지에 놓은 후 유량을 분당 한 마이크로 리터로 설정하고 펌프를 시작하십시오. 튜브에서 호중구 현탁액의 작은 방울이 나올 때까지 기다렸다가 튜브를 입구 포트에 삽입하십시오.형광 표지된 호중구는 혈관 채널로 유동하고 내피 세포 및 생리학적으로 관련된 유동 조건과 상호작용한다. 실험을 시작한 후 10분 후에 이미지 분석 소프트웨어를 열고 대물 렌즈를 10x로 전환한 다음 스테이지 조이스틱을 사용하여 장치를 현미경 아래 가운데에 맞춥니다. 접착 맵을 가져오려면 획득으로 이동하여 큰 이미지 스캔을 클릭합니다.새 창이 나타납니다. 10x 대물 렌즈를 선택하고 필드 옵션(예: 5 x 3)을 설정합니다. 스캔을 클릭하고 파일을 클릭한 다음 접착 맵을 저장합니다.마이그레이션 분석을 위한 마이그레이션 맵을 가져오려면 스테이지 조이스틱을 사용하여 장치를 현미경 아래에 가운데에 맞춥니다. 보기, 획득 제어, ND 획득을 클릭합니다. 새 창이 나타납니다.파일을 저장할 경로를 설정하고 파일 이름을 입력합니다. 큰 이미지 기능을 확인하고 스캔 영역을 설정합니다(예: 5x3). 시간 기능을 확인하고 간격을 5분으로, 지속 시간을 60분으로 설정합니다.조직 구획의 시간 경과 이미지를 촬영하고 다음 시간 동안 다섯 분마다 하나의 이미지를 촬영하십시오. CFD 시뮬레이션은 흐름 패턴이 교란되는 분기 영역을 제외한 혈관 채널의 층류 패턴을 보여줍니다. 생체모방 마이크로유체 분석을 수행한 후, 위상차 이미지는 혈관 채널의 표면이 내피 세포로 덮여 있고, 배양 48시간 후에 전단 흐름의 방향으로 정렬되었음을 밝혀냈다.형광 이미징은 공초점 현미경을 사용하여 수행되었으며, 이는 내피 세포가 bMFA A 호중구 부착 지도에서 완전한 입체 내강을 형성한다는 것을 나타내며, 이는 bMFA에서 내피 세포에 대한 호중구의 유의한 부착이 있음을 밝혀냈다. bMFA에서의 호중구 이동 지도는 TNF-알파 활성화시, 조직 구획 내부에서 호중구의 상당한 이동이 발생한다는 것을 밝혀냈지만, TNF-알파 활성화 없이는 그러한 이동이 관찰되지 않았다. 호중구의 공간적 분포와 전단 속도를 연관시키는 부착지도는 호중구 부착이 전단율이 낮고 분기 영역 근처의 혈관에서 우선적으로 발생했음을 입증했습니다.또한, TNF-알파 처리는 부착을 유의하게 증가시키고, 이는 PKC 델타 억제제와 함께 억제되었다. 시간 경과 이미지 분석은 내피 세포의 TNF 활성화가 fMLP에 반응하여 호중구 이동을 증가시키는 반면, PKC 델타 억제제를 사용한 처리는 TNF-알파 처리된 세포에 비해 이동을 감소시켰다는 것을 나타내었다. 따라서, bMFA는 염증성 질환을 치료하기 위한 신규한 치료제의 효능을 시험하는데 사용될 수 있다.bMFA는 또한 투과성 및 내피 전기 저항, TEER 및 염증 중 부착 분자 발현과 같은 변수를 측정하여 내피 무결성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 생체 모방 미세 유체 분석은 다른 기관의 미세 환경을 모방 할 수 있으며 단일 세포 유형 또는 종에 국한되지 않으며 장기 기능에 중요한 세포 / 세포 통신을 모델링하고 다른 질병을 모델링 할 수도 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이것은 수확 가압 혈관의 내피에 백혈구 유착을 시각화하는 방법입니다. 기술은 따라서 고혈압의 pathophysiological 조건을 모방 - 대답은 200 mmHg로 intraluminal 압력을 각기 다른 전단 흐름에 따라 혈관 접착력을 공부하고 있습니다.

하이 Intraluminal 압력에서 혈관 내피에 이미징 백혈구의 접착

microvascular 크기의 채널 (&lt;30 μm의)와 microfluidic 장치의 전체 내부 3D 표면에 걸쳐 문화 내피 세포 단일층를하는 방법이 설명되어 있습니다.

Hematologic 질환의 Microvascular 상호 작용 유학을위한 Endothelialized Microfluidics

석판술으로 새겨져와 PDMS에서 가공 Microfluidic 흐름 여왕님 EC 장애와 염증과 관련된 기능적 결과를 알아내기 위해 적용됩니다. 대표 실험에서는 차등 전단 응력의 능력 시토킨 활성화 EC monolayers에 monocytic 세포 접착을 조절하기 위해이 입증되었습니다.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

이 비디오에서는 복강내에 지질다당류를 주입한 마우스 모델의 장간막 정맥에서 혈액 세포-내피 상호 작용의 실시간 시각화를 보여줍니다.

염증 마우스 모델에서 혈액 세포-내피 상호 작용을 분석하기 위한 생체 내 현미경 검사

이 비디오는 백혈구와 내피 세포와 같은 세포 파트너의 상호 작용을 특성화하기 위한 층류 기반 분석을 보여줍니다. 이 방법은 혈관 세포의 손상되지 않고 합류하는 층에 관류될 때 백혈구의 접착, 데데젼 및 전이에 대한 동적 통찰력을 제공합니다.

백혈구와 내피 세포 간의 상호 작용을 연구하기 위한 층류 기반 분석

백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

여기서는 조사자 마우스 순환계 유래 내피 부착 분자로 코팅 챔버를 연결하여 백혈구 보충 생체 역학을 평가할 수 있도록하는 프로토콜을 제시한다. 이 상대적인 생물학적 조건하에 백혈구 평가 가능 때문에이 방법은 상당한 이점을 제공한다.

의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가 전의 VIVO Autoperfused 미세 흐름 (microflow) 상공 회의소의 분석

마우스의 장간막 정맥에 대한 이 단순화된 생체 내 현미경 검사는 백혈구-내피 및 혈소판-백혈구 상호 작용을 관찰하기 위해 다양한 염증 모델에 사용할 수 있습니다.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

혈관 내 피는 단단히 백혈구 신규 모집을 제어합니다. 부적당 한 백혈구 넘쳐 흐름 인간의 염증 성 질병에 기여 한다. 따라서, 내 피 활성화의 새로운 규제 요소에 대 한 검색은 염증 성 질환에 대 한 향상 된 치료를 디자인 해야 합니다. 여기, 우리는 포괄적인 방법론 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 중 염증 매매 하는 것을 수정할 수 있는 특성을 설명 합니다.

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

이 단계별 프로토콜 실험 설정 및 hiPSC-ECs에 염증 반응의 평가 대 한 데이터 분석 및 생리 적 흐름에서 백혈구 접착의 분석에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.

미세 분석 결과 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내 피 세포 (hiPSC-ECs)에 백혈구 접착의 평가 대 한

배우세요 생체 모방 미세유체 분석법을 활용한 백혈구-내피 세포 상호작용 연구 방법입니다. 이 기술은 염증 질환의 병태생리학적 메커니즘을 실시간으로 관찰하고 잠재적 치료제를 신속하게 선별할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

염증 중 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 미생리학적 시스템

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