Name: Callinectes sapidus의 신경 펩티드에 대한 다각적 질량 분광 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 배우세요 Callinectes sapidus의 신경 펩티드 분석을 위한 질량 분광법 워크플로우입니다. LC-ESI-MS와 MALDI-MS 기술을 활용하여 신경 펩티드의 정량화 및 위치 특정을 수행하며, 이 방법은 다양한 질병의 바이오마커 발견과 펩티드 치료제 개발에 활용됩니다.

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이 연구는 R01DK071801 보조금을 통해 국립 과학 재단 (CHE-1710140 및 CHE-2108223)과 국립 보건원 (NIH)의 지원을 받았습니다. A.P.는 NIH 화학-생물학 인터페이스 교육 보조금(T32 GM008505)에 의해 부분적으로 지원되었다. N.V.Q.는 국립 심장 폐 및 혈액 연구소에서 위스콘신-매디슨 심혈관 연구 센터 (T32 HL007936)에 이르기까지 루스 L. 키르슈타인 국립 연구 서비스 상 (Ruth L. Kirschstein National Research Service Award)에 따라 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 지원을 받았다. L.L.은 NIH 보조금 R56 MH110215, S10RR029531 및 S10OD025084뿐만 아니라 위스콘신 동문 연구 재단 및 위스콘신 - 매디슨 약학부에서 제공하는 자금으로 Vilas Distinguished Achievement Professorship 및 Charles Melbourne Johnson 교수직의 자금 지원을 인정하고자합니다.

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신경계에서 발견되는 신경 펩티드 및 내인성 펩티드의 정확한 식별, 정량화 및 국소화는 그들의 기능을 이해하는 데 결정적이다23,24. 질량 분광법은 완전히 서열화 된 게놈이없는 유기체에서조차도이 모든 것을 달성 할 수있는 강력한 기술입니다. LC-ESI- 및 MALDI-MS의 조합을 통해 C. sapidus로부터 수집된 조직으로부터 신경펩티드를 검출, 정량화 및 국소화하는 이 프로토콜의 능력이 입증된다.
LC-ESI-MS 분석을 위한 시료 준비 중에 고려해야 합니다. MS가 민감한 기술인 반면, 신경 조직의 낮은 펩티드 농도(펨토몰 범위25까지)는 심각한 한계를 제기한다. 신중한 샘플 준비는 단백질 및 지질과 같은보다 풍부하고 간섭하는 매트릭스 성분을 제거 할뿐만 아니라 각 단계26,2...

신경계는 복잡하며 유기체 전체에 신호를 전달하기 위해 뉴런 네트워크가 필요합니다. 신경계는 감각 정보와 생물학적 반응을 조정합니다. 신호 전달과 관련된 복잡하고 복잡한 상호 작용에는 신경 전달 물질, 스테로이드 및 신경 펩티드와 같은 많은 다른 신호 분자가 필요합니다. 뉴로펩타이드는 스트레스 및 기타 자극에 대한 생리적 반응을 활성화시키는 데 중요한 역할을 하는 가장 다양하고 강력한 신호전달 분자이기 때문에, 이러한 생리적 과정에서 이들의 특정 역할을 결정하는 것이 관심의 대상이다. 뉴로펩타이드 기능은 이동성, 수용체 상호작용 및 친화도를 결정하는 아미노산 구조와 관련이 있다1. 신경 펩티드가 조직의 다른 영역에서 합성, 저장 및 방출 될 수 있기 때문에 중요한 조직 화학과 같은 기술 및 전기 생리학은 신경 펩티드 구조 및 기능 2,3,4를 조사하기 위해 사용되었지만 이러한 방법은 신경 펩티드의 광대 한 서열 다양성을 해결하기위한 처리량 및 특이성에 의해 제한됩니다.
질량 분광법 (MS)은 신경 펩티드 구조 및 풍부도의 높은 처리량 분석을 가능하게합니다. 이것은 상이한 MS 기술, 가장 일반적으로 액체 크로마토그래피-전기 분무 이온화 MS (LC-ESI-MS)5 및 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 MS (MALDI-MS)6를 통해 수행될 수 있다. 고정밀 질량 측정 및 MS 단편화를 활용하여, MS는 그들의 기능 7,8을 확인하는 것을 돕기 위해 선험적 지식 없이 복잡한 혼합물로부터 뉴로펩티드에 아미노산 서열 및 번역 후 변형(PTM) 상태를 할당하는 능력을 제공한다. 정성적 정보 이외에, MS는 무표지 정량(LFQ) 또는 동위원소 또는 등압 표지9와 같은 표지 기반 방법을 통해 신경펩티드의 정량적 정보를 가능하게 한다. LFQ의 주요 장점은 단순성, 낮은 분석 비용 및 샘플 손실을 최소화 할 수있는 샘플 준비 단계 감소입니다. 그러나 LFQ의 단점은 실행 간 변동성으로 인한 정량적 오류를 해결하기 위해 여러 기술 반복실험이 필요하기 때문에 계측기 시간 비용이 증가한다는 것입니다. 이것은 또한 작은 변화를 정확하게 정량화하는 능력을 감소시킵니다. 라벨 기반 방법은 여러 샘플이 다양한 안정한 동위원소를 사용하여 차등적으로 표지되고, 하나의 샘플로 결합되고, 질량 분광법을 통해 동시에 분석 될 수 있기 때문에 덜 체계적인 변형을 겪습니다. 이것은 또한 처리량을 증가시키지만, 동위원소 라벨은 합성하거나 구매하는 데 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들 수 있습니다. 전체 스캔 질량 스펙트럼(MS1) 스펙트럼 복잡성 또한 멀티플렉싱이 증가함에 따라 증가하며, 이는 단편화될 수 있는 독특한 뉴로펩티드의 수를 감소시키고, 따라서 식별된다. 반대로, 등압 표지는 MS1 수준에서 스펙트럼 복잡성을 증가시키지 않지만, 뉴로펩타이드와 같은 낮은 풍부 분석물에 대한 도전을 도입한다. 등압 정량이 단편 이온 질량 스펙트럼(MS2) 수준에서 수행됨에 따라, 저풍부 뉴로펩티드는 단편화를 위해 더 풍부한 매트릭스 성분이 선택될 수 있고 선택된 것들은 정량화되기에 충분한 풍부도를 갖지 않을 수 있기 때문에 정량화될 수 없을 수 있다. 동위원소 표지를 사용하면 확인된 모든 펩티드에 대해 정량을 수행할 수 있습니다.
식별 및 정량화 이외에도, 국소화 정보는 MALDI-MS 이미징(MALDI-MSI)10을 통해 MS에 의해 획득될 수 있다. 샘플 표면을 가로질러 레이저를 래스터링함으로써, MS 스펙트럼은 각 m/z 값에 대한 히트 맵 이미지로 컴파일될 수 있다. 조건에 걸쳐 상이한 영역에서의 일시적 뉴로펩타이드 신호 세기를 매핑하는 것은 기능 결정(11)에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있다. 뉴로펩티드의 국소화는 뉴로펩티드 기능이 위치12에 따라 다를 수 있기 때문에 특히 중요하다.
뉴로펩티드는 신경전달물질과 같은 다른 신호전달 분자들보다 낮은 풍부도의 생체내에서 발견되며, 따라서 검출을 위한 민감한 방법들(13)을 필요로 한다. 이는 지질11,14와 같은 더 높은 풍부 매트릭스 성분의 제거를 통해 달성될 수 있다. 신경 펩티드의 분석을위한 추가적인 고려 사항은 일반적인 프로테오믹스 워크 플로우와 비교할 때 이루어져야하며, 주로 대부분의 neuropeptidomic 분석이 효소 소화를 생략하기 때문입니다. 이것은 뉴로펩타이드 데이터 분석을 위한 소프트웨어 옵션을 제한하는데, 이는 대부분 프로테오믹스 데이터와 펩티드 검출에 의해 정보화된 단백질 일치를 기반으로 하는 알고리즘으로 구축되었기 때문이다. 그러나, PEAKS15와 같은 많은 소프트웨어는 그들의 de novo 시퀀싱 능력으로 인해 뉴로펩타이드 분석에 더 적합하다. 추출 방법에서 MS 데이터 분석에 이르기까지 신경 펩티드의 분석을 위해 몇 가지 요인을 고려해야합니다.
여기에 기술된 프로토콜은 LC-ESI-MS, MALDI-MS 및 MALDI-MSI에 의한 뉴로펩티드의 샘플 제조 및 디메틸 동위원소 표지, 데이터 수집 및 데이터 분석을 위한 방법을 포함한다. 여러 실험의 대표적인 결과를 통해 푸른 게, Callinectes sapidus에서 신경 펩티드를 식별, 정량화 및 국소화하는 이러한 방법의 유용성과 능력이 입증됩니다. 신경계를 더 잘 이해하기 위해 모델 시스템이 일반적으로 사용됩니다. 많은 유기체는 완전히 서열화된 게놈을 이용할 수 없으며, 이는 펩티드 수준에서 포괄적인 뉴로펩티드 발견을 방지한다. 이러한 도전을 완화하기 위해, 완전한 게놈 정보 없이 유기체에 대한 데이터베이스를 생성하기 위해 신규한 뉴로펩티드 및 전사체 마이닝을 확인하기 위한 프로토콜이 포함된다. 여기에 제시된 모든 프로토콜은 모든 종의 뉴로펩타이드 샘플에 최적화될 수 있을 뿐만 아니라 임의의 내인성 펩티드의 분석에도 적용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td><강>화학, 시약 및 소모품</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,5-디하이드록시벤조산(DHB) 매트릭스</td><td>Supelco</td><td>39319</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38S-500</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴 Optima LC/MS 등급</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-500</td><td></td></tr><tr><td>중탄산암모늄</td><td>시그마-알드리치</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Borane pyridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179752</td><td></td></tr><tr><td>Bruker 펩타이드 보정 혼합물</td><td>Bruker Daltonics</td><td>NC9846988</td><td></td></tr><tr><td>Capillary</td><td>Polymicro</td><td>1068150019</td><td>나노 플로우 컬럼 (75 &micro; M 내경 x 360 & 마이크로; m 외경)</td></tr><tr><td>Cryostat 컵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6032</td><td>어떤 컵이나 금형이라도 작동해야 합니다</td></tr><tr><td>&nbsp; 마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>30108434</td><td></td></tr><tr><td>포름 알데히드</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>포름 알데히드 - D2</td><td>시그마 알드리치</td><td>492620</td><td></td></tr><tr><td>포름산 옵티마 LC / MS 등급</td><td>피셔 화학</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>Difco</td><td>214340</td><td>장소 37 &deg; C 용융을 위한 수조</td></tr><tr><td>소수성 장벽 펜</td><td>Vector Labs</td><td>15553953</td><td></td></tr><tr><td>인듐 주석 산화물(ITO) 코팅 유리 슬라이드</td><td>Delta Technologies</td><td>CB-90IN-S107</td><td>25 mm x 75 mm x 0.8 mm (너비 x 길이 x 두께)</td></tr><tr><td>LC-MS 바이알</td><td>Thermo</td><td>TFMSCERT5000-30LVW</td><td></td></tr><tr><td>메탄올 옵티마 LC/MS 등급</td><td>Fisher Chemical</td><td>A456-500</td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>소수성 필름</td></tr><tr><td>pH 지시자 스트립</td><td>Supelco</td><td>109450</td><td></td></tr><tr><td>적린 클러스터</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>343242</td><td></td></tr><tr><td>역상 C18 재료</td><td>Waters</td><td>186002350</td><td>nanoflow column에 수동으로 포장</td></tr><tr><td>Wite-out pen</td><td>BIC</td><td>150810</td><td></td></tr><tr><td>ZipTip</td><td>Millipore</td><td>Z720070</td><td></td></tr><tr><td>Instruments and Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatic matrix sprayer system- M5</td><td>HTX Technologies, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge - 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>05-401-205</td><td></td></tr><tr><td>cryosstat- HM 550</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>956564A</td><td></td></tr><tr><td>건조제</td><td>드라이라이트</td><td>2088701</td><td></td></tr><tr><td>펜치</td><td>WPI</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>MALDI 스테인레스 스틸 타겟 플레이트</td><td>Bruker Daltonics</td><td>8280781</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite XLS</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td>200 &micro; L</td></tr><tr><td>Q Exactive Plus 하이브리드 사중극자-Orbitrap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>RapifleX MALDI-TOF/TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac - SVC100</td><td>Savant</td><td>SVC-100D</td><td></td></tr><tr><td>초음파 세척기</td><td>Bransonic</td><td>2510R-MTH</td><td>초음파 처리 초음파</td></tr><tr><td>균질기</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120110</td><td>FB120 음파 디스펜서 with CL-18 프로브</td></tr><tr><td>진공 펌프- Alcatel 2008 A</td><td>Ideal Vacuum Products</td><td>P10976</td><td>극한 압력 = 1 x 10-4 Torr</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Corning</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>수조(37C) - Isotemp 110</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-10</td><td></td></tr><tr><td>데이터 분석 소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>FlexAnalysis</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexControl</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEAKS Studio</td><td>Bioinformatics Solutions, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCiLS Lab</td><td>https://scils.de/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SignalP 5.0</td><td>https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tBLASTn</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ 프로그램=tblastn& PAGE_ TYPE=블래스트서치& SHOW_ 기본값=on& LINK_LOC =blasthome</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

callinectes sapidus의 신경 펩티드에 대한 다각적 질량 분광 조사

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

뉴로펩타이드는 발달, 번식, 음식 섭취, 외부 스트레스 요인에 대한 반응과 같은 거의 모든 생리적 및 행동 과정을 조절하는 신호 전달 분자입니다. 그러나 생화학 적 메커니즘과 신경 펩티드의 완전한 보완 및 그 기능적 역할은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다. 이들 내인성 펩티드의 특성화는 신호전달 분자의 이러한 부류 내의 엄청난 다양성에 의해 방해된다. 또한, 뉴로펩타이드는 신경전달물질보다 100x - 1000배 낮은 농도에서 생리활성이며 시냅스 방출 후 효소적 분해가 발생하기 쉽다. 질량 분광법 (MS)은 포괄적 인 선험적 지식없이 분석물을 식별, 정량화 및 현지화 할 수있는 매우 민감한 분석 도구입니다. 전 세계적으로 뉴로펩타이드를 프로파일링하고 새로운 펩타이드의 발견을 돕는 데 매우 적합합니다. 이러한 부류의 펩티드의 낮은 풍부도와 높은 화학적 다양성으로 인해, 몇몇 샘플 준비 방법, MS 획득 파라미터 및 데이터 분석 전략은 최적의 뉴로펩타이드 특성화를 허용하기 위해 프로테오믹스 기술로부터 적응되었다. 여기에서는 액체 크로마토그래피 (LC)-MS 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI)-MS를 사용하여 서열 특성화, 정량 및 국소화를 위해 복잡한 생물학적 조직으로부터 신경 펩티드를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. 블루 크랩으로부터 뉴로펩타이드 데이터베이스를 제조하기 위한 프로토콜로, 포괄적인 게놈 정보가 없는 유기체인 Callinectes sapidus가 포함된다. 이러한 워크플로우는 다양한 장비를 사용하여 다른 종의 내인성 펩타이드의 다른 클래스를 연구하도록 조정할 수 있습니다.

샘플 준비 및 MS 분석을 위한 워크플로우는 그림 1에 설명되어 있습니다. 신경 조직의 해부 후, 균질화, 추출 및 탈염이 수행되어 뉴로펩타이드 샘플을 정제한다. 동위원소 라벨-기반 정량화가 필요하다면, 샘플은 라벨링되고 다시 한번 탈염된다. 생성 된 샘플은 신경 펩티드 확인 및 정량을 위해 LC-MS / MS를 통해 분석됩니다.
프로테오믹스 소프트웨어를 통해 확인된 뉴로펩티드는 양호한 펩티드 단편화 서열 커버리지를 가져야 하지만, 이것은 세계적으로 정의되거나 표준화되지 않는다. 절대 식별을 위해, 모든 아미노산은 명확한 식별과 국소화를 제공하는 단편 이온을 생성해야 한다. 이것은 또한 각 단편 이온의 강도의 확인을 위해 합성된 펩티드와 비교되어야 한다. 모든 추정적 동정에 대해 이것을 수행하기 위한 비용이 실현가능하지 않기 때문에, 식별은 일반적으로 더 많은 관찰된 단편 이온이 펩티드 식별 신뢰도를 증가시키는 신뢰에 기초하여...

뉴로펩타이드의 질량 분광학적 특성화는 서열, 정량 및 국소화 정보를 제공한다. 이 최적화 된 워크 플로는 신경 펩티드 연구뿐만 아니라 다른 내인성 펩타이드에도 유용합니다. 여기에 제공된 프로토콜은 LC-ESI-MS, MALDI-MS 스포팅 및 MALDI-MS 이미징을 사용하는 뉴로펩타이드의 샘플 준비, MS 획득, MS 분석 및 데이터베이스 생성을 기술한다.

Callinectes sapidus의 신경 펩티드에 대한 다각적 질량 분광 조사

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...

대부분의 단백질보다 작지만 많은 소화 된 펩티드보다 큰 내인성 펩티드의 분석은 조사중인 분야입니다. 이 프로토콜은 질량 분광법 기반 워크플로의 스캡을 해결합니다. 질량 분광법은 매우 민감하며 관심있는 특정 신경 펩티드를 표적으로 삼거나 샘플 내에서 다양한 신경 펩티드를 포획하고 검출 할 수 있습니다.질량 분광법에 의한 뉴로펩타이드 발현의 정량화 및 국소화는 펩타이드 치료제의 개발과 다양한 질병에 대한 뉴로펩타이드 바이오마커의 발견으로 이어질 수 있다. 신경 펩티드 추출을 시작하기 위해 갑각류로부터 뇌 조직을 수집하고 포셉을 사용하여 즉시 하나의 조직을 20 마이크로리터의 산성화 메탄올이 들어있는 0.6 밀리리터 튜브에 넣는다. 150 마이크로리터의 산성화된 메탄올을 샘플에 첨가한다.총 소닉 환자 시간을 24초로, 펄스 시간을 8초로 설정합니다. 초음파 균질 기에서 진폭을 50 %로 15 초까지 일시 중지하고 얼음 위에서 샘플을 균질화하십시오. 샘플을 섭씨 4도에서 20, 000 GS에서 20분 동안 원심분리한다.피펫으로 상층액을 튜브로 옮기고 약 섭씨 35도의 진공 농축기에서 건조시킵니다. 탈염을 위해 추출된 조직 샘플을 0.1%포름산의 20 마이크로리터로 재구성한다. 용액을 소용돌이 치며 실온 수조에서 잠시 동안 초음파 처리하십시오.pH가 네 개 미만인지 확인하기 위해 pH 스트립에 0.5 마이크로리터의 샘플을 적용하십시오. 섭씨 4도 및 20, 000 GS에서 30초 동안 원심분리한다. 환상 용액으로 습윤 평형 세척을 준비하십시오.C18 수지로 10 마이크로리터 탈염 팁을 얻었다. 탈염 팁을 15 마이크로리터로 설정된 20 마이크로리터 피펫에 놓습니다. 젖은 용액으로 팁을 세 번, 동등한 협업 솔루션으로 세 번 흡인하십시오.시료를 10회 흡인한 다음, 세척액으로 세 번 세척하여 각 세척액을 버리고 버린다. 아세토니트릴을 증가시키기 위해 각각의 환상 해결책에서 10 번 흡인하여 황홀하게하십시오. 암시된 뉴로펩티드를 진공 농축기에서 건조시킨다.건조된 탈염된 뉴로펩티드를 0.1%포름산의 다섯 마이크로리터로 재구성한다. 용액을 소용돌이 치며 실온에서 일분 동안 초음파 처리하십시오. 2000 GS에서 간단히 원심분리. 신경 펩티드 및 갑각류 조직의 스포팅을 위해, 세 마이크로리터의 샘플 방울을 소수성 필름 상에 피펫팅한다.DHB 매트릭스의 세 마이크로리터를 샘플 액적 상에 직접 피펫한다. 위아래로 피펫팅하여 솔루션을

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배우세요 Callinectes sapidus의 신경 펩티드 분석을 위한 질량 분광법 워크플로우입니다. LC-ESI-MS와 MALDI-MS 기술을 활용하여 신경 펩티드의 정량화 및 위치 특정을 수행하며, 이 방법은 다양한 질병의 바이오마커 발견과 펩티드 치료제 개발에 활용됩니다.

Callinectes sapidus의 신경 펩티드에 대한 다각적 질량 분광 조사

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