트리파노소마 크루지 또는 기타 병원성 유기체의 DNA 검출을 위한 즉시 사용 가능한 qPCR

겔화 프로토콜은 실행을 시작하는 데 필요한 시간과 단계를 줄이는 즉시 사용 가능한 qPCR 반응을 생성합니다. 이 프로토콜을 사용하면 qPCR 반응을 한 번에 품질 및 대량으로 생산 및 제어할 수 있으므로 레시피 계산 또는 웰에 분취 중 작업자 오류 가능성이 줄어듭니다. 이 방법은 종래의 냉동 포맷에서 이미 완전히 최적화된 임의의 qPCR에 적용될 수 있다.

이 방법의 시각적 데모는 두 가지 주요 품질 관리 단계가 시각적이기 때문에 중요합니다. 멜레지토스 용액을 준비하려면 15밀리리터 플라스틱 튜브에 4g의 멜레지토스를 계량하고 6밀리리터의 뉴클레아제 자유수를 넣고 분말이 용해될 때까지 최대 속도로 와동시킵니다. 뉴클레아제 자유수로 최종 부피를 10 밀리리터로 만든 다음 라벨을 붙이고 섭씨 2도에서 8도까지 최대 6 개월 동안 보관하십시오.

트레할로스 용액을 준비하려면 15 밀리리터 플라스틱 튜브에 트레할로스 4 그램의 무게를 달고 6 밀리리터의 뉴 클레아제 자유수를 넣고 분말이 용해 될 때까지 최대 속도로 와동합니다. 그런 다음 뉴클레아제 자유수로 부피를 10 밀리리터로 구성하고 0.2 미크론 필터를 통해 용액을 여과합니다. 용액에 라벨을 붙이고 섭씨 2도에서 8도까지 최대 6개월 동안 보관하십시오.

글리코겐 용액을 준비하려면 15 밀리리터 튜브에 글리코겐 2g의 무게를 달고 6 밀리리터의 뉴 클레아제 자유 물을 넣고 분말이 용해 될 때까지 와동시킵니다. 글리코겐의 가용화는 많은 거품을 생성하기 때문에 용액을 섭씨 2도에서 8도에서 12시간 동안 유지하십시오. 다음날, 배양에서 용액을 제거하고, 뉴 클레아제 자유 수로 부피를 10 밀리리터로 보충하고, 표지 된 용액을 섭씨 2도에서 8도까지 최대 6 개월 동안 저장한다.

라이신 용액을 준비하려면 15 밀리리터 튜브에 라이신 7.5 밀리그램의 무게를 달고 6 밀리리터의 뉴 클레아제 자유 물을 넣고 분말이 용해 될 때까지 와동시킵니다. 뉴클레아제 자유 수로 부피를 10 밀리리터로 구성하십시오. 0.2 미크론 필터를 통해 용액을 여과하고 섭씨 2도에서 8도에서 최대 6 개월 동안 보관하십시오.

겔화 혼합물을 준비하려면 50 밀리리터 플라스틱 튜브에 적절한 양의 스톡 용액을 혼합하십시오. 튜브를 10 번 뒤집어 시약을 혼합하고 라벨이 붙은 용액을 섭씨 2도에서 8도까지 최대 3 개월 동안 보관하십시오. 겔화를 위해 qPCR 마스터 믹스를 준비하려면 냉장 용기에서 시약을 해동합니다.

그런 다음 1.5 밀리리터 튜브에 적절한 양의 시약을 혼합하여 8 튜브 스트립 또는 96 웰 플레이트에 충분한 마스터 믹스를 준비합니다. 다음으로 피펫 18.5 마이크로리터의 겔화 마스터 믹스를 각 반응 웰에 놓고 튜브 또는 플레이트를 진공 오븐 내부의 열전도성 지지체에 놓습니다. 96웰 플레이트를 사용하는 경우 수분 흡수를 위해 96웰 플레이트 2개당 벤토나이트 점토 백 1개를 오븐에 넣습니다.

사이클이 완료되면 부피가 약 5 마이크로 리터로 눈에 띄게 감소하고 손가락으로 튜브 또는 플레이트를 두드릴 때 액체가 움직이지 않는지 확인하여 시약의 적절한 겔화를 위해 튜브 또는 플레이트를 확인하십시오. 사용하기 전에 튜브 또는 플레이트를 섭씨 2도에서 8도에서 12시간 동안 밀봉하고 보관하십시오. 겔화된 qPCR을 사용하려면 냉장고에서 튜브 스트립 또는 플레이트를 제거하고 샘플 조작을 위해 워크스테이션에서 엽니다.

15 마이크로리터의 뉴클레아제 자유수와 5마이크로리터의 DNA 샘플을 각 반응 용기에 첨가한다. 튜브 또는 플레이트를 밀봉하고 원하는 실험을 실행하고 정기적인 데이터 분석을 수행합니다. 본 프로토콜에서, 챔버 내부의 온도는 섭씨 30도에서 일정하게 유지되는 반면, 압력은 910 내지 930 밀리바 사이에서 그리고 거의 진공에 가깝게 변한다.

진공 사이클 후, 튜브 내부의 마스터 믹스는 부피가 감소하고 바닥에서 겔화되며 튜브를 두드릴 때 벽에 튀지 않습니다. 겔화가 불완전하면 튜브를 두드릴 때 액체가 튜브 벽에 튀어 나옵니다. 공개된 올리고뉴클레오티드 서열을 사용한 트리파노소마 크루지-DNA 검출이 여기에 표시됩니다.

겔화가 올바르게 실행되지 않았을 때 동일한 샘플을 검출하면 감도가 손실되었습니다. 가장 중요한 단계는 겔화 전에 시약 부피를 계산하는 것입니다. 작업자는 공정 중에 물이 제거되므로 물을 추가하지 않는 것을 기억해야합니다.

프로토콜 단계를 면밀히 따른다면 기본적인 실험실 및 분자 생물학 기술을 갖춘 작업자가 겔화 과정을 수행하는 데 어려움이 없습니다.