Name: 거대한 Unilamellar 소포 안에 재구성 된 세포 골격의 신속한 캡슐화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 배우세요 거대한 단층 소포에 세포 골격 단백질을 신속히 캡슐화하는 방법을. 이 기법은 합성 세포 연구에서 세포 골질 재구성과 막 상호작용 연구에 활용됩니다.

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APL은 경험 많은 연구자를위한 훔볼트 연구 펠로우십과 국립 과학 재단 (1939310 및 1817909) 및 국립 보건원 (R01 EB030031)의 지원을 인정합니다.

1. 오일-지질-혼합물의 제조
참고: 이 단계는 클로로포름 취급에 대한 모든 안전 지침에 따라 흄 후드에서 수행해야 합니다.
<ol><li>0.5 mL의 클로로포름을 15 mL 유리 바이알에 담으십시오. 25mg/mL 디올레오일포스포콜린(DOPC) 88μL, 50mg/mL 콜레스테롤 9.3μL, 1mg/mL 디올레오일-포스포에탄올아민-리사민 로다민 B(로다민 PE)( 로다민 PE) 5μL를 15ml 유리 바이알에 넣습니다. 참고 : 실리콘 오일 / 미네랄 오일에서 DOCC와 콜레스테롤의 최종 몰분율은 각각 69.9 %와 30 %입니다. 20-30 몰% 콜레스테롤이 제시된 기술25,26을 사용하여 생성된 GUVs의 막 유동성 및 안정성에 대해 최적화된 농도임을 입증하였다. 생리학적으로, 이들 값은 포유동물 세포 원형질막(6)에서 발견되는 콜레스테롤 농도 범위 내에 잘 있다. 지질 스톡은 클로로포름 중의 용액으로서 획득되고 -20°C에서 저장된다. 지질 스톡 바이알은 열리기 전에 실온에 적응해야합니다.</li>
	<li>두 번째 15 mL 바이알에 7.2 mL의 실리콘 오일 및 1.8 mL의 광유를 피펫 한다 (물자의 표 참조). 일반적으로, 이것은 주로 미네랄 오일이 재사용되는 경우 저습도 글로브 박스에서 수행되어야합니다.</li>
	<li>최대 회전 속도 (3200 rpm)에서 10 초 동안 볼텍싱하여 오일을 혼합하고, 혼합물을 지질 인 클로로포름 혼합물을 포함하는 바이알에 첨가하고, 즉시 와류 믹서 상에 놓는다. 최대 회전 속도 (3200 rpm)에서 10-15 초 동안 소용돌이. 생성된 지질-중-유질 혼합은 지질이 오일에 완전히 용해되지 않고 오히려 작은 응집체(24)로서 분산되기 때문에 약간 흐려야 한다.</li>
	<li>지질 중-유 분산액을 80W의 초음파 전력과 40kHz의 작동 주파수로 욕조 초음파 처리기 ( 재료 표 참조)에 넣고 실온에서 30 분 동안 사용하십시오. 혼합물을 즉시 사용하거나 최대 24 시간 동안 4°C에서 보관한다.</li>
</ol>2. 소포 생성
<ol><li>검정색 수지로 만든 3D 프린트 샤프트(보충 파일 1)( 자료 표 참조)를 벤치탑 교반판에 장착하고 회전 속도를 1200rpm으로 설정합니다.</li>
	<li>투명 수지(재료 표 참조)로 만든 3D 프린트된 cDICE 챔버(보충 파일 2)를 샤프트에 장착합니다(그림 1A,B).</li>
	<li>액틴 및 액틴 결합 단백질(ABP) 용액을 20 μL의 총 부피로 별도로 준비한다.<ol>
<li>10% ATTO 488 액틴을 포함하는 구상 액틴 완충액(G-buffer)에서 1-10 μM의 액틴을 제조하였다( 표 참조). 참고: 1x G-완충액은 5 mM의 Tris-HCl, pH 8.0, 및 0.2 mM의CaCl2를 포함한다.</li>
		<li>필라멘트성 액틴 중합 완충액(F-완충액)을 첨가하여 얼음 위에서 액틴 중합을 시작한다. 가교제를 첨가하기 전에 액틴 중합을 늦추기 위해 용액을 얼음 위에 보관하십시오. 참고: 1x F-버퍼는 10mM의 트리스, pH 7.5에서 50mM의 KCl,2mM의 MgCl2 및 3mM의 ATP를 함유한다.</li>
		<li>원하는 몰비로 관심있는 가교제를 첨가하기 전에 얼음 상에서 액틴 중합의 개시를 허용하도록 15분 동안 기다린다. 캡슐화 될 때까지 용액을 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>액틴 결합 단백질(ABPs)을 마이크로튜브에 별도로 준비한다(도 1C). 참고: 이 단계는 ABP(예를 들어, 미오신, α-액티닌, 파신, Arp2/3 복합체)의 조합이 액틴25,26,27로 캡슐화될 때 수행된다. 이러한 경우, 각 ABP의 원하는 양은 재고에서 추출되어 ABP용으로 지정된 마이크로튜브에 추가됩니다. 총 용액이 20 μL가 되어야 하므로, ABPs의 스톡 분취량은 총 ABP 혼합물의 원하는 양이 5-6 μL를 초과하지 않도록 제조되어야 한다. 여기서 대표적인 결과에 사용 된 유일한 ABP는 fascin이며, 그 준비는 아래에 언급되어 있습니다.<ol>
<li>1.75 mg/mL의 파신 스톡으로부터 파신 1.57 μL를 분취하고(표 표 참조), 단계 2.7에서 액틴 용액에 직접 첨가한다. 이것은 용액 중 2.5 μM의 파신에 해당합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>7.5%의 밀도 구배 매질( 표 참조)을 액틴 용액에 첨가하여 GUV 침강을 용이하게 하기 위해 외부와 내부 수성상 사이에 밀도 구배를 생성한다.</li>
	<li>200 mM의 글루코오스의 외부 용액 700 μL를 챔버 내로 분주한다(도 1D, 왼쪽). 참고 : 내부 용액의 삼투압은 포도당의 농도를 결정합니다. 이러한 실험에서 내부 용액의 삼투압은 ~ 200mOsm이므로 200mM 포도당 용액이 외부 용액으로 사용됩니다.</li>
	<li>챔버의 60%-80%가 채워질 때까지 충분한 양의 지질-오일 혼합물(챔버 크기 기준 >3 mL)을 챔버에 첨가한다(그림 1D, 오른쪽). 지질-오일 혼합물과 외부 용액 사이에 계면이 형성될 것이다.</li>
	<li>ABP (단계 2.3.4에서 준비)를 액틴 용액으로 옮깁니다. 규칙적인 100-1000 μL 피펫을 사용하여, 즉시 700 μL의 지질-오일 혼합물을 액틴-ABP 혼합물로 옮긴다(도 1E, 왼쪽). 피펫을 8회 상하로 하여 직경이 7-100 μm 범위인 세포 크기의 지질단층 액적을 생성한다(도 1E, 중간). 참고: 캡슐화하기 전에 actin 네트워크 어셈블리를 피하기 위해 2.7단계를 몇 초 안에 완료해야 합니다. 따라서 단계를 수행하기 전에 피펫 팁이 이미 피펫에 삽입되어 혼합물을 옮길 준비가되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>동일한 100-1000 μL 피펫을 사용하여 즉시 전체 에멀젼을 회전 챔버 내로 분배하십시오. 액적은 오일-외부 용액 계면에서 지질 단일층을 교차시켜 지질의 두 번째 전단지를 획득하고, 이에 따라 GUVs를 형성한다(도 1E, 오른쪽).</li>
	<li>교반 플레이트로부터 챔버를 제거하고, 지질-오일 혼합물의 큰 부분이 챔버의 중앙에 있는 큰 개구로부터 배수되도록 폐기물 용기 내의 챔버를 기울임으로써 대부분의 지질-오일 혼합물을 버린다. 참고: 이런 식으로, 지질-오일 혼합물은 챔버 밖으로 인출되어, 다음 단계에서 지질-오일 혼합물과 외부 용액의 혼합을 피한다.</li>
	<li>뚜껑이 사용자 쪽으로 향하도록 챔버를 잡으십시오. 챔버 뚜껑을 열고 챔버를 사용자 쪽으로 약간 기울입니다. GUVs를 함유하는 외부 용액과 지질-오일 혼합물 사이의 계면은 챔버 개구부(뚜껑이 있는 곳)로부터 볼 수 있다.</li>
	<li>피펫을 사용하여 GUV를 포함하는 충분한 외부 용액을 수집하고 50-300 μL의 외부 용액을 96-웰 플레이트에 분주하여 적절한 밀도의 GUV를 얻습니다. 참고: 이 프로토콜에 따라 챔버 내부의 외부 솔루션에서 총 약 2 x 105개의 GUV가 방출됩니다. GUV 분산도는 정량화되지 않았다; 그러나, GUVs의 약 90%의 직경은 12-30 μm의 범위이다. 7-50 μm의 범위 내의 임의의 직경을 갖는 GUVs는 집단에서 발견될 수 있다. 캡슐화된 밀도 구배 매질, GUV 크기 및 웰 플레이트의 용액 깊이에 따라 GUV가 표면에 정착하는 데 2-15분이 걸립니다. 재구성 된 액틴 번들을 가진 GUV의 수율은 약 90 %입니다.</li>
</ol>3. 이미징 및 3D 이미지 재구성
<ol><li>회전 디스크 (또는 레이저 스캐닝) 공초점 장치, EMCCD 또는 sCMOS 카메라 및 오일 침지 60x 대물 렌즈가 장착 된 반전 현미경 무대에 96 웰 플레이트 를 설치하십시오 (재료 표 참조).</li>
	<li>관심 영역(ROI)에 초점을 맞추고 0.5μm의 z-스텝 간격으로 ROI에서 z-스택 이미지 시퀀스를 가져옵니다. 참고: GUV는 시간이 지남에 따라 표면에서 약간 변위될 수 있기 때문에 여러 형광단이 이미지화되는 경우 각 z-평면에서 다중 파장 이미지 세트를 캡처하는 것이 좋습니다. 즉, 한 번에 각 z-레인에서 561nm 및 488nm 이미지 그룹을 촬영하여 ATTO 488 액틴 및 Rhod PE 이미지를 캡처하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>각 z-스택 이미지 시퀀스를 .tiff 형식으로 저장합니다.</li>
	<li>이미지 처리 소프트웨어(ImageJ/Fiji)에서 관심 있는 이미지 시퀀스를 엽니다. 강도가 가장 높은 이미지를 식별합니다. "ctrl + shift + c"를 눌러 밝기 및 대비 창을 열고 재설정을 클릭하십시오.</li>
	<li>ImageJ/피지 메뉴에서 분석 > 배율 설정 으로 이동하여 각 이미지 픽셀에 대해 알려진 물리적 거리와 해당 단위를 입력합니다.</li>
	<li>ImageJ/피지 메뉴에서 이미지 > 스택 > 3D 프로젝트로 이동하여 z- 스택에서 3D 이미지를 재구성합니다. "투영 방법"을 밝기 포인트로, "슬라이스 간격(μm)"을 0.5로 설정하고 보간을 체크오프합니다. 기본 옵션은 나머지 설정에 사용할 수 있습니다. 참고: 일부 현미경의 z-간격은 보정되지 않을 수 있으며, z 방향의 실제 이동은 입력된 z-간격(즉, 0.5μm)과 약간 다를 수 있습니다. 이러한 경우에, 공지된 직경을 갖는 형광 미소 구체들과 같은 3D 교정 시편이 실제 z-interval을 얻기 위해 사용될 수 있다. 따라서 이 값은 3D 프로젝션의 "슬라이스 간격(μm)"으로 사용됩니다.</li>
</ol>

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<li>Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octanol-assisted+liposome+assembly+on+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Octanol-assisted liposome assembly on chip.</a> Nature Communications. 7, 10447(2016).</li>
<li>Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin-induced+actin+protrusions+are+suppressed+by+dendritic+networks+in+GUVs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs.</a> Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

합성 세포의 생성을 위해 GUVs를 생성하는 다양한 방법이 탐구되었지만, 절차의 복잡성, 캡슐화를 달성하기 위한 연장된 시간, 캡슐화제의 지질 유형 및 분자 구성의 제한, 캡슐화를 용이하게 하기 위한 비생리학적 화학물질에 대한 필요성, 낮은 GUV 수율 및 캡슐화 효율의 불일치는 이 분야의 연구자들에게 계속 도전하고 있다. 상향식 합성 생물학에서 착수할 수 있는 광범위한 잠재적 연구를 고려할 때, 상이한 지질 조성물과 양립가능하고 크기에 관계없이 임의의 분자를 캡슐화할 수 있는 이음새가 없는 고처리량 GUV 캡슐화 접근법은 복잡한 생체모방 합성 시스템을 연구할 수 있는 새로운 기회를 촉발시킬 수 있다. cDICE 방법은 이전의 GUV 생성 방법에 내재된 대부분의 과제와 한계를 제거했습니다.
cDICE 방법을 사용하여 GUV를 생성하기 위한 접근법 및 지배 원리는 플랫폼에 선행하며, 반전된 에멀젼 전달(12)과 같은 이전 기술에서 구현되었...

지질 이중층 구획은 밀폐 된 유기 반응 및 막 기반 공정을 연구하기위한 모델 합성 세포 또는 약물 전달 응용 프로그램 1,2에서 캐리어 모듈로 사용됩니다. 정제된 성분을 이용한 상향식 생물학은 단백질과 지질 3,4와 같은 생체분자 사이의 특성과 상호작용을 탐구하기 위해 최소한의 실험 시스템을 필요로 한다. 그러나 현장의 발전과 함께 생물학적 세포의 조건을 더 잘 모방하는보다 복잡한 실험 시스템에 대한 필요성이 증가하고 있습니다. GUVs에서의 캡슐화는 변형가능하고 선택적으로 투과가능한 지질 이중층 및 제한된 반응 공간을 제공함으로써 이러한 세포 유사 특성 중 일부를 제공할 수 있는 실용적인 접근법이다. 특히, 합성 세포의 모델로서 세포골격계의 시험관내 재구성은 막 구획5에 캡슐화함으로써 이익을 얻을 수 있다. 많은 세포골격 단백질은 세포막에 결합하고 상호작용한다. 대부분의 세포골격 어셈블리는 세포 전체에 걸쳐 있는 구조를 형성하기 때문에, 그 형상은 세포 크기의 감금6에 의해 자연적으로 결정된다.
 팽윤7,8, 소형 소포 융합9,10, 에멀젼 전달 11,12, 펄스 젯팅 13, 및 다른 미세유체 접근법(14,15)과 같은 GUV를 생성하기 위해 상이한 방법이 사용된다. 이러한 방법은 여전히 활용되지만 각 방법에는 한계가 있습니다. 따라서, 높은 수율의 GUV 캡슐화를 갖는 견고하고 직접적인 접근법이 매우 바람직하다. GUVs의 형성을 위해 자발적 팽윤 및 전기팽윤과 같은 기술이 널리 채택되었지만, 이들 방법은 주로 특정 지질 조성물(16), 낮은 염 농도 완충제(17), 더 작은 캡슐화제 분자 크기(18)와 양립가능하고, 높은 부피의 캡슐화제를 필요로 한다. 여러 개의 작은 소포를 GUV에 융합시키는 것은 본질적으로 에너지적으로 바람직하지 않으며, 따라서 하전된 지질 조성물(9) 및/또는 펩티드(19) 또는 다른 화학물질과 같은 외부 융합 유도제에서의 특이성을 필요로 한다. 한편, 에멀젼 전달 및 미세유체 방법은 각각18,20개의 이중층 형성 후 계면활성제 및 용매 제거를 통한 액적 안정화를 필요로 할 수 있다. 펄스 분사와 같은 미세유체 기술에서의 실험 셋업 및 장치의 복잡성은 추가적인 도전(21)을 부과한다. cDICE는 에멀젼 전달22,23을 지배하는 유사한 원리로부터 유래된 에멀젼-기반 방법이다. 수용액(outer solution)과 지질-오일 혼합물은 회전하는 원통형 챔버(cDICE chamber)에서 원심력에 의해 층화되어 지질 포화 계면을 형성한다. 회전하는 cDICE 챔버 내로 지질 단층 수성 액적을 떨어뜨리는 것은 액적이 외부 수용액(22,24) 내로 지질-포화 계면을 가로질러감에 따라 이중층의 지퍼링을 초래한다. cDICE 접근 방식은 GUV 캡슐화를 위한 강력한 기술입니다. 제시된 변형 방법에 의해, 상당히 짧은 캡슐화 시간(수 초)을 갖는 cDICE에 대해 전형적인 높은 소포 수율이 달성될 뿐만 아니라, 시간-의존적 과정(예를 들어, 액틴 시토골격 네트워크 형성)의 관찰을 허용하는 GUV 생성 시간이 상당히 감소된다. 이 프로토콜은 GUV 수집 및 이미징까지 처음부터 약 15-20 분이 걸립니다. 여기에서, GUV 생성은 액틴 및 액틴 결합 단백질 (ABPs)을 캡슐화하기 위한 변형된 cDICE를 사용하는 방법을 사용하여 기술된다. 그러나, 제시된 기술은 바이오폴리머의 조립에서부터 무세포 단백질 발현, 막 융합 기반 화물 전달에 이르기까지 광범위한 생물학적 반응 및 막 상호작용을 캡슐화하는데 적용가능하다.

<table><tbody><tr><td>18:1 Liss Rhod PE 클로로포름 내 지질</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810150C</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Optical Btm Pit PolymerBase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>토끼 골격근에서 추출한 Actin</td><td>Cytoskeleton</td><td>AKL99-A</td><td></td></tr><tr><td>ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle</td><td>Hypermol</td><td>8153-01</td><td></td></tr><tr><td>Axygen microtubes (200 &micro; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-262</td><td>ABP 처리용</td></tr><tr><td>검은색 수지</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-GPBK-04</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤(분말)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700100P</td><td></td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>투명 수지</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-GPCL-04</td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 컨포칼 스캐너 유닛</td><td>YOKOGAWA</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>밀도 구배 매체(Optiprep)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름 내 DOPC 지질</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Fascin</td><td>homemade</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>F-buffer</td><td>homemade</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand microtubes (1.5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>FS02 Sonicator</td><td>Fischer Scientific</td><td>FS20</td><td></td></tr><tr><td>G-버퍼</td><td>홈메이드</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마-알드리치</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>iXon X3 카메라</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Acros Organics</td><td>8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX21</td><td></td></tr><tr><td>올림푸스 PlanApo N 60x 오일 현미경 대물렌즈</td><td>Olumpus</td><td>1-U2B933</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>317667</td><td></td></tr></tbody></table>

거대한 unilamellar 소포 안에 재구성 된 세포 골격의 신속한 캡슐화

Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

거대한 unilamellar vesicles (GUVs)는 생물학적 막의 모델로 자주 사용되므로 시험관 내에서 막 관련 세포 과정을 연구하는 데 훌륭한 도구입니다. 최근 몇 년 동안, GUV 내의 캡슐화는 세포 생물학 및 관련 분야의 재구성 실험에 유용한 접근법임이 입증되었습니다. 그것은 기존의 생화학 적 재구성과는 달리 살아있는 세포 내부의 감금 조건을 더 잘 모방합니다. GUV 내부에 캡슐화하는 방법은 구현하기가 쉽지 않은 경우가 많으며 성공률은 실험실마다 크게 다를 수 있습니다. 더 복잡한 단백질 시스템을 캡슐화하는 데 성공한 것으로 입증 된 한 가지 기술을 연속 액적 인터페이스 교차 캡슐화 (cDICE)라고합니다. 여기에서, 높은 캡슐화 효율로 GUVs에 세포골격 단백질을 신속하게 캡슐화하기 위한 cDICE 기반 방법이 제시된다. 이 방법에서, 첫째, 지질-단층 액적은 지질/오일 혼합물에 관심있는 단백질 용액을 유화시킴으로써 생성된다. 회전하는 3D 인쇄 챔버에 첨가 된 후,이 지질 단층 액적은 챔버 내부의 물 / 오일 계면에서 두 번째 지질 단일층을 통과하여 단백질 시스템을 포함하는 GUV를 형성합니다. 이 방법은 GUV 내 캡슐화의 전반적인 절차를 단순화하고 프로세스 속도를 높여 지질 이중층 소포 내부의 네트워크 어셈블리의 동적 진화를 제한하고 관찰 할 수있게합니다. 이 플랫폼은 감금에서 세포 골격 - 막 상호 작용의 역학을 연구하는 데 편리합니다.

현재의 프로토콜을 사용하여 세포골격 GUVs의 성공적인 생성을 입증하기 위해, GUVs에서의 파신-액틴 다발 구조가 재구성되었다. 파신은 뻣뻣한 병렬 정렬된 액틴 다발을 형성하는 액틴 필라멘트의 짧은 가교결합제이며, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질26으로서 대장균으로부터 정제된다. 5 μM의 액틴은 먼저 액틴 중합 완충액 중의 0.53 μM의 ATTO488 액틴 및 7.5%의 밀도 구배 매질을 포함하여 재구성되었다. 파신을 2.5 μM의 농도로 첨가하고 파신-액틴 혼합물을 캡슐화시, GUVs에서 액틴 다발 구조를 형성하였다. 로다민 PE 표지된 GUVs에서 캡슐화된 액틴 다발 구조의 Z-스택 공초점 이미지 서열은 캡슐화 후 1시간 동안 포획되었다(도 2A). 이 프로토콜을 사용하여, 캡슐화된 액틴 가교결합제, α-액티닌 및 파신의 내재적 경쟁 및 분류는, 함께, GUV 크기 의존적 방식으로 상이한 액틴...

이 기사에서는 캡슐화 된 세포 골격 단백질로 거대한 unilamellar 소포를 신속하게 생산하기위한 간단한 방법을 소개합니다. 이 방법은 감금 및 세포골격-막 상호작용에서 세포골격 구조의 상향식 재구성에 유용한 것으로 입증된다.

거대한 Unilamellar 소포 안에 재구성 된 세포 골격의 신속한 캡슐화

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular ...

최근 몇 년 동안, 세포 크기의 지질 이중층 소포 내 캡슐화는 시험관내 재구성 실험에 유용한 방법임이 입증되었다. 우리가 제시하는 방법은 합성 세포 연구에서 세포 골격 재구성에 크게 도움이 될 것입니다. 이 방법을 사용하면 이질적으로 크기가 큰 거대한 unilamellar 소포를 높은 수율로 생성 할 수 있습니다.베시클 생성 시간은 종래의 cDICE 기술에 비해 현저히 감소하였다. 우리는 분자 경로를 검사하기 위해 복잡하고 동시에 발생하는 세포 과정에서 분리 된 무세포 전사 번역 시스템을 캡슐화 할 수 있습니다. 이 방법은 기능적 합성 세포를 만들기 위해 최소한의 프로토 세포를 조립하는 데 사용할 수 있습니다.디올레오일포스포콜린, 콜레스테롤 및 로다민 PE를 15밀리리터 유리 바이알로 옮겨 오일-지질 혼합물 제조를 시작하십시오. 그런 다음 바이알에 클로로포름 0.5 밀리리터를 넣으십시오. 별도의 15 밀리리터 튜브에 7.2 밀리리터의 실리콘 오일과 1.8 밀리리터의 미네랄 오일을 피펫하고 10 초 동안 분당 3, 200 회전의 속도로 볼텍싱하여 오일을 혼합합니다.이어서, 지질 및 클로로포름 혼합물을 함유하는 바이알에 오일 혼합물을 첨가하고, 지질이 오일에 완전히 용해되지 않기 때문에 생성된 지질-중-유내 혼합이 약간 흐려질 때까지 10 내지 15초 동안 분당 3, 200 회전의 속도로 혼합물을 와류시킨다. 다음으로, 실온에서 30 분 동안 80 와트의 초음파 전력과 40 킬로헤르츠의 작동 주파수를 갖는 욕조 초음파 처리기에서 오일 분산액의 지질을 초음파 처리하십시오. 즉시 사용하지 않으면 지질-오일 혼합물을 섭씨 4도에서 24시간 동안 보관한다.소포를 생성하려면 벤치탑 교반판에 장착된 검은색 수지로 만든 3D 프린트 샤프트와 함께 조립품을 분당 1, 200회 회전하는 속도로 사용하십시오. 그런 다음, 투명 수지로 만든 3D 프린팅된 연속 액적 계면 교차 캡슐화 또는 cDICE 챔버를 블랙 수지 샤프트 상에 장착한다. 10%ATO 488 액틴을 포함하는 구상액틴 완충액 또는 G 완충액 중에 1-내지 10-마이크로몰 액틴 용액을 제조한다.액틴 중합을 시작하려면, 얼음 위의 액틴 용액에 필라멘트성 액틴 중합 완충액 또는 F 완충제를 첨가한 다음, 용액을 얼음 위에 유지하여 가교제를 첨가하기 전에 액틴 중합을 늦추십시오. 액틴 결합 단백질 또는 ABPs를 제조하기 위해, 파신 스톡의 밀리리터 당 1.75 밀리그램에서, 분취량 1.57 마이크로리터의 파신을 별도의 마이크로튜브에 넣는다. 다음으로, 액틴 용액에 7.5%의 밀도 구배 매질을 첨가하여 외부와 내부 수성상 사이에 밀도 구배를 만들고 거대한 일라멜라 소포 또는 GUV, 침강을 촉진한다.그런 다음 외부 용액으로 200 밀리몰 포도당 700 마이크로 리터를 챔버 내로 분배하십시오. 챔버의 60% 내지 80%가 채워질 때까지 챔버에 충분한 지질-오일 혼합물을 첨가한다. 지질-오일 혼합물과 외부 용액 사이에 계면이 형성될 것이다.ABPs를 액틴 용액 내로 옮기어 액틴-ABP 혼합물을 준비한다. 이어서, 규칙적인 100-내지 1, 000-마이크로리터 피펫을 사용하여 700 마이크로리터의 지질-오일 혼합물을 액틴-ABP 혼합물 내로 옮긴다. 피펫을 8회 위아래로 피펫하여 직경 7 내지 100 미크론의 세포 크기의 지질 단층 에멀젼 액적을 생성한다.동일한 100 ~ 1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 전체 에멀젼을 회전 챔버에 분배하십시오. 액적은 오일-외부 용액 계면에서 지질 단일층을 횡단하여 지질의 두 번째 전단지를 획득하여 GUVs를 형성합니다. 완료되면, 교반 플레이트로부터 챔버를 제거하고, 챔버를 폐기물 용기 내의 틸팅함으로써 대부분의 지질-오일 혼합물을 버린다.뚜껑이 안쪽을 향하도록 챔버를 잡고 챔버 뚜껑을 열고 챔버를 안쪽으로 약간 기울이십시오. GUVs를 함유하는 외부 용액과 지질-오일 혼합물 사이의 계면은 뚜껑이 위치한 챔버 개구부로부터 볼 수 있을 것이다. 피펫을 사용하여 GUV를 포함하는 충분한 외부 용액을 수집하고 50 ~ 300 마이크로리터의 외부 용액을 96-웰 플레이트에 분배하여 적절한 밀도의 GUV를 얻습니다.GUV를 이미징하려면 오일 침지 60X 대물 렌즈가 장착된 반전 현미경 무대에 96웰 플레이트를 설치하십시오. 이미지 처리 소프트웨어인 ImageJ Fiji에서 관심 있는 이미지 시퀀스를 열고 가장 높은 강도의 이미지를 식별합니다. Control Shift C 키를 누른 채 밝기 및 대비 창을 열고 재설정 탭을 클릭합니다.ImageJ 피지 메뉴에서 분석 및 배율 설정 탭으로 이동하여 각 이미지 픽셀에 대해 알려진 물리적 거리와 단위를 입력합니다. 완료되면 이미지, 스택 및 3D 프로젝트 버튼으로 이동하여 Z 스택에서 3D 이미지를 재구성하십시오. 투영 방법을 밝기 점으로 설정하고 슬라이스 간격을 0.5마이크로미터로 설정한 다음 보간 상자를 선택합니다.나머지 설정에 대해 기본 옵션을 사용하고 이미지를 캡처합니다. 대표적인 이미지는 캡슐화된 파신-액틴 다발을 갖는 로다민 PE 표지된 GUVs의 공초점 이미지를 보여준다. 액틴 결합 단백질을 액틴 용액으로 옮긴 다음, 지질-오일 혼합물을 첨가하고 지질 단층 액적의 생성은 캡슐화 전에 액틴 네트워크의 형성을 피하기 위해 몇 초 안에 일어나야 한다.우리는이 수정 된 cDICE 기술을 사용하여 액틴 네트워크를 구성하는 데 다른 액틴 넷 크로스 링커의 역할을 조사했습니다. 우리는이 방법이 다른 연구자들이 다른 세포 골격 단백질의 조절을 탐구하는 데 도움이 될 것으로 기대합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

여기에서 우리는 소포, 전사 및 번역 기계 캡슐, 단백질 생산의 모니터링 준비를위한 간단한 방법을 설명합니다. 그 결과 세포가없는 시스템은 점점 더 복잡 해지는 세포의 모방을 구축하기 시작 지점으로 사용할 수 있습니다.

휴대 모방 자의 건설을위한 소포는의 셀이없는 전사 및 번역 기계의 캡슐화

전기 주조, 젤 이용한 붓기 - 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 횡단 단백질, KvAP의 재구성은 두 탈수 수분 보충 방법에 대한 설명된다. 두 방법 모두에서, 상기 단백질을 포함하는 작은 소포 단층이어서 형광 현미경 및 패치 클램프 전기 생리학에 의해 연구 할 수 GUVs을 형성하기 위하여 함께 융합된다.

횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

고도로 채워진 마이크로미터 크기의 구성 요소를 포함하는 거대한 소포는 유용한 세포 모델입니다. 유중수(water-in-oil) 에멀젼 원심분리 방법은 캡슐화된 물질로 거대한 소포를 준비하기 위한 간단하고 강력한 도구입니다.

유 중수 에멀젼의 원심 분리에 의해 거 소포 캡슐화 미소 구의 제조

우리는 거대한 소포 (GV) 안쪽에 박테리아의 단세포 배양을 보여줍니다. 세균 세포를 함유하는 GV는 액적 전달 방법에 의해 제조되었고, 세균 성장의 직접적인 관찰을 위해 유리 기판 위에 지지막 에 고정시켰다. 이 접근은 또한 그밖 세포에 적응할 수 있습니다.

거대한 소포 내부의 단세포 수준에서 세균 세포 배양

유기 및 수성 용매의 계면에서 맞춤형 양피 성 엘라스틴과 같은 단백질은 환경 매개 변수에 의해 유발되는 소포, 섬유 및 응고체와 같은 복잡한 상분자 구조로 조립됩니다. 설명된 조립 프로토콜은 튜닝 가능한 특성을 가진 단백질 멤브레인 기반 구획(PMBC)을 생성하여 다양한 화물을 캡슐화할 수 있도록 합니다.

엘라스틴과 같은 단백질을 체외에서 정의된 수분자 구조 및 화물 캡슐화로 조립하도록 지시

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

이 프로토콜은 모델 막 단백질을 지질 이중층으로 합성하고 통합하는 연구를 위해 거대 단층 소포(GUV) 내에 CFE(cell-free expression) 시스템을 캡슐화하는 데 사용되는 역에멀젼 방법을 설명합니다.

Cell-Free Expression System의 캡슐화에 의한 박테리아 글루타메이트 수용체 채널의 재구성

우리는 막 단백질을 재구성하고 효소 및 기타 수용성 구성 요소를 마이크로미터 미만 및 마이크로미터 크기의 지질 소포에 캡슐화하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

나노미터 및 마이크로미터 크기의 소포에서 평형을 벗어난 대사 네트워크 구축

이 기사에서는 내부, 환형 및 외부 영역에서 맞춤형 전기 전도성을 가진 소포 내 소포 구조를 가진 화합물 cGUV(Giant Unilamellar Vesicles)를 준비하는 방법을 제시합니다. 전기형성은 삼투압 충격을 통해 구강세포와 cGUV로 변형되는 간단한 GUV를 합성하여 핵이 있는 세포의 생물물리학을 연구하기 위한 귀중한 모델을 제공합니다.

Synthesis of Compound Giant Unilamellar Vesicles: A Biomimetic Model of Nucleate Cells(복합 거대 단층소포의 합성: 핵세포의 생체 모방 모델)

이 기사에서는 상으로 분리된 거대 소포 내부의 세포골격 네트워크의 간단한 원팟 재구성을 소개합니다. 이 방법은 일반화되어 광범위한 생체 분자의 캡슐화 또는 제한에 적용될 수 있습니다.

시험관 내 상분리된 거대 단일층 소포(GUV) 내부 세포골격 네트워크의 재구성

배우세요 거대한 단층 소포에 세포 골격 단백질을 신속히 캡슐화하는 방법을. 이 기법은 합성 세포 연구에서 세포 골질 재구성과 막 상호작용 연구에 활용됩니다.

거대한 Unilamellar 소포 안에 재구성 된 세포 골격의 신속한 캡슐화

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