Name: 2광자 현미경을 사용하여 만성 일방적 요관 폐쇄가 사구체 과정에 미치는 영향을 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 배우세요 2광자 현미경을 사용하여 Munich Wistar Fromter 쥐에서 만성 일방적 요관 폐쇄가 사구체 역학과 신장 기능에 미치는 영향을 정량화하는 방법을. 이 기술은 세포 상호작용과 신장 병태생리학 연구에 유용합니다.

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이 연구는 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 보조금 RO1DK091623 및 P30DK079312(BAM에)의 지원을 받았습니다. 나노스트링 분석을 수행한 미시간 주립 대학의 연구 기술 지원 시설(RTSF)의 유전체학 핵심 시설 직원에게 감사드립니다.

<ol><li>Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Indiana+O%27Brien+center+for+advanced+renal+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).</li>
<li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).</li>
<li>Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+angiotensin+on+the+filtration+of+protein+in+the+rat+kidney%3A+a+micropuncture+study%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study.</a> Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+imaging+and+microscopy+for+dynamic+processes+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats.</a> Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).</li>
<li>Huber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+functional+podocin-nephrin+complex%3A+mutations+in+the+NPHS2+gene+disrupt+nephrin+targeting+to+lipid+raft+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains.</a> Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).</li>
<li>Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+rat+homologue+of+podocin%3A+expression+in+proteinuric+states+and+in+developing+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology+JASN%22%5BJournal%5D)">Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).</li>
<li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+glomerular+filtration+defect+and+severe+renal+disease+in+podocin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).</li>
<li>Schießl, I., Bardehle, S., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+nephrons+in+BALB%2Fc+and+C57BL%2F6+mice+facilitate+in+vivo+multiphoton+microscopy+of+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney.</a> PloS One. 8 (1), 52499(2013).</li>
<li>Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li>
<li>Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximal+tubular+injury+and+rapid+formation+of+atubular+glomeruli+in+mice+with+unilateral+ureteral+obstruction%3A+a+new+look+at+an+old+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+physiology%22%5BJournal%5D)">Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model.</a> American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).</li>
<li>Yang, H. -C., Zuo, Y., Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today.+Disease+Models%22%5BJournal%5D)">Models of chronic kidney disease.</a> Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).</li>
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<li>Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+recruitment+to+glomeruli+in+mice+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).</li>
<li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).</li>
<li>El Karoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+stress+drives+proteinuria-induced+kidney+lesions+via+Lipocalin+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2.</a> Nature Communications. 7, 10330(2016).</li>
<li>VA, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Research Notes. 2, 80(2009).</li>
<li>Springer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+transcriptome+and+bioinformatics+approach+to+unilateral+ureteral+obstructive+uropathy+in+the+fetal+sheep+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model.</a> The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).</li>
<li>Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+or+let+die%3A+Is+there+any+cell+death+in+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Live or let die: Is there any cell death in podocytes.</a> Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).</li>
<li>Kim, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+angiopoietin-1+in+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Electrolyte+%26+Blood+Pressure+E+%26+BP%22%5BJournal%5D)">The role of angiopoietin-1 in kidney disease.</a> Electrolyte & Blood Pressure E & BP. 6 (1), 22-26 (2008).</li>
<li>Liu, F., Zhuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+receptor+tyrosine+kinase+signaling+in+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972(2016).</li>
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<li>Mühlberger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+bioinformatics+analysis+of+proteins+associated+with+the+cardiorenal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome.</a> International Journal of Nephrology. 2011, 809378(2010).</li>
<li>Satirapoj, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periostin%3A+novel+tissue+and+urinary+biomarker+of+progressive+renal+injury+induces+a+coordinated+mesenchymal+phenotype+in+tubular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%2C+Dialysis%2C+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells.</a> Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).</li>
<li>Fengxin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+contributes+to+renal+fibrosis+by+promoting+tubular+epithelial+cell+cycle+arrest+at+G2%2FM%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M.</a> Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+glomerular+permeability+of+fluorescent+macromolecules+using+2-photon+microscopy+in+Munich+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052(2013).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+normal+kidney+filters+nephrotic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells%3A+retrieval+is+disrupted+in+nephrotic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states.</a> Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).</li>
<li>Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+bottom+and+using+it%3A+Offsets+and+sensitivity+in+the+detection+of+low+intensity+values+in+vivo+with+2-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy.</a> Intravital. 2 (1), 23674(2014).</li>
<li>Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+recruitment+to+the+inflamed+glomerulus%3A+a+critical+role+for+platelet-derived+P-selectin+in+the+absence+of+rolling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling.</a> Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).</li>
<li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).</li>
<li>Finsterbusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patrolling+monocytes+promote+intravascular+neutrophil+activation+and+glomerular+injury+in+the+acutely+inflamed+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).</li>
<li>Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+view+of+macula+densa+cell+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">A new view of macula densa cell protein synthesis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

사구체 생리학에 대한 연구는 다양한 접근법, 특히 미세 천자의 사용, 분리 된 사구체의 관류 및 현미경 검사를 보았습니다. 뮌헨 Wistar 래트, Fromter 및 Simonsen 균주에서 표면 사구체의 가용성은 생체 내 동적 연구를 허용했습니다. 이 기술을 채택하는 연구자에게 한 가지 중요한 참고 사항은 연구 간에 일관된 이미지를 유지하기 위해 획득 매개변수를 설정해야 하므로 조직의 자가형광이 일관되게 유지된다는 것입니다. 이중 패스 플루오레세인/로다민 에피형광 큐브를 활용하고 게인 설정을 녹색 및 적색 방출 채널로 조정하여 접안렌즈를 통해 보이는 것을 컴퓨터 화면에서 모방하면 서로 다른 현미경 시스템 간에도 자가형광에서 일관된 색상 서명을 보장할 수 있습니다.
Fromter 균주는 총 사구체 수가 감소하고 ~75%가 정상이며 수컷은 약 12주령에 자발적으로 고혈압이 발생하여 진행성 단백뇨 및 후속 국소 사구체 경화증과 함께 결국 신부전으로 사망하기 때문에 광범위하게 사용되었습니다12. 이 쥐의 사용과 광독성 감소, 침투 깊이 개선 및 여러 형광 프로브를 동시에 볼 수있는 능력을 갖춘 2 광자 현미경의 추가는 새로운 발견 1,4,5를위한 길을 열었습니다. 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어의 개발로 정량적 데이터는 이제 모든 2 광자 실험실의 표준이되었습니다. 여러 정량적 기술이 개발되어 생리학적 및 질병 상태 1,4,5,27,28,29,30 하에서 사구체, 근위 세뇨관, 혈관 및 간질 과정에 적용되었습니다.
트랜스제닉 마우스 생성 시설은 신장 생리학 및 병리학 연구에 새로운 차원을 추가했으며, 이를 2광자 현미경과 결합하여 신장 구조 및 기능에서 특정 유전자 산물의 중요성을 더욱 설명할 때까지는 시간 문제였습니다. 그러나, 마우스 사구체는, 아주 어린 마우스를 제외하고, 신장의 표면으로부터 100 μm 이상 위치한다9. 2광자 현미경은 분해능으로 20μm에서 50μm 사이의 깊이에서 수행하는 것이 가장 좋으며, 방출된 빛의 산란 및 헤모글로빈과의 상호 작용으로 인한 흡수로 인해 형광 강도가 급격히 감소합니다. 따라서, 표면 사구체를 유도할 필요가 있었다. 일반적으로 사용되는 접근법은 12 주 동안 장기간 일방적 인 방해 모델입니다. 이러한 모델은 기준선 결정을 허용하지 않기 때문에 연구중인 프로세스에서 UUO의 효과를 분리 할 수 없습니다.
MWF 쥐를 사용하여 기준선 사구체 기능을 UUO 이후의 기능과 비교할 수 있습니다. 이 UUO 모델은 염증과 빠른 섬유증 속도를 유도하는 것으로 알려져 있으며 CKD 및 섬유증10,11,12를 연구하는 데 사용되었습니다. 예상대로, MWF와 SD 래트 모두에서 표면 사구체가 증가했다. 더욱이, MWF 및 SD 래트에 대한 UUO 이후에 얻어진 정량적 결과는 매우 유사했다. 여기에 기록된 혈류의 감소는 UUO 이후의 현미경 데이터와 미세 천자 데이터3을 비교한 적이 있습니다. 또한 관상 및 간질 조직학이 현저하게 변경되고 PT는 여기에보고 된 바와 같이 알부민 세포 내 이입이 부족하여 대부분 기능하지 않는다는 것이 잘 알려져 있습니다. 그림 2와 그림 3의 연구는 사구체 및 관주위 모세혈관에서 RBC 유속의 극적인 감소와 향상된 WBC 접착력을 보여줍니다. 흐름의 감소는 WBC 접착 및 룰로 형성으로 인한 모세관 막힘으로 인한 것일 수 있습니다.
염증을 더 평가하기 위해 알부민 투과성을 정량화하고 10 배 증가하는 것으로 나타났습니다. 추가로, 단리된 사구체는 다양한 신장 질환 상태에서 신장 염증에서 증가하는 것으로 이전에 알려진 많은 유전자에 대해 mRNA 발현이 증가한다는 것을 보여주었다 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . 사구체 표면 밀도와 알부민 투과성의 증가는 12 주 UUO 데이터에서 볼 수 있듯이 점진적이었습니다. 본 데이터는 사구체가 UUO 모델에서 상당한 구조적 손상, 염증 및 분자 변화를 겪는다는 것을 직접 보여주는 최초의 데이터입니다. 결과는 UUO 후 양 신장 생검을 분석 한 전체 신장 조직에 대한 초기 연구와 일치하여 여러 염증 마커가19 상승한 것으로 나타났습니다. 본 결과는 이전에 피질 조직에 대해서만 알려진 사구체 내에 현저한 염증이 존재함을 나타냅니다.
본 데이터는 12주 수신과 정상 사구체 사이의 접착 분자 발현, 보체 침착 및 호중구 침윤에서 변화가 발견되지 않은 마우스의 이전 연구와 다릅니다31. 또한 Hickey 실험실은 12 주 UUO 모델을 사용하여 생쥐의 사구체에서 면역 반응을 연구했습니다. 그들은 4 주 된 마우스 사구체와 폐쇄 후 사구체32,33 사이의 호중구 침윤에 차이가 없음을 발견했습니다. 이 후기 연구는 막힌 신장의 골반에서 소변을 배출 한 후에 수행되었습니다. 우리는 UUO가 사구체 기능에 미치는 영향을 인위적으로 제거하지 않고 생체 내에서 사구체 기능에 미치는 영향을 결정하고 싶었 기 때문에이를 수행하지 않았습니다. 마지막으로, 마우스에서 UUO의 사용은 표면 아래 100 μm 이상에서 사구체를 이미징하는 것으로 대체되고 있습니다. 가능한 한, 해상도와 강도의 절충이 있으며, 둘 다 50 μm34를 초과함에 따라 크게 감소합니다.
제시된 결과는 조직 학적 변화, 무관 사구체의 형성, 염증, 섬유증, 혈역학10,11,12에 관한 기존 문헌의 데이터를 함께 모으는 것은 놀라운 일이 아닙니다. WBC 접착, 룰로 형성, 사구체 분자 염증 마커 및 알부민 투과성 증가를 포함하여 제시된 데이터는 이 UUO 모델에서 5주에도 진행 중이며 12주에도 존재하는 광범위한 염증을 추가로 나타냅니다. 분명히, 만성 UUO는 생리적 상태가 아니며, 표면 사구체를 유도하기 위해 UUO를 사용하는 것은 손상 모델을 나타냅니다. 생리적 조건 하에서 표면 사구체를 갖는 MWF 쥐는 손상이 발생할 때 종단적으로 연구될 수 있다. 형질 전환 쥐를 생성하는 것이 가능하며 수많은 연구자들이 특정 질문을하기 위해 바이오 센서로 쥐를 만들고 있습니다. 특히, 위스콘신 의과 대학은 현재 MWF 쥐의 식민지를 가지고 있으며 생리 학적 및 병리학 적 조건에서 사구체 과정을 연구 할 목적으로 형질 전환 쥐를 만들었습니다. 이 MWF 쥐는 정상, 질병 및 유 전적으로 변형 된 쥐의 사구체 과정을 연구 할 수있는 좋은 기회를 제공합니다.

사구체 과정, 특히 족세포 생물학을 이해하는 것은 50 년 넘게 목표였습니다. 표면 사구체를 가진 뮌헨 Wistar 쥐는 생리학적 및 병리학적 과정의 다양한 측면을 이해하기 위해 미세 천자 연구를 포함한 이러한 연구에서 중심적인 역할을 했습니다1,2,3. 사구체 구성 요소를 생체 내에서 연구하기위한 현미경의 활용은이 독성 노출을 최소화하고 침투 깊이 1,2를 증가시키는 2 광자 현미경의 출현까지 광독성의 영향으로 인해 제한되었습니다. 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어의 급속한 발전과 함께, 이것은 단일 설정 1,4,5에서 몇 시간 동안 3 차원 (3D) 및 4 차원 (시간) 연구를 가능하게했습니다.
사구체 모세 혈관 혈류의 정량화, 약물에 대한 반응의 혈관 수축 및 확장, 투과성 및 투과성 및 염증에 대한 전하의 영향은 연구 된 사구체 과정 중 일부일뿐입니다. 또한, 근위 세뇨관의 S1 세그먼트를 식별 할 수 있으며, S1 및 S2 관상 상피의 거동 차이를 정량화 할 수 있습니다 1,4. 마우스에 대한 연구, 특히 마우스 형질 전환 시설의 보편적 이용 가능성으로 인해 사구체 질환 과정의 분자 생물학에 대한 이해가 급속히 발전했습니다. 개별 단백질은 녹아웃 연구, 특히 단백뇨 6,7,8과 관련하여 사구체 기능 장애를 담당합니다. 그러나 사구체 영상 연구를 위한 마우스 모델의 활용은 연구된 수많은 균주에서 사구체가 표면 아래 100μm 이상이기 때문에 제한적이었습니다9.
이로 인해 연구자들은 마우스 모델을 개발하고 활용하여 연구 할 수있는 표면 사구체를 생성하게되었습니다. 가장 일반적인 모델은 완전한 UUO10,11,12를 사용하는 것입니다. 연장 된 UUO 기간이 끝나면 생쥐 신장에는13,14 번 연구 될 수 있고 연구 된 수많은 표면 사구체가 있습니다. 이러한 마우스 연구에서 사구체 생물학에 대한 연장된 UUO의 효과를 결정하기 위한 기준선 또는 대조 연구는 없었습니다. 이것은 빠른 섬유증과 피질 파괴10,11,12를 초래하는 심각하고 장기간의 손상 모델이기 때문에 사구체 과정과 기능에 영향을 미칠 것이라는 가설을 세웠습니다. 이 질문에 답하기 위해 표면 사구체를 가진 뮌헨 Wistar Fromter (MWF) 쥐를 사용하여 대조군 / 기준선 매개 변수를 연구하고 기준선 결과를 UUO 5 주 후 MWF 쥐의 사구체 연구와 비교했습니다. 우리는 또한 UUO 다음에 표면 사구체가없는 Sprague Dawley (SD) 쥐를 연구했습니다. 연구 결과는 MWF 및 SD 쥐에서 5 주간의 UUO가 실제로 표면 사구체의 수를 증가 시킨다는 것을 나타냅니다. 그러나 이들은 사구체 혈류, 염증, 거대분자 투과성 및 크기의 현저한 변화를 가진 비정상적인 사구체였습니다.

<table><tbody><tr><td>70 &마이크로; m 멸균 셀 스트레이너</td><td>Corning</td><td>#421751</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m 멸균 세포 여과기</td><td>Corning</td><td>#421752</td><td></td></tr><tr><td>CA Micro scissors 모델 1C300</td><td>전자 현미경 과학</td><td>Cat# 72930</td><td></td></tr><tr><td>전기 가열 패드</td><td>Sunbeam</td><td>Kroger</td><td></td></tr><tr><td>핸들링 집게</td><td>전자 현미경 과학</td><td>Cat# 72962</td><td></td></tr><tr><td>Kelly 지혈 집게(직선)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>Cat#72930</td><td></td></tr><tr><td>Leica Dive SP-8 다광자 도립 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>참고: 버전 7.1r1</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee 티타늄-사파이어 레이저</td><td>Spectra-Physics</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mayo 해부 가위</td><td>전자 현미경 과학</td><td>Cat# 78180-1C3</td><td></td></tr><tr><td>메타모프 이미지 처리 소프트웨어</td><td>분자 역학</td><td>Cat# 78266-04</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td>, <td>Microsoft Corportation</td><td>2007 버전</td><td></td></tr><tr><td>, Quant-iT, RNA 분석 키트</td><td>, Invitrogen/ThermoFisher</td>, <td>Q33140</td><td></td></tr>, <tr><td>Reptitherm 언더탱크 히터,</td><td>Zoomed,</td><td>Amazon</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute, Cleanup Kit(스핀 열),</td> <td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr>, <tr><td>RPE 버퍼</td>, <td>Qiagen</td><td>1018013</td><td></td></tr>, <tr><td>Strate-Line 오토클레이브 테이프</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 11-889-1</td><td></td></tr><tr><td>TRI 시약</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Willco-dish 커버슬립 바닥 접시 (50 mm/40 mm 커버슬립)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>Cat# 70665-07</td><td></td></tr></tbody></table>

2광자 현미경을 사용하여 만성 일방적 요관 폐쇄가 사구체 과정에 미치는 영향을 정량화

Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

신장의 동적 생리학을 탐구하기 위해 적합한 동물 질병 모델에 새로운 현미경 방법을 적용하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 표면 사구체를 가진 쥐는 생체 내 2 광자 현미경을 사용하여 생리 학적 및 병리 생리 학적 과정을 조사 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 사구체 모세 혈관 혈류의 정량화와 약물, 투과성 및 염증에 대한 반응의 혈관 수축 및 확장은 연구 할 수있는 과정 중 일부일뿐입니다. 또한, 형질전환 래트, 즉 형광 염료 및 기타 분자 바이오마커 접근법으로 표지된 족세포는 단백질-단백질 상호작용 및 특정 분자 변화의 영향을 직접 모니터링하고 정량화하기 위해 증가된 분해능을 제공합니다.
생후 4 주 후에 표면 사구체가 부족한 마우스에서는 몇 주 동안 일방적 인 요관 폐쇄 (UUO)를 사용하여 표면 사구체를 유도했습니다. 이 유도 모델은 기준 연구를 허용하지 않기 때문에 생리학적 조건에서 표면 사구체를 갖는 뮌헨 Wistar Frömter(MWF) 쥐의 UUO 모델에서 사구체 과정에 대한 UUO의 영향을 정량화했습니다. 5 주 이상 동안 UUO 모델은 총 신장 형태, 관상 주위 및 사구체 미세 혈관계, 세뇨관 상피의 구조 및 기능에 상당한 변화를 유도했습니다. 사구체 및 관주위 적혈구(RBC) 흐름이 유의하게 감소했는데(p < 0.01), 아마도 사구체 및 관주위 모세혈관 내에서 백혈구(WBC)의 부착이 크게 증가했기 때문일 것입니다. 알부민의 사구체 체질 계수는 처리되지 않은 MWF에서 0.015± 0.002에서 5 주 된 UUO MWF 쥐에서 0.045 ± 0.05로 증가했습니다. 12주간의 UUO는 알부민에 대한 표면 사구체 밀도와 사구체 체질 계수(GSC)의 추가 증가를 가져왔습니다. 사구체를 가로질러 여과된 형광 알부민은 근위 세뇨관에 의해 재흡수되지 않았다. 이러한 데이터는 UUO를 사용하여 표면 사구체를 유도하면 정상적인 사구체 과정과 질병 변화를 연구하고 해석하는 능력이 제한된다는 것을 시사합니다.

여기에서는 표면 사구체가있는 뮌헨 Wistar Fromter 쥐에서 2 광자 현미경을 사용하여 사구체 역학 및 기능에 대한 장기간의 요관 폐쇄의 영향을 정량화하는 프로토콜을 제시합니다.

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface ...

이 연구에서 제시된 데이터에서 신장 기능, 염증 및 섬유증에 대한 일방적 인 요관 폐쇄의 극적인 효과를 보여줍니다. 그것은 우리가 일방적 인 요관 폐쇄의 병태 생리 학적 메커니즘을 이해하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 주요 장점은 세포-세포 상호 작용, 세포 내 사건을 연구하고 기능하는 신장 내에서 역동적 인 방식으로 구조와 기능을 연관시키는 능력입니다.요관 시술을 시연하는 것은 우리 연구실의 외과 의사 인 Silvia Campos-Bilderback 박사가 수행합니다. 시작하려면 쥐를 마취 한 다음 정중선을 따라 절개를하고 왼쪽 신장을 찾아 주변 복막 기관과 분리하십시오. 신장 동맥, 신장 정맥 및 요관으로 구성된 신장 척추를 찾은 후 섬세한 구조를 손상시키지 않고 요관을 분리하십시오.집게를 사용하여 요관 주위에 3-0 봉합사를 고리로 묶은 다음 첫 번째 매듭의 양쪽에 몇 밀리미터의 매듭을 묶어 완전히 막히십시오. 요관이 묶이면 연속적인 근육층을 조심스럽게 닫은 다음 복부를 완전히 닫습니다. 수술용 스테이플로 외부 피부를 닫습니다.수술 준비를 위해 면도 한 왼쪽 측면이 평평하고 똑바로 향하도록 측면에 유치 정맥 접근 라인이있는 마취 된 쥐를 놓습니다. 쥐의 앞발이 뒷발과 마찬가지로 서로 닿도록하십시오. 쥐의 위치가 되면 갈비뼈 바로 아래의 왼쪽 측면을 촉지하여 신장을 느끼고 복부의 자연스러운 위치를 결정한 다음 면도 부위를 따라 영구 마커를 사용하여 선을 그리고 신장 센터를 코에서 꼬리 방향으로 양분합니다.한 쌍의 톱니 집게를 사용하여 피부를 잡고 위로 들어 올리고 한 쌍의 지혈제로 영구 마커 라인을 꼬집어 밑에있는 혈관계를 부수고 출혈을 예방합니다. 출혈을 최소화하기 위해 얇은 외부 근육층에 대해 절차를 반복하십시오. 얇은 내부 복부 근육층을 최종 절개하려면 신장을 촉지하여 크기와 위치를 추정하고 한 쌍의 집게로 내부 근육층을 들어 올린 다음 신장 위의 피부를 양분하는 선을 신장의 예상 크기의 약 1/3 인 지혈제로 분쇄하십시오.집게로 근육층을 잡으면서 마지막 절개를하십시오. 다음으로, 양손에 집게를 사용하여 아래쪽으로 작동하는 핸드 오버 핸드 기술로 신장의 아래쪽 극에서 신장 지방을 잡고 잡습니다. 한 손으로 지방을 단단히 잡고 지방을 당기고 절개를 통해 신장을 매우 부드럽게 짜십시오.신장이 통과하지 못하면 절개를 쉽게 넓히십시오. 모세관 루프에 박힌 백혈구 또는 WBC를 식별하려면 Hoechst 33342 핵 염색을 쥐 무게 kg 당 8 마이크로 그램으로 내 정맥 접근 라인을 통해 투여하십시오. 현미경에서 노출된 신장을 접시 가장자리에 약간 회전시켜 신장의 복부 쪽이 커버 슬립에 닿고 등쪽이 가장자리에서 반대쪽을 향하도록 합니다.움직임을 더욱 최소화하려면 신장의 등쪽에 식염수를 적신 멸균 2x2 거즈 패드 2개를 포장하여 신장의 복부 쪽과 가장자리의 접촉을 강화합니다. 샘플이 배치되면 이중 패스 로다민 FITC 큐브를 사용하여 에피형광 조명 아래에서 현미경 접안렌즈를 통해 살펴봅니다. 샘플 위치에서 움직임이 감지되면 거즈가 신장 아래로 밀리지 않도록 조정하여 약간 조정하십시오.흉부가 접시에서 더 멀어지도록 쥐를 약간 굴립니다. 에피형광 조명을 사용하여 신장 표면을 스캔하고 전동 스테이지 컨트롤러와 연결된 소프트웨어를 사용하여 사구체 위치를 표시합니다. 2 광자 조명 아래의 각 색상 채널에 대해 표시된 각 사구체 상단의 얕은 3D 볼륨을 배경 이미지로 사용합니다.이미징 소프트웨어의 표시 옵션에서 의사 색상 팔레트를 사용하여 사구체 모세관 루프의 배경 형광의 희미한 강도를 시각화합니다. 표재성 혈관을 초점으로 사용하여 형광 Texas Red RAP 혈청 알부민 또는 TRRSA를 천천히 주입하면서 관주위 혈관계 및 모세관 루프의 강도가 포화 바로 아래에 있을 때까지 전신 분포로 인한 형광의 상승 및 하강을 관찰합니다. 10분 후, 1마이크로미터 간격으로 표시되고 이미징된 모든 사구체에 대한 3D 볼륨을 획득합니다.모세관 루프 또는 관주위 용기 중 적절한 용기를 찾은 다음 이미지 수집 소프트웨어의 라인 스캔 기능을 사용하려면 용기가 수직이어야 하므로 회전 기능을 사용하여 이미지를 회전합니다. 용기가 회전하고 평평하게 놓이면 획득 메뉴에서 XT 기능을 선택하고 4, 000 라인을 스캔하도록 설정하십시오. 세그먼트의 최대 직경에 초점면으로 검사 할 용기를 가로 질러 선을 배치하십시오.그런 다음 컬러 합성 이미지를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 스냅샷 찍기 탭을 선택하여 라인 스캔이 촬영된 영역의 참조 이미지를 생성합니다. 즉시 시작 버튼을 클릭하여 선박의 라인 스캔을 캡처합니다. 나중에 라인 스캔을 이미지 처리 소프트웨어로 가져와 RBC 유량을 결정합니다.측정값 드롭다운 메뉴에서 영역 통계 표시 대화 상자를 열고 단일 선 그리기 도구를 선택하여 RBC 그림자의 기울기와 일치하는 선을 그립니다. 선의 너비와 높이를 기록한 후 방정식을 사용하여 속도를 계산한 다음 평균 5개의 계산을 얻어 각 라인 스캔의 속도를 보고합니다. 이미징 필드에서 사구체를 중앙에 놓고 사구체 표면에서 시작하여 30-35 마이크로 미터에서 끝나는 3D 데이터 세트를 가져옵니다.Z 방향으로 1마이크로미터 스텝 크기를 사용합니다. 모세관 루프에서 적색 염료의 배제와 상응하는 핵 얼룩을 찾아 청색 Hoechst 채널과 텍사스 적색 알부민 채널을 비교하여 WBC를 식별합니다. WBC가 3개의 광학 섹션에 걸쳐 정적으로 나타나는 경우 셀을 부착된 것으로 정의한 다음 1마이크로미터 간격으로 취한 사구체 상단에서 10개의 광학 섹션당 발생 값을 보고합니다.뮌헨 Wistar Fromter 또는 MWF 래트에서 필드 당 사구체의 수는 처리되지 않은 래트에서보다 5 주 UUO 그룹에서 증가했다. Sprague-Dawley 쥐 또는 SD 쥐는 표면 사구체가없는 것에서 일방적 인 요관 폐쇄 5 주 후 필드 당 2.02로 증가했습니다. 신장 표면을 보기 위해 3차원 재구성 이미지를 관찰하였다.SD 래트에서 5 주간의 편측 요도 폐쇄는 MWF에서 볼 수있는 정상 세뇨관 상피와 유사한 영역을 초래하지 않았으며, 치료되지 않았으며 부분적으로 5 주 UUO MWF 래트에서 나타났습니다. 신장 혈관 역학의 연구에서, 신장 혈류는 치료되지 않은 쥐에 비해 5 주 UUO MWF 및 SD 그룹에서 현저하게 감소되었다. 사구체 모세관 루프 내 RBC 속도는 5주 UUO MWF 및 SD 래트에서 미처리 MWF 래트에 비해 유의하게 감소하였다.추가적으로, 처리되지 않은 MWF 래트는 상단으로부터 10개의 광학 섹션당 더 적은 WBC를 갖는 반면, 5주 UUO MWF 및 5주 UUO SD 래트에서는 그 수가 증가하였다. 편측성 요도 폐쇄로 알부민 투과성의 증가가 나타났습니다. Bowman 공간 내의 알부민 축적은 일방적 인 요도 폐쇄 후 강렬했습니다.S1 세그먼트는 치료되지 않은 MWF 래트에서 생리학적 조건으로 관찰된 바와 같이 다량의 알부민을 엔도사이토시스한다. MWF 또는 SD 쥐에서는 5주간의 편측성 요도 폐쇄 후 동일한 흡수가 관찰되지 않았습니다. 시간 경과에 따른 프로세스를 연구하기 위한 반복 이미징, 이미징을 위한 특정 영역의 고정, 고해상도 현미경을 수행하기 위한 고정 조직의 후속 활용과 같은 다양한 방법을 이 기술과 함께 수행할 수 있습니다.이 기술은 파괴적인 기술로 간주됩니다. 이를 통해 조사자는 많은 새로운 질문에 답할 수 있습니다. 이를 통해 새로운 통찰력이 제공되고 패러다임 전환 데이터가 획득되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 편측 요관 폐쇄 마우스 모델을 생성하는 절차를 보여줍니다. 이 절차에는 소변 흐름을 막기 위해 마우스의 요관 중 하나를 절단하는 것이 포함됩니다.

편측성 요관 폐색 쥐 모델: 마우스 모델에서 신장의 소변 흐름을 막는 수술 절차

2 광자 현미경 높은 해상도 intavital을 활용하는 기술을 직접 시각화 및 표면 사구체에서 gloemrular 여과를 정량화한다. 이 방법은 정상과 질병 상태 모두에서 거대 분자의 투과 특성을 직접 측정 할 수 있습니다.

뮌헨의 Wistar 쥐에서 2 광자 현미경을 사용하여 형광 고분자의 사구체 투과율을 정량화

비가역적 편측성 요관 폐색(unlateral ureteric obstruction, UUO)의 쥐 모델(murine model)은 절단된 요관을 방광으로 문합하여 요관 폐색이 완화되는 가역적 UUO 모델과 함께 제시됩니다. 이러한 모델은 신장 염증 및 흉터뿐만 아니라 조직 리모델링에 대한 연구를 가능하게 합니다.

돌이킬 수 및 가역 일방적 Ureteric 폐색의 쥐 모델

이 프로토콜에는 전체 신장 작업 업 사 질병 마우스 모델에서을 수행 하는 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가

선물이 2 광자 현미경은 micropipette 쥐, 보 먼의 요도 공간 배치의 사용의 신장 생리학의 2 기초 기술을 결합. 2 광자 현미경의 사용 micropuncture 신장 생리학 연구에 대 한 기존의 현미경의 중요 한 한계를 극복 한다.

보 먼의 공간 2 광자 현미경에 의해 촉진 생쥐에서의 Micropuncture

항체 라벨링, 광학 클리어링 및 고급 광 현미경의 조합은 완전한 구조 또는 장기의 3차원 분석을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 간단한 방법은 두꺼운 신장 슬라이스의 면역 라벨링, 에틸 시나메이트와 광학 클리어링, 3차원 신장 구조의 시각화 및 정량화를 가능하게 하는 공초점 이미징을 결합하는 간단한 방법입니다.

면역 표지된 신장 조직의 광학 클리어링 및 화상 진찰

우리는 양적 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의해 일방적인 요원 방해(UUO)를 가진 마우스의 신장에서 마이크로RNA 발현을 평가하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 UUO를 가진 마우스에 있는 신장 microRNA 발현 단면도및 그밖 병리학 조건의 맥락에서 공부하기 에 적합합니다.

일방적 인 요원 방해와 마우스 신장에서 microRNA 표현의 정량적 실시간 PCR 평가

본 프로토콜은 편측 요관 폐색의 단계적이고 재현 가능한 모델을 설명합니다.

가역적 일방적 요관 폐색의 미성숙한 쥐 모델(An Immature Murine Model of Reversible Unilateral Ureteral Obstruction)

이 프로토콜은 폐쇄성 신병증에서 조직 섬유증의 진행을 연구하기 위해 마우스에서 편측 요관 폐쇄(UUO)를 유도하는 방법을 설명합니다. 여기에는 수술 절차, 수술 후 관리 및 섬유증 평가 방법이 포함됩니다.

신장 간질성 섬유증(Kidney Interstitial Fibrosis) 조사를 위한 일측성 요관 폐쇄 모델(Unilateral Ureteral Obstruction Model for Investigating Kidney Interstitial Fibrosis)

이 논문은 연구자가 장기간의 요관 폐쇄 후 장기적인 구조적 및 기능적 결과를 분석할 수 있는 표준화된 모델을 사용하여 마우스에서 가역적 편측 요관 폐쇄를 수행할 수 있도록 하는 자세한 지침을 제공합니다.

장기간의 일측성 요관 폐색의 역전 후 장기적인 구조적 및 기능적 결과를 평가하기 위한 마우스 모델

배우세요 2광자 현미경을 사용하여 Munich Wistar Fromter 쥐에서 만성 일방적 요관 폐쇄가 사구체 역학과 신장 기능에 미치는 영향을 정량화하는 방법을. 이 기술은 세포 상호작용과 신장 병태생리학 연구에 유용합니다.

2광자 현미경을 사용하여 만성 일방적 요관 폐쇄가 사구체 과정에 미치는 영향을 정량화

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