Name: 3D 구조화 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 축삭 초기 세그먼트의 멤브레인 주기적 골격의 특성 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 배우세요 3D-SIM을 사용하여 배양된 rat hippocampal 뉴런의 축삭 초기 세그먼트에서 액틴 링의 주기적 구조를 시각화하고 단백질 공동국소화를 분석하는 방법을. 이 기법은 세포 골격 연구에 필수적입니다.

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Pirta Hotulainen 박사는이 원고를 준비하는 데 매우 귀중한 비판적 의견으로 인정 받고 있습니다. Rimante Minkeviciene 박사는 원래 실험에 사용 된 신경 배양을 준비하는 데 도움을 준 것으로 인정 받고 있습니다. 모든 이미징은 Biomedicum Imaging Unit에서 수행되었다. 이 작품은 핀란드 아카데미 (D.M., SA 266351)와 박사 과정 Brain & Mind (A.A.)의 지원을 받았습니다.

이 실험에 사용된 일차 해마 뉴런은 헬싱키 대학과 핀란드 법의 윤리적 지침에 따라 17일째 위스타 래트 배아 중 어느 한 성별의 배아로부터 수확되었다.16 .
1. 시료 준비
<ol><li>고충실도 유리 커버슬립에서 쥐 해마 뉴런이 희소 한 배양 조건 (~ 5,000-10,000 세포 / cm2)에서 14 일 (시험관 내 14 일) 동안 자랄 수 있도록하십시오. 참고: 희소 배양을 사용하면 신경돌기가 겹칠 가능성이 줄어들어 MPS를 정량화하는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>실온에서 12 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드를 사용하여 뉴런을 고정시킵니다. 커버슬립을 PBS (BSA-PBS) 중의 0.2% BSA로 1회 세척하고, 실온에서 PBS 중의 트리톤-X의 1% 용액에서 10분 동안 인큐베이션한다. BSA-PBS에서 한 번 세척하십시오.</li>
	<li>항-안키린 G 항체 (1:200)를 BSA-PBS에 희석한다. 항체 용액을 커버슬립에 첨가하고, 4°C에서 밤새 인큐베이션한다. 임의로, 치킨 항-MAP2 항체 ( 표 문헌 참조)를 항체 용액에 첨가하여 소마토-수지상 도메인을 구분한다.</li>
	<li>세포를 BSA-PBS로 1회 세척하고, PBS에서 0.1% 트리톤-X로 세척한 다음, BSA-PBS로 최종 세척을 수행한다.</li>
	<li>형광단-태깅된 항-마우스 이차 항체 (1:200) ( 물질 표 참조)를 BSA-PBS에 희석하고, 커버슬립에 첨가하고, 실온에서 1 h 동안 인큐베이션한다. 세포를 BSA-PBS로 1회, PBS 중의 0.1% 트리톤-X로 1회, PBS에서 1회 세척한다.</li>
	<li>PBS 중의 태그된 팔로이드인의 1 μM 용액을 준비하고( 물질의 표 참조) 이를 세포에 첨가한다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 세포를 PBS에서 1회, PBS에서 0.1% 트리톤-X로 1회, PBS에서 1회 세척한다. 참고 : AlexaFluor488 태그 phalloidin이 여기에 사용되었지만 다른 태그도 작동합니다.</li>
	<li>커버슬립을 유리 슬라이드에 장착하려면 유리 슬라이드에 장착 매체 한 방울을 바르고, 커버슬립을 탈이온수에 담근 다음, 부드러운 종이 타월을 사용하여 닦으십시오(과도한 물을 제거하기 위해).<ol>
<li>커버 슬립을 유리 슬라이드에 놓습니다. 실온에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 참고: 하드 세팅 마운팅 매체(경화 후 굴절률 1.47)를 사용하여 샘플에 대한 부작용은 관찰되지 않았습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 이미징
<ol><li>가능하다면 이미징하기 전에 현미경 검사 시설 직원과 상담하십시오. 침지 오일 계산기( 재료 표 참조)를 사용하여 샘플에 적합한 침지 오일을 선택합니다.</li>
	<li>샘플이 준비되면 커버슬립이 깨끗하고 잔여물이나 과도한 장착 매체가 없는지 확인하십시오. 필요한 경우 물이나 에탄올에 담근 면봉을 사용하여 청소하십시오. 샘플을 3D SIM 가능 현미경( 재료 표 참조)에 넣고 이미지화할 셀을 찾습니다.</li>
	<li>관련 레이저 라인의 파워와 노출 시간을 조정하여 시료를 크게 표백하지 않고도 신호 대 잡음비를 최대화하십시오. 참고: 신호 대 잡음비가 좋으면 샘플에 초점을 맞춘 선명한 그리드 모양의 외관을 보여주고 정확한 고해상도 재구성으로 이어집니다. 488nm 및 640nm 레이저 라인을 사용하여 각각 F-actin 및 ankyrin G를 시각화했습니다.</li>
	<li>샘플의 상한과 하한을 z-차원에서 설정하고 스택 획득을 진행합니다. 참고: 125 nm의 z-스텝 사이즈가 여기에 사용되었다.</li>
	<li>SIM 재구성을 성공적으로 하려면 현미경 소프트웨어( 자료 표 참조)에 사용된 염료에 적합한 광 전송 파일(OTF)이 있는지 확인하십시오. 참고: 일반적으로 전문 인력이 만들고 유지 관리합니다. 기능적 OTF가 없는 경우, 추정치에 따라 재구성을 수행할 수 있는 오픈 소스 도구도 사용할 수 있습니다17. 이 작업에서는 전문 인력이 제어하는 최신 OTF 파일이 사용되었습니다.</li>
	<li>스택에서 재구성 알고리즘을 실행하여 수퍼 분해능 재구성을 가져옵니다. 알려진 아티팩트에 대한 재구성을 확인하고 필요한 경우 매개변수를 조정하여 수정하십시오. 참고: 기본 알고리즘 매개 변수는 일반적으로 정확한 결과를 제공합니다. 이러한 아티팩트 중 상당수는 하나의 z-평면에서 여러 방향과 함께 줄무늬 선, '고스팅'(다양한 z-평면에 나타나는 반복 된 기능) 또는 일부 영역에서 나타나는 육각형 '벌집'패턴과 같은 반복되는 패턴을 포함합니다. 이러한 아티팩트는 종종 더 나은 샘플 준비, 더 나은 신호 대 잡음비, 재구성 알고리즘의 매개 변수 조정 또는 선택한 침지 오일의 굴절률이 장착 매체 및 샘플에 적합하도록 보장하여 고정 할 수 있습니다. SIM 아티팩트에 대한 자세한 설명과 아티팩트의 존재를 확인하는 데 자유롭게 사용할 수 있는 도구는 Ball et al.을 참조하십시오. 18
</li>
	<li>SIM 재구성을 광역 이미지와 비교하여 해상도 향상을 관찰합니다.</li>
	<li>다중 색상 SIM을 수행할 때는 만족스러운 재구성이 준비되면 정렬 알고리즘을 사용하여 서로 다른 채널을 올바르게 정렬합니다. 참고: 정렬 알고리즘은 현미경 제조업체의 지시에 따라 마이크로스피어 비드 준비를 사용하여 생성된 정렬 참조 파일을 사용합니다.</li>
</ol>3. 이미지 분석
<ol><li>MPS의 액틴 고리는 독특한 주기적 외관을 가지고 있습니다. 이미지 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 액틴 링이 보이는 모든 초점 평면을 사용하여 최대 강도 프로젝션 이미지를 생성합니다.</li>
	<li>최대 강도 프로젝션 이미지에서 눈에 보이는 인접한 링에 수직 선을 그리고 소프트웨어의 라인 '플롯 프로파일'기능과 함께 형광 강도를 기록합니다.</li>
	<li>평균 피크 간 거리를 계산하려면 라인 프로파일에서 로컬 최대값을 기록하고 인접한 개별 형광 강도 피크 사이의 거리를 측정합니다. 참고: 예를 들어 MATLAB의 'findpeaks' 함수 또는 (오픈 소스) GNU Octave 플랫폼을 사용하여 쉽게 계산할 수 있습니다.</li>
	<li>MPS에서 액틴 고리와 상이한 단백질의 공동국재화를 평가하기 위해, 액틴 및 후보 단백질의 SIM 재구성에 대한 공동국소화 분석 절차19,20,21을 실행한다. 수동으로 선택 항목을 그려 AIS를 소프트웨어 플랫폼19의 EzColocalization 플러그인에 대한 관심 영역으로 정의하고 분석을 실행하여 피어슨의 공동 현지화19,20,21의 PCC(상관 계수)를 계산합니다. PCC 값이 1에 가까우면 강력한 공동 지역화를 나타냅니다. 참고: 이 프로토콜은 그림 1에 요약되어 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Leterrier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Axon+initial+segment%2C+50+years+later%3A+A+nexus+for+neuronal+organization+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">The Axon initial segment, 50 years later: A nexus for neuronal organization and function.</a> Current Topics in Membranes. 77, 185-233 (2016).</li>
<li>Leterrier, C., Dargent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+pasaran%21+Role+of+the+axon+initial+segment+in+the+regulation+of+protein+transport+and+the+maintenance+of+axonal+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">No pasaran! Role of the axon initial segment in the regulation of protein transport and the maintenance of axonal identity.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 27, 44-51 (2014).</li>
<li>Brachet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ankyrin+G+restricts+ion+channel+diffusion+at+the+axonal+initial+segment+before+the+establishment+of+the+diffusion+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ankyrin G restricts ion channel diffusion at the axonal initial segment before the establishment of the diffusion barrier.</a> Journal of Cell Biology. 191 (2), 383-395 (2010).</li>
<li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nature Cell Biology. 5 (7), 626-632 (2003).</li>
<li>Song, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+filter+for+cytoplasmic+transport+at+the+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A selective filter for cytoplasmic transport at the axon initial segment.</a> Cell. 136 (6), 1148-1160 (2009).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+filtering+defect+at+the+axon+initial+segment+in+Alzheimer%27s+disease+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Selective filtering defect at the axon initial segment in Alzheimer's disease mouse models.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (39), 14271-14276 (2014).</li>
<li>Winckler, B., Forscher, P., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+diffusion+barrier+maintains+distribution+of+membrane+proteins+in+polarized+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A diffusion barrier maintains distribution of membrane proteins in polarized neurons.</a> Nature. 397 (6721), 698-701 (1999).</li>
<li>Kole, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+generation+requires+a+high+sodium+channel+density+in+the+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Action potential generation requires a high sodium channel density in the axon initial segment.</a> Nature Neuroscience. 11 (2), 178-186 (2008).</li>
<li>Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%2C+spectrin%2C+and+associated+proteins+form+a+periodic+cytoskeletal+structure+in+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons.</a> Science. 339 (6118), 452-456 (2013).</li>
<li>Leterrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+the+axon+initial+segment+reveals+an+organized+and+robust+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of the axon initial segment reveals an organized and robust scaffold.</a> Cell Reports. 13 (12), 2781-2793 (2015).</li>
<li>Leterrier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axon+initial+segment%3A+An+updated+viewpoint%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The axon initial segment: An updated viewpoint.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2135-2145 (2018).</li>
<li>Hamdan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+axon+initial+segment+structure+and+function+by+multiplexed+proximity+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping axon initial segment structure and function by multiplexed proximity biotinylation.</a> Nature Communications. 11 (1), 100(2020).</li>
<li>Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+functional+analyses+of+the+periodic+membrane+skeleton+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Proteomic and functional analyses of the periodic membrane skeleton in neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Valli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+beyond+the+limit%3A+A+guide+to+choosing+the+right+super-resolution+microscopy+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Seeing beyond the limit: A guide to choosing the right super-resolution microscopy technique.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100791(2021).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+contractility+of+actomyosin+rings+facilitates+axonal+trafficking+and+structural+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Radial contractility of actomyosin rings facilitates axonal trafficking and structural stability.</a> Journal of Cell Biology. 219 (5), 201902001(2020).</li>
<li>Abouelezz, A., Stefen, H., Segerstråle, M., Micinski, D., Minkeviciene, R., Lahti, L., Hardeman, E., Gunning, P., Hoogenraad, C., Taira, T., Fath, T., Hotulainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomyosin+Tpm3.1+is+required+to+maintain+the+structure+and+function+of+the+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Tropomyosin Tpm3.1 is required to maintain the structure and function of the axon initial segment.</a> iScience. 23 (5), 101053(2020).</li>
<li>Muller, M., Monkemoller, V., Hennig, S., Hubner, W., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+image+reconstruction+of+super-resolution+structured+illumination+microscopy+data+in+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ.</a> Nature Communications. 7, 10980(2016).</li>
<li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915(2015).</li>
<li>Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EzColocalization%3A+An+ImageJ+plugin+for+visualizing+and+measuring+colocalization+in+cells+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms.</a> Scientific Reports. 8 (1), 15764(2018).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).</li>
<li>Lahti, L. Data analysis supplement to the research article Abouelezz, Stefen, Segerstråle, Micinski, Minkeviciene, Lahti, Hardeman, Gunning, Hoogenraad, Taira, Fath, & Hotulainen. <a target="_blank" href="https://aaltodoc.aalto.fi/handle/123456789/109882">Tropomyosin Tpm3.1 Is Required to Maintain the Structure and Function of the Axon Initial Segment</a>. , (2021).</li>
<li>Abouelezz, A., Micinski, D., Lipponen, A., Hotulainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-membranous+actin+rings+in+the+axon+initial+segment+are+resistant+to+the+action+of+latrunculin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sub-membranous actin rings in the axon initial segment are resistant to the action of latrunculin.</a> Journal of Biological Chemistry. 400 (9), 1141-1146 (2019).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 초분해능 기술을 사용하여 MPS 단백질을 시각화하고 측정하는 방법을 제공한다. 액틴 링 및 기타 MPS 성분은 ~190 nm9,10의 주기성을 나타내므로, 기존의 회절 제한 이미징 접근법은 MPS의 세부사항을 밝힐 수 없다. 여러 현미경 검사 설정을 통해 회절 제한 구조를 초분해능으로 해결할 수 있으며 SIM은 강력하고 복잡하지 않은 옵션을 나타냅니다. 중요한 것은 SIM이 가장 널리 사용되는 형광단과 호환되므로 상당한 유연성을 제공한다는 것입니다. 또한, SIM은 라트룬쿨린 처리 뉴런22 및 살아있는 뉴런15의 액틴 고리와 같은 MPS에서 잠재적으로 희미한 구조를 시각화하는데 효과적이다.
이 프로토콜의 성공을 위한 필수적인 측면은 처음부터 MPS의 무결성을 보존하는...

축삭 초기 세그먼트(AIS)는 척추동물 뉴런의 근위 축삭의 짧고 독특하게 전문화된 영역이다1. AIS는 소마토-수지상 화물 2,3,4,5,6,7을 분류하여 뉴런 극성을 유지하는 데 필수적인 수송 필터 및 확산 장벽을 포함한다. 또한, AIS의 독특한 구조는 작용 전위 개시 부위로서의 기능을 용이하게 하는 전압 게이팅된 이온 채널의 클러스터를 수용할 수 있게 한다8. 매우 안정적인 구조 단지는 AIS의 고유 한 기능의 기초가됩니다. 지난 10년 동안의 연구는 스펙트린에 의해 연결된 액틴 고리를 함유하는 막 주기적 골격(MPS)의 존재를 밝혀냈으며, 다양한 AIS 단백질9,10을 앵커링하기 위한 스캐폴드를 제공한다.
MPS (∼190 nm)9,10에서 액틴 링 사이의 거리는 종래의 광 현미경의 해상도 한계 미만이다. MPS를 시각화하기 위해 전자 현미경을 사용하려는 초기 시도는 MPS의 구조를 보존하지 못했기 때문에 성공하지 못했습니다. 따라서, 초분해능 현미경 기술은 MPS11의 구조적 세부 사항 중 일부를 밝히는 데 매우 중요한 것으로 입증되었습니다. 그러나 AIS 구조 복합체에 대한 이해, 구성 요소의 정체성과 기능, 시공간 조절은 여전히 불완전합니다. 최근의 프로테오믹 연구는 AIS12,13의 구조적 성분에 가까운 AIS에 국한되는 단백질의 상당한 목록을 만드는 데 성공했다. 그럼에도 불구하고 AIS 단지의 기능과 정확한 위치에 대한 세부 사항은 부족합니다. 따라서 초분해능 현미경 검사 기술은 다른 MPS 구성 요소에 비해 이러한 단백질의 정확한 위치를 검사하고 기능을 조사하는 데 필수적인 도구 역할을합니다. 몇몇 광 현미경 기술은 빛의 회절 한계보다 높은 분해능을 달성할 수 있으며, 일부는 단일 분자를 국소화할 수도 있다. 그러나, 이러한 기술들 중 다수는 전형적으로 특수한 형광단 또는 이미징 버퍼를 필요로 하며, 이미지 획득은 종종 시간-집약적이다14.
3D 구조화된 조명 현미경(3D-SIM)은 사용 편의성과 간단한 샘플 준비 요구 사항으로 인해 이미징 또는 샘플 준비를 위한 특수 시약이 필요하지 않으며 다양한 형광단 및 샘플과 잘 작동하며 여러 색상으로 쉽게 구현할 수 있으며 라이브 셀 이미징이 가능합니다15. SIM이 제공하는 최상의 해상도(~120nm)는 다른 많은 초분해능 기술에 비해 낮지만, 많은 응용 분야(예: 뉴런에서 MPS의 구성 요소 해결)에 충분합니다. 따라서 SIM이 적합한 선택인지 또는 더 높은 해상도가 필요한지 여부를 결정하기 위해 특정 응용 프로그램에 대한 요구 사항을 고려하는 것이 중요합니다. 여기에서, Abouelezz et al.16에서 구현된 바와 같이, 배양된 해마 뉴런 및 3D 구조화된 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 MPS 내의 액틴 고리에 대한 추정적 AIS 단백질의 위치 및 조직을 조사하기 위한 프로토콜이 기술되어 있다.16

<table><tbody><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa-488 Phalloidin</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-647 안티 마우스</td><td>ThermoFisher</td><td>A31571</td><td></td></tr><tr><td>안티 안키린 G 항체</td><td>UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36</td><td>75-146</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2 항체</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5543</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>BioWest</td><td>P6154</td><td></td></tr><tr><td>Deltavision OMX SR</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>피지 소프트웨어 패키지</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GNU Octave</td><td>GNU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High performance 커버슬립</td><td>Marienfeld</td><td>117530</td><td></td></tr><tr><td>침수 오일 계산기</td><td>Cytiva 생명 과학</td><td></td><td>https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>VWR</td><td>ICNA1680149</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2020a</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal media</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>OMX SR</td><td>Delta Vision OMX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 마운팅 미디어</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>softWoRx Deconvolution</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Slides</td><td>Epredia</td><td>ISO 8037/1</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck 마이크로스피어 0.1 &마이크로; m</td><td>써모피셔</td><td>T7279</td><td></td></tr><tr><td>트리톤-X</td><td>시그마</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

3d 구조화 조명 현미경(3d-sim)을 사용하여 축삭 초기 세그먼트의 멤브레인 주기적 골격의 특성 측정

Measuring Properties of the Membrane Periodic Skeleton of the Axon Initial Segment using 3D-Structured Illumination Microscopy (3D-SIM)

축삭 초기 세그먼트 (AIS)는 작용 전위가 시작되고 소마토 수지상 화물을 분류하여 신경 극성의 유지에 기여하는 수송 필터 및 확산 장벽을 구성하는 부위입니다. 주기적 액틴 고리를 포함하는 막 주기적 골격 (MPS)은 구조 단백질 및 상이한 이온 채널을 포함하는 다양한 AIS 단백질을 앵커링하기 위한 스캐폴드를 제공한다. 최근의 프로테오믹 접근법이 상당한 수의 새로운 AIS 성분을 확인했지만, MPS의 구조와 개별 구성 요소의 역할에 대한 세부 사항은 부족합니다. MPS (~ 190nm)에서 개별 액틴 링 사이의 거리는 MPS의 구조적 세부 사항을 해결하기 위해 초분해능 현미경 검사 기술을 사용해야합니다. 이 프로토콜은 배양된 래트 해마 뉴런을 사용하여 3D 구조화된 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 막하 액틴 고리에 비해 MPS 내의 AIS 단백질의 정확한 국소화를 조사하는 방법을 기술한다. 또한, 개별 성분의 주기성 및 액틴 고리에 대한 그들의 위치를 정량적으로 평가하기 위한 분석적 접근법이 또한 설명된다.

배양된 래트 해마 뉴런 및 3D-SIM을 사용하여, AIS에서 액틴 고리 및 MPS의 다른 성분을 시각화하고 측정하기 위한 프로토콜이 기술된다. 이미지 스택의 재구성은 액틴 링의 명확한 주기성을 보여주었습니다 (그림 2A). 우리의 손에서, 알렉사 488 태깅 팔로이드인을 사용하여 시각화 된 MPS에서 액틴 고리의 평균 피크 간 거리는 190.36 ± 1.7 nm (평균 ± SEM)이었다. 이는 MPS에서 액틴 고리 사이의 ∼190 nm의 이전에 보고된 평균 거리와 일치한다. 유사하게, 항-안키린 G 항체가 안키린 G를 가시화하기 위해 사용되었다 (도 2B). 안키린 G와 F-액틴의 공국소화는 공동국재화19,20,21의 PCC를 계산하기 위해 공동국소화 분석 절차를 사용하여 AIS에서 시험되었다.<s...

본 프로토콜은 배양된 래트 해마 뉴런 및 3D 구조화된 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 축색 초기 분절의 막주기적 골격의 액틴 고리 및 기타 성분을 시각화하고 측정하는 방법을 기술한다.

3D 구조화 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 축삭 초기 세그먼트의 멤브레인 주기적 골격의 특성 측정

The axon initial segment (AIS) is the site at which action potentials initiate and constitutes a transport filter and diffusion barrier that contribute to ...

이 프로토콜은 배양된 뉴런의 축삭 초기 세그먼트에서 막 주기적 골격을 분해하는 것을 허용한다. 단백질의 국소화를 조사함으로써 통찰력은 막의 기능으로 주기적으로 골격을 얻을 수 있다. 이 기술의 가장 큰 장점은 견고성과 사용 편의성입니다.구조화 된 조명 현미경은 멤브레인 주기적 골격을 해결할 수 있으며 샘플 준비는 쉽고 간단합니다. 형광 현미경에 대한 이전 경험이있는 사람은이 기술을 쉽게 구현할 수 있습니다. 이 프로토콜은 시료 준비 및 이미징 중에 신호 대 잡음비를 최대화하도록 설계되었습니다.시작하려면 실온에서 12 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드를 사용하여 뉴런을 고정하십시오. 커버 슬립을 포스페이트 완충 용액 중 0.2%BSA로 1회 세척하고, 실온에서 PBS 중의 트리톤 X의 1% 용액에서 10분 동안 인큐베이션한다. 커버슬립을 인산완충용액에서 BSA로 세척하고, BSA를 이용하여 항안키린 G 항체를 인산완충용액에서 하나 내지 200비로 희석한다.표지 슬립에 항체 용액을 첨가하고 섭씨 네 도에서 밤새 인큐베이션한다. 세포를 BSA 인산염 완충 용액에서 1회 인산염 완충용액에서 0.1%Triton X에 한 번, 인산염 완충용액에서 1회 세척한다. 4 개의 태그가 붙은 플루오로를 희석하고, BSA 인산염 완충 용액에 이차 항체를 더 추가하고 커버 슬립에 첨가한다.세포를 BSA 인산염 완충 용액에서 0.1 % Triton X에서 1 회 인산염 완충 용액으로 한 번 씻은 다음 인산염 완충 용액에서 1 회 세척하십시오. 인산염 완충 용액에 태그된 페로딘의 마이크로몰 용액 하나를 준비하고 그것을 세포에 첨가한다. 세포를 소 혈청 알부민 인산염 완충용액에서 0.1%Triton X에 1회 인산완충용액으로 한 번 세척한 다음, 인산완충용액으로 1회 세척한다.커버 슬립을 유리 슬라이드에 장착하려면 슬라이드에 장착 미디어 한 방울을 바르고 커버 슬립을 탈이온수에 담근 다음 부드러운 종이 타월로 탭하여 과도한 물을 제거하십시오. 커버 슬립을 유리 슬라이드 위에 놓고 실온에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 가능하다면 이미징 전에 현미경 검사 시설의 직원과 상담하고 침지 오일 계산기를 사용하여 샘플에 적합한 침지 오일을 선택하십시오.샘플이 준비되면 물이나 에탄올에 담근 면봉으로 청소하여 커버 슬립이 깨끗하고 잔류 물이 없는지 확인하십시오. 샘플을 3D-SIM 현미경에 넣고 이미지를 캡처할 셀을 찾습니다. 관련 레이저 라인의 파워를 조정하십시오.그리고 노출 시간은 시료를 크게 표백하지 않고 신호 대 잡음비를 최대화한다. 샘플의 상한과 하한을 Z 치수로 설정하고 스택 획득을 진행합니다. 스택에서 재구성 알고리즘을 실행하여 수퍼 솔렉션 재구성을 가져옵니다.알려진 아티팩트에 대한 재구성을 확인하고 필요한 경우 매개 변수를 조정하여 수정합니다. SIM 재구성을 광역 필드 이미지와 비교하여 해상도 향상을 관찰합니다. 다색 구조화된 조명 현미경을 수행할 때는 만족스러운 재구성이 준비되면 정렬 알고리즘을 사용하여 서로 다른 채널을 올바르게 정렬합니다.막의 주기적 골격 내의 액틴 고리는 특유의 주기적 외관을 갖는다. 액틴 링이 보이는 모든 초점 평면을 사용하여 이미지 분석 소프트웨어에서 최대 강도 프로젝션 이미지를 생성합니다. 최대 강도 프로젝션 이미지에서 눈에 보이는 인접한 링에 수직 선을 그리고 소프트웨어의 라인 플롯 프로파일 기능과 함께 형광 강도를 기록합니다.평균 인터 피크 거리를 계산하려면 라인 프로파일에서 로컬 최대값을 기록하고 인접한 개별 형광 강도 피크 사이의 거리를 측정합니다. 막 주기적 골격에서 액틴 고리를 갖는 상이한 단백질의 공동국재화를 평가하기 위해, 액틴 및 후보 단백질의 SIM 재구성에 대한 공동국소화 분석 절차를 실행한다. 수동으로 선택 영역을 그려 축삭 초기 세그먼트를 관심 영역으로 정의하고, 소프트웨어 플랫폼에서 쉽게 공동 현지화 플러그인을 만들고, 분석을 실행하여 공동 지역화에 대한 Pearson의 상관 계수를 계산합니다.SIM 이미지 분석 동안, 이미지 스택의 재구성은 액틴 링의 명확한 주기성을 보여주었습니다. 안키린 G.The 안키린 G와 액틴 고리의 공국소화를 가시화하기 위해 항안키린 G 항체를 사용하여 피어슨의 상관계수를 계산하기 위해 공동국재화 분석 절차를 사용하여 축삭 초기 세그먼트에서 시험하였다. 안키린 G와 액틴 고리 형광의 공국재화에 대한 피어슨의 상관계수는 0.36 플러스 또는 마이너스 0.03이었다.올바른 침수 오일을 사용하고 레이저 파워와 노출 시간을 조정하여 그리드 라인을 볼 수 있도록하는 것이 중요합니다. 단백질이 막 주기적 골격의 일부라고 결정되면, 그 기능을 조사하고 막 주기적 골격을 유지하는 데 확립 할 수 있습니다. 예를 들어, 액틴 고리에 대한 단백질을 녹다운시키는 효과를 분석할 수 있다.초분해능 현미경 기술의 개발은 축삭 초기 세그먼트가 액틴 고리, 스펙트럼 및 안키린으로 구성된 막 주기적 골격을 포함한다는 것을 알고있는 이유입니다. SIM을 통해 연구자들은 멤브레인 주기적 골격 구성 요소를 쉽게 시각화하고 살아있는 세포에서 액틴 고리를 볼 수있었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

뉴런 축삭돌기와 수상돌기를 나타내는 쥐 피질 뇌 조직의 고정된 부분을 취합니다. 수상돌기는 축삭돌기와 함께 시냅스를 형성하는 수지상 가시로 알려진 돌출부를 가지고 있습니다. 지질에 결합하는 오스뮴-페로시아나이드로 조직을 배양한 다음, 이미징을 위한 구조적 대비를 향상시키는 또 다른 오스뮴 적용을 수행합니다. 거대분자에 결합하고 대비를 향상시키는 중금속 화합물로 얼룩이 있습니다. 수지 포매를 위해 알코올 농도를 증가시켜 탈수합니다. 티슈를 레진에 삽입하고 홀더에 장착한 다음 금으로 코팅하여 이미징 품질을 최적화합니다. 3차원 이미징을 위해 집속 이온 빔 주사 전자 현미경을 사용합니다. 이온 빔을 사용하여 수지가 내장된 조직의 얇은 층을 제거하여 이미징 표면을 노출시킵니다. 노출된 표면에 전자빔의 초점을 맞추고 후방 산란된 전자를 검출하여 이미지를 생성합니다.  연속 슬라이싱 및 이미징을 수행하고 3차원 이미지를 재구성하여 구문으로 연결된 피질 신경 네트워크를 드러냅니다.

Synaptically Linked Neuron의 3D 재구성을 위한 Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy

이 문서는 구조적 조명 현미경 (SIM)을 사용하여 체외에서 해마 신경 세포에서 이미지 돌기 쪽을 작동 프로토콜을 설명합니다. SIM을 사용하여 초 고해상도 현미경 개선 된 세부 사항과 함께 개별 돌기 쪽의 영상을 허용, 크게 세 가지 차원 공간에서 빛의 회절 한계를 넘어 이미지 해상도를 제공합니다.

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

살아있는 세포 내부의 동적 단백질에 대한 시공간 정보는 생물학을 이해하는 데 매우 중요합니다. f3D-SIM(fast 3D-structured illumination microscopy)이라고 하는 초고해상도 현미경 검사의 한 유형은 박테리아의 사이토키네틱 Z 고리에 대한 고유한 정보, 즉 구슬 모양의 모양과 고리 내 FtsZ의 빠른 역학을 모두 보여줍니다.

고속 3D 구조 조명 현미경을 사용하여 라이브 박테리아의 Cytokinetic Z 반지의 슈퍼 해상도 이미징 (F3D-SIM)

이 기사는 여러 색상의 광학 초해상도로 동적 생물학적 과정을 이미지화하기 위해 TIRF-SIM(Total Internal Reflection Fluorescence Illumination)으로 작동하는 구조화 조명 현미경의 조립 및 작동에 대한 심층 가이드를 제공합니다.

여러 색상과 고속에서 구조화 조명 TIRF 현미경에 가이드

여기, 우리가 모터 뉴런 프로젝션과 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 배아에서 축 삭 arborization 시각화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 모터 뉴런에 대 한 immunostaining, 후 우리는 후속 정량 분석에 대 한 이미지 배아를 빛 시트 형광 현미경 검사 법 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 조직에 있는 다른 신경 탐색 프로세스에 적용 됩니다.

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

이 프로토콜은 살아있는 3차원 이미징을 위해 세균 샘플을 준비하고 장착하는 방법과 이러한 이미지에서 대장균의 3차원 모양을 재구성하는 방법을 설명합니다.

정확한 세포 표현과 정확한 단백질 국소화를 위한 세균 세포의 3차원 이미징

이 프로토콜은 1 차적인 신경 배양에서 단백질 공동 국소화를 공부하기 위하여 초해상도 현미경 검사를 채택하는 방법을 보여줍니다.

1차 뉴런에서 단백질과 시냅스 마커의 공동 국소화를 연구하는 초해상도 이미징

이 프로토콜은 극저온 구조조명 현미경을 사용하여 생물학적 냉동 보존 샘플을 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 우리는 U2OS 세포의 세포 골격을 화상 진찰하여 방법론을 보여줍니다.

극저온 보존 된 세포에서 극저온 구조 조명 현미경 데이터 수집

직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)는 뮤린 해마의 수지상 척추를 이미지 및 분석하기 위해 적용된다.

수지상 척추 연구를 위한 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)

이 프로토콜은 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경을 구축하는 방법과 세포골격 네트워크 시각화를 위한 사용법에 대해 자세히 설명합니다.

세포골격 네트워크의 시각화를 위한 맞춤형 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경의 설계 및 구축

배우세요 3D-SIM을 사용하여 배양된 rat hippocampal 뉴런의 축삭 초기 세그먼트에서 액틴 링의 주기적 구조를 시각화하고 단백질 공동국소화를 분석하는 방법을. 이 기법은 세포 골격 연구에 필수적입니다.

3D 구조화 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 축삭 초기 세그먼트의 멤브레인 주기적 골격의 특성 측정

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