2광자 현미경을 사용하여 만성 일방적 요관 폐쇄가 사구체 과정에 미치는 영향을 정량화

이 연구에서 제시된 데이터에서 신장 기능, 염증 및 섬유증에 대한 일방적 인 요관 폐쇄의 극적인 효과를 보여줍니다. 그것은 우리가 일방적 인 요관 폐쇄의 병태 생리 학적 메커니즘을 이해하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 주요 장점은 세포-세포 상호 작용, 세포 내 사건을 연구하고 기능하는 신장 내에서 역동적 인 방식으로 구조와 기능을 연관시키는 능력입니다.

요관 시술을 시연하는 것은 우리 연구실의 외과 의사 인 Silvia Campos-Bilderback 박사가 수행합니다. 시작하려면 쥐를 마취 한 다음 정중선을 따라 절개를하고 왼쪽 신장을 찾아 주변 복막 기관과 분리하십시오. 신장 동맥, 신장 정맥 및 요관으로 구성된 신장 척추를 찾은 후 섬세한 구조를 손상시키지 않고 요관을 분리하십시오.

집게를 사용하여 요관 주위에 3-0 봉합사를 고리로 묶은 다음 첫 번째 매듭의 양쪽에 몇 밀리미터의 매듭을 묶어 완전히 막히십시오. 요관이 묶이면 연속적인 근육층을 조심스럽게 닫은 다음 복부를 완전히 닫습니다. 수술용 스테이플로 외부 피부를 닫습니다.

수술 준비를 위해 면도 한 왼쪽 측면이 평평하고 똑바로 향하도록 측면에 유치 정맥 접근 라인이있는 마취 된 쥐를 놓습니다. 쥐의 앞발이 뒷발과 마찬가지로 서로 닿도록하십시오. 쥐의 위치가 되면 갈비뼈 바로 아래의 왼쪽 측면을 촉지하여 신장을 느끼고 복부의 자연스러운 위치를 결정한 다음 면도 부위를 따라 영구 마커를 사용하여 선을 그리고 신장 센터를 코에서 꼬리 방향으로 양분합니다.

한 쌍의 톱니 집게를 사용하여 피부를 잡고 위로 들어 올리고 한 쌍의 지혈제로 영구 마커 라인을 꼬집어 밑에있는 혈관계를 부수고 출혈을 예방합니다. 출혈을 최소화하기 위해 얇은 외부 근육층에 대해 절차를 반복하십시오. 얇은 내부 복부 근육층을 최종 절개하려면 신장을 촉지하여 크기와 위치를 추정하고 한 쌍의 집게로 내부 근육층을 들어 올린 다음 신장 위의 피부를 양분하는 선을 신장의 예상 크기의 약 1/3 인 지혈제로 분쇄하십시오.

집게로 근육층을 잡으면서 마지막 절개를하십시오. 다음으로, 양손에 집게를 사용하여 아래쪽으로 작동하는 핸드 오버 핸드 기술로 신장의 아래쪽 극에서 신장 지방을 잡고 잡습니다. 한 손으로 지방을 단단히 잡고 지방을 당기고 절개를 통해 신장을 매우 부드럽게 짜십시오.

신장이 통과하지 못하면 절개를 쉽게 넓히십시오. 모세관 루프에 박힌 백혈구 또는 WBC를 식별하려면 Hoechst 33342 핵 염색을 쥐 무게 kg 당 8 마이크로 그램으로 내 정맥 접근 라인을 통해 투여하십시오. 현미경에서 노출된 신장을 접시 가장자리에 약간 회전시켜 신장의 복부 쪽이 커버 슬립에 닿고 등쪽이 가장자리에서 반대쪽을 향하도록 합니다.

움직임을 더욱 최소화하려면 신장의 등쪽에 식염수를 적신 멸균 2x2 거즈 패드 2개를 포장하여 신장의 복부 쪽과 가장자리의 접촉을 강화합니다. 샘플이 배치되면 이중 패스 로다민 FITC 큐브를 사용하여 에피형광 조명 아래에서 현미경 접안렌즈를 통해 살펴봅니다. 샘플 위치에서 움직임이 감지되면 거즈가 신장 아래로 밀리지 않도록 조정하여 약간 조정하십시오.

흉부가 접시에서 더 멀어지도록 쥐를 약간 굴립니다. 에피형광 조명을 사용하여 신장 표면을 스캔하고 전동 스테이지 컨트롤러와 연결된 소프트웨어를 사용하여 사구체 위치를 표시합니다. 2 광자 조명 아래의 각 색상 채널에 대해 표시된 각 사구체 상단의 얕은 3D 볼륨을 배경 이미지로 사용합니다.

이미징 소프트웨어의 표시 옵션에서 의사 색상 팔레트를 사용하여 사구체 모세관 루프의 배경 형광의 희미한 강도를 시각화합니다. 표재성 혈관을 초점으로 사용하여 형광 Texas Red RAP 혈청 알부민 또는 TRRSA를 천천히 주입하면서 관주위 혈관계 및 모세관 루프의 강도가 포화 바로 아래에 있을 때까지 전신 분포로 인한 형광의 상승 및 하강을 관찰합니다. 10분 후, 1마이크로미터 간격으로 표시되고 이미징된 모든 사구체에 대한 3D 볼륨을 획득합니다.

모세관 루프 또는 관주위 용기 중 적절한 용기를 찾은 다음 이미지 수집 소프트웨어의 라인 스캔 기능을 사용하려면 용기가 수직이어야 하므로 회전 기능을 사용하여 이미지를 회전합니다. 용기가 회전하고 평평하게 놓이면 획득 메뉴에서 XT 기능을 선택하고 4, 000 라인을 스캔하도록 설정하십시오. 세그먼트의 최대 직경에 초점면으로 검사 할 용기를 가로 질러 선을 배치하십시오.

그런 다음 컬러 합성 이미지를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 스냅샷 찍기 탭을 선택하여 라인 스캔이 촬영된 영역의 참조 이미지를 생성합니다. 즉시 시작 버튼을 클릭하여 선박의 라인 스캔을 캡처합니다. 나중에 라인 스캔을 이미지 처리 소프트웨어로 가져와 RBC 유량을 결정합니다.

측정값 드롭다운 메뉴에서 영역 통계 표시 대화 상자를 열고 단일 선 그리기 도구를 선택하여 RBC 그림자의 기울기와 일치하는 선을 그립니다. 선의 너비와 높이를 기록한 후 방정식을 사용하여 속도를 계산한 다음 평균 5개의 계산을 얻어 각 라인 스캔의 속도를 보고합니다. 이미징 필드에서 사구체를 중앙에 놓고 사구체 표면에서 시작하여 30-35 마이크로 미터에서 끝나는 3D 데이터 세트를 가져옵니다.

Z 방향으로 1마이크로미터 스텝 크기를 사용합니다. 모세관 루프에서 적색 염료의 배제와 상응하는 핵 얼룩을 찾아 청색 Hoechst 채널과 텍사스 적색 알부민 채널을 비교하여 WBC를 식별합니다. WBC가 3개의 광학 섹션에 걸쳐 정적으로 나타나는 경우 셀을 부착된 것으로 정의한 다음 1마이크로미터 간격으로 취한 사구체 상단에서 10개의 광학 섹션당 발생 값을 보고합니다.

뮌헨 Wistar Fromter 또는 MWF 래트에서 필드 당 사구체의 수는 처리되지 않은 래트에서보다 5 주 UUO 그룹에서 증가했다. Sprague-Dawley 쥐 또는 SD 쥐는 표면 사구체가없는 것에서 일방적 인 요관 폐쇄 5 주 후 필드 당 2.02로 증가했습니다. 신장 표면을 보기 위해 3차원 재구성 이미지를 관찰하였다.

SD 래트에서 5 주간의 편측 요도 폐쇄는 MWF에서 볼 수있는 정상 세뇨관 상피와 유사한 영역을 초래하지 않았으며, 치료되지 않았으며 부분적으로 5 주 UUO MWF 래트에서 나타났습니다. 신장 혈관 역학의 연구에서, 신장 혈류는 치료되지 않은 쥐에 비해 5 주 UUO MWF 및 SD 그룹에서 현저하게 감소되었다. 사구체 모세관 루프 내 RBC 속도는 5주 UUO MWF 및 SD 래트에서 미처리 MWF 래트에 비해 유의하게 감소하였다.

추가적으로, 처리되지 않은 MWF 래트는 상단으로부터 10개의 광학 섹션당 더 적은 WBC를 갖는 반면, 5주 UUO MWF 및 5주 UUO SD 래트에서는 그 수가 증가하였다. 편측성 요도 폐쇄로 알부민 투과성의 증가가 나타났습니다. Bowman 공간 내의 알부민 축적은 일방적 인 요도 폐쇄 후 강렬했습니다.

S1 세그먼트는 치료되지 않은 MWF 래트에서 생리학적 조건으로 관찰된 바와 같이 다량의 알부민을 엔도사이토시스한다. MWF 또는 SD 쥐에서는 5주간의 편측성 요도 폐쇄 후 동일한 흡수가 관찰되지 않았습니다. 시간 경과에 따른 프로세스를 연구하기 위한 반복 이미징, 이미징을 위한 특정 영역의 고정, 고해상도 현미경을 수행하기 위한 고정 조직의 후속 활용과 같은 다양한 방법을 이 기술과 함께 수행할 수 있습니다.

이 기술은 파괴적인 기술로 간주됩니다. 이를 통해 조사자는 많은 새로운 질문에 답할 수 있습니다. 이를 통해 새로운 통찰력이 제공되고 패러다임 전환 데이터가 획득되었습니다.